专利名称：甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒-9078的制作方法
甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒-9078
技术领域：
本发明涉及食品检验测定技术领域，更具体地，本发明涉及甘氨酸测定方法及其试齐U盒。
背景技术：
甘氨酸为非人体必需氨基酸。甘氨酸有独特的甜味，能缓和酸、碱味，掩盖食品中添加糖精的苦味并增强甜味。人体若摄入甘氨酸的量过多，不仅不能被人体吸收利用，而且会打破人体对氨基酸的吸收平衡而影响其它氨基酸的吸收，导致营养失衡而影响健康。甘氨酸不能被人体利用，只能分解转化为热能，这样会增加肝脏负担。而分解产物中的含氮化合物要通过尿液排出体外，又会增加肾脏负担。如果大量、长期食用这类食品，可能造成肝肾损伤。部分含乳饮料企业为提高产品中蛋白质含量，在生产加工中违规使用甘氨酸，对青少年及儿童的正常生长发育很容易带来不利影响。按照我国《食品添加剂使用卫生标准》GB2760规定，甘氨酸在作为食品添加剂只允许在调味剂与豆奶中使用，且最高限量为每公斤1克，但在含乳饮料中不允许使用。

发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种甘氨酸的测定方法。本发明的另一个目的是提供一种甘氨酸测定试剂盒。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明的方法是一种采用间接酶循环扩增法(Indirect Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶(偶)联法(Couple Reaction) 的联用技术，利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处的吸光度变化测定甘氨酸的方法。本发明甘氨酸测定方法的的技术原理是根据下述氰化氢合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙二酸半醛脱氢酶的系列催化反应完成 甘氨酸+2辅酶氰化氢合成酶氰化氢+ 二氧化碳+2还原型辅酶二氧化碳+丙酰辅酶A+还原型铁氧还蛋白2-氧代丁酰合成酶2-氧代丁酸+辅酶A+氧化型铁氧还蛋白辅酶A+3-甲酰乙酸+辅酶丙二酸-半酵脱氢酶二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶本发明的方法利用氰化氢合成酶(hydrogen cyanide synthase ；EC 1.4.99.5) 酶(偶)联2-氧代丁酰合成酶O-oxobutyrate synthase ；EC 1. 2. 7. 2)、丙二酸半醛脱氢 Sl (malonate semialdehyde dehydrogenase ；EC 1. 2. 1. 18) BIiS反应连续监IlJ法。ft化S1 合成酶、2-氧代丁酰合成酶作为作用酶，氰化氢合成酶功能为将甘氨酸酶解产生二氧化碳，2-氧代丁酰合成酶的酶促作用使二氧化碳产生辅酶A ；丙二酸半醛脱氢酶作为循环酶丙二酸半醛脱氢酶再将辅酶A再次变回二氧化碳，使二氧化碳不断地被重复循环利用。丙二酸半醛脱氢酶又作为显色酶，将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在 340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，这样可以通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算甘氨酸的浓度大小。本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种甘氨酸的测定方法。该甘氨酸测定方法的步骤如下A、样品准备A. 1标准样品的制备将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中，再将甘氨酸浓度调整到1毫摩尔/升，得到的溶液作为标准样品；A. 2待测样品的制备待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；A. 3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其甘氨酸浓度为0毫摩尔/升；B、试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、辅酶、氰化氢合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙二酸半醛脱氢酶、还原型铁氧还蛋白、丙酰辅酶A与3-甲酰乙酸，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、 0. l-5mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-lOOmmol/L、l-100mmol/L 与 l-100mmol/L ；C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化；E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)空白样品的吸光度随时间的变化；F、数据处理由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到
甘氨酸的含量
ΔΑ(样品)-ΔΑ (空白)
甘氨酸含量= -又标准浓度(mmol/L)
ΔΑ (标准)-ΔΑ (空白)式中Δ A(样品)表示步骤C)得到的待测样品的吸光度变化；Δ A(空白)表示步骤Ε)得到的空白样品的吸光度变化；Δ A (标准)表示步骤D)标准样品的吸光度变化。根据本发明，在所述的甘氨酸测定方法中，所述的缓冲液应该理解是能够使其测定介质的PH基本保持稳定(一般是6. 5-8. 5)的溶液。如果该pH高于8. 5或pH低于6. 5， 则该测定方法使用的酶的活性达不到预期的活性效果，因此需要添加更多的介质与酶，才有可能达到预期的活性效果。在本发明中，所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液。优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、 磷酸盐缓冲液或“PBS”缓冲液。更优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液或磷酸盐缓冲液。根据本发明，在所述的甘氨酸测定方法中，所述的稳定剂应该理解是一种能保护试剂中的介质(底物)与酶，使其不会随着时间推移而改变其性质，进而失去活性的物质， 它会使得试剂具备很长的活性寿命，通常长达数月，甚至一、二年。如果没有所述的稳定剂， 则试剂的活性在溶液中只能维持数十小时，顶多数天，就会逐渐失去活性而不再具备检测性能。在本发明中，所述的稳定剂使用量是0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不够， 则试剂活性的寿命就会缩短；如果所述的稳定剂使用量过高，则会增加成本。在本发明中，所述的稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠的稳定剂。更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油、硫酸铵或双乙酸钠的稳定剂。在本发明中，所述的辅酶是一种或多种选自NADP+、NAD+或thