专利名称：一种检测利玛原甲藻的方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，具体为检测利玛原甲藻的方法。
背景技术：
现阶段，我国对有害藻类的认识多侧重在浮游藻类，而对底栖藻类的研究工作还处于起始阶段，这就使得在过去的近岸海域生态调查时对底栖藻类鲜有记录。但是，随着我国有毒有害赤潮频发，使得水产品品质受到损害，食品安全问题成为人们首要关心的问题。 由于便于培养及所分泌的毒素易制作成标准品，产毒底栖甲藻利玛原甲藻成为研究人员研究产毒藻类的重点内容。利玛原甲藻常附生于大型海藻、海草、底层沉积物表面，以及珊瑚礁或红树林区域的浮砂碎石上，有着不同于浮游藻类的生态习性。它呈世界性分布，在我国南海海域也有报道。王朝晖等曾于1997年秋至1998年春对广东沿海多次赤潮进行研究时，在珠海附近的米氏裸甲藻(Gymnodinium mikimotoi)赤潮发生区域的底层水样中检测出大量利玛原甲藻，浓度约为800Cells/L。利玛原甲藻能够产生包括OA(Okadaic Acid) 和 DTX-I (Dinophysistoxin-I)等在内的多种腹泻性贝类毒素(Diarrhetic Shellfish Poisoning, DSP)。腹泻性贝类毒素一般以贝类作为载体，被滤食后在贝类体内富集， 再通过食物链传递被人类或动物吸收，直接威胁到人类及动物的健康，甚至生命。相关实验证实，它能致使肠黏膜损伤，在一定程度上促进肿瘤并发。腹泻性贝类毒素同西加鱼毒(Ciguatera Fish Poisoning，CFP)、神经毒性贝类毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning,NSP)等一样，属于聚酮类化合物。这类化合物结构复杂，构型变化较多，主要由聚酮合酶(Polyketide Synthetase,PKS)催化形成。研究发现聚酮合酶以三种基本类型出现，而第一类型(Type I )为多功能酶，由单一蛋白基团及其周围功能区域构成，是目前研究最为深入的类型。但它是否存在于甲藻中还有争议，但依据对聚酮合酶基因的研究来看， 其在一些产DSP毒素的甲藻中被陆续发现，并证实在甲藻体外共生菌体内不存在。本发明是在此基础上，筛选利玛原甲藻中存在的聚酮合酶基因，克隆及测序后，设计特异引物及探针，并连同针对其rDNA ITS(ITSl-5. 8S rRNA_ITS2)序列设计的特异引物和探针，初步建立双TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测方法检测利玛原甲藻。TaqMan探针实时荧光定量PCR技术与常规PCR技术相比存在许多优势，它无需借助凝胶电泳或银染获取检测结果， 可直接通过光电传导系统探测PCR扩增过程中荧光信号的变化得以知晓检测结果；而且， 它较双链DNA内嵌染料(如STOR green)定量PCR技术无法区分特异性和非特异性产物而言，TaqMan探针具有很高的特异性、信噪比，且可以进行多重检测。正是因为以上特点，它已被研究人员用于部分有害藻类的检测中。本发明也是借助该技术，期望以此可以提高对产毒底栖甲藻的实际检测效率和精度，有助于进一步实施在海洋环境中的检测，也为建立早期赤潮预警机制提供必要支持
发明内容
本发明旨在提供一种检测利玛原甲藻的方法，实现定量检测。技术方案为针对利玛原甲藻的聚酮合酶基因PKS及rDNA ITS序列设计特异性引物和I1aqMan探针，利用实时(real-time)PCR方法荧光定量检测。一种检测利玛原甲藻的方法，步骤包括(1)用CTAB改良法提取待测水样中的利玛原甲藻的基因组DNA ；(2)用特异性引物和特异性探针，扩增利玛原甲藻的ITS和PKS序列中的至少一种，采用荧光定量PCR检测方法，对照标准曲线，确定待测水样中玛原甲藻含量；rDNA ITS基因序列的特异性引物为上游cttggaatggcgcaacaagc，下游 aaaccacaagacacgatgaaacg ；艮口 SEQ ID No. 1 禾口 No. 2 ；PKS基因序列的特异性引物为上游atccccagcaacgattattaatgg，下游 tgcgtgaaagcgaagagtcc ；艮口 SEQ ID No. 3 禾口 No. 4 ；rDNA ITS基因序列的TaqMan探针包括以下核苷酸序列ccaaacctgccaccgttcctcgct ；艮口 SEQ ID No. 5 ；PKS基因序列的TaqMan探针包括以下核苷酸序列cggctcgctccaacgcttcccaac ；艮口 SEQ ID No. 6。步骤⑵中PCR扩增的条件为94 96 °C条件下，预变性1. 5 2. 5min ；循环温度，94. 5 95. 50C IOsec,59. 8 60. 5°C 30sec，35 40 次循环。优选的，PKS基因序列的TaqMan探针5’端使用报告染料FAM标记；ITS基因序列的I1aqMan探针5’端使用报告染料HEX标记；PKS基因序列和ITS基因序列的TaqMan探针 3’端用报告染料TAMRA标记。具体的，步骤O)中可以用单重荧光定量PCR检测方法或者双重荧光定量PCR检测方法。双重荧光定量PCR检测方法是将PKS基因序列的特异性引物及TaqMan探针、ITS基因序列的特异性引物及TaqMan探针同时用于扩增和检测模板DNA。单重荧光定量PCR检测方法是将PKS基因序列的特异性引物及TaqMan探针、ITS基因序列的特异性引物及TaqMan 探针分别用于扩增和检测模板DNA。标准曲线的测定构建方法包括以下步骤以对应不同浓度利玛原甲藻的利玛原甲藻基因组DNA为模板，分别加入相应基因序列的特异性引物和TaqMan探针扩增。本发明可用于底栖甲藻利玛原甲藻的定量及赤潮快速预警等领域，克服现有技术中使用单一分子指标时带来的检测误差，通过双基因同时检测以提高准确率。与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果采用TaqMan探针进行荧光定量 PCR检测，针对rDNAITS序列设计的探针P-ITS的5’端使用报告染料FAM标记，针对PKS基因设计的探针P-PKS的5’端使用报告染料HEX标记，这两个TaqMan探针的3’端都以报告染料TAMRA标记。较双链DNA内嵌染料(如STORgreen)法无法区分特异性和非特异性产物而言，TaqMan探针具有很高的特异性、信噪比，且可以进行多重检测；以多个基因作为分子指标，提高了检测精度，操作简便，易于掌握，可快速检测出水体中的利玛原甲藻。并且， rDNA ITS和PKS探针同时检测水环境中的利玛原甲藻时，最低可检测到1个藻细胞，当它们分别进行检测时，最低可检测到0. 1个藻细胞。


图1为rDNA ITS和PKS基因序列扩增产物凝胶电泳检测图谱(A和B分别为rDNA ITS和PKS基因常规PCR扩增的检测结果；C为实施例2特异引物扩增PKS基因和rDNA ITS 的检测结果)图2为TaqMan实时荧光定量PCR的标准曲线。标准曲线以DNA模板对应的藻细胞数为横坐标，以荧光定量PCR扩增曲线对应的CT值为纵坐标，ITS标准曲线方程为y =-3. 085x+36. 84，R2 = 0. 996 ；PKS 标准曲线方程为 y = -3. 075x+33. 59，R2 = 0. 998。图3为双重PCR测试中rDNA ITS基因的扩增曲线。图中显示模板DNA按1 1 1 IO4等五个稀释梯度的扩增曲线，1 IO5稀释组未获得扩增结果。图4为双重PCR测试中I3KS基因的扩增曲线。图中显示模板DNA按1 1 1 IO3 等五个稀释梯度的扩增曲线，1 IO4和1 IO5两个稀释组未获得扩增结果。
具体实施例方式实施例1利玛原甲藻DNA提取从培养瓶中取出适量利玛原甲藻藻液，于显微镜下计数。离心收集2ml对数期藻液，采用CTAB改良法提取DNA 加入0. 7ml CTAB提取液，于65°C条件下温育一小时，后加入0. 4ml酚氯仿 异戊醇(PCI，24 24 1)试剂抽提两次，再加入0.32ml的异丙醇使之沉淀，并用0.5ml 70%乙醇洗涤后，晾干，加入40 μ L超纯水，于_20°C环境中储存。CTAB提取液的组分包括 3% (w/v)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，1% (W/V)Sark0Syl(肌氨酰)，20mmol/L EDTA, 1. 4mol/L NaCl，0. Imol/L Tris-HCl pH 8. 0,1 % (ν/ν) β-mercaptoethano ( β -巯基乙醇)。实施例2引物及I1aqMan探针的设计根据测序获取的rDNAITS和基因信息(常规的扩增引物序列见表1，序列电泳图见图I-A和B)，筛选引物并扩增利玛原甲藻的rDNA ITS和PKS基因，得到604bp和678bp 的序列，经过克隆后测序获取基因信息。表1本实验中用于常规PCR扩增ITS和PKS基因所用引物一览

权利要求
1.一种检测利玛原甲藻的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)用CTAB改良法提取待测水样中的玛原甲藻的基因组DNA；(2)用特异性引物和特异性探针，扩增利玛原甲藻的ITS和PKS序列中的至少一种，采用荧光定量PCR检测方法，对照标准曲线，确定待测水样中玛原甲藻含量；ITS基因序列的特异性引物为上游cttggaatggcgcaacaagc，下游 aaaccacaagacacgatgaaacg ；PKS基因序列的特异性引物为上游atccccagcaacgattattaatgg，下游 tgcgtgaaagcgaagagtcc ；ITS基因序列的TaqMan探针包括以下核苷酸序列ccaaacctgccaccgttcctcgct ；PKS基因序列的TaqMan探针包括以下核苷酸序列cggctcgctccaacgcttcccaac0
2.权利要求1所述检测利玛原甲藻的方法，其特征在于，步骤( 中94 96°C条件下， 预变性 1. 5 2. 5min ；循环温度，94. 5 95. 5°C IOsec,59. 8 60. 5°C 30sec,35 40 次循环。
3.权利要求1所述检测利玛原甲藻的方法，其特征在于，步骤O)中PKS基因序列的 TaqMan探针5’端使用报告染料FAM标记；ITS基因序列的TaqMan探针5’端使用报告染料 HEX标记；PKS基因序列和ITS基因序列的TaqMan探针3’端用报告染料TAMRA标记。
4.权利要求1所述检测利玛原甲藻的方法，其特征在于，步骤(2)中标准曲线的测定构建方法包括以下步骤以对应不同浓度利玛原甲藻的利玛原甲藻基因组DNA为模板，分别加入相应的基因序列的特异性引物和TaqMan探针扩增。
全文摘要
本发明涉及生物检测领域，公开一种检测利玛原甲藻的方法。具体为，针对利玛原甲藻的聚酮合酶基因PKS及rDNA ITS序列设计特异性引物和TaqMan探针，利用实时(real-time)PCR方法荧光定量检测。本方法可用于底栖甲藻利玛原甲藻的定量及赤潮快速预警等领域，提高了检测精度，操作简便，易于掌握，可快速检测出水体中的利玛原甲藻。
文档编号G01N21/64GK102433390SQ20121000513
公开日2012年5月2日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者何培民, 唐晨, 董丽, 贾睿, 饶涛 申请人:上海海洋大学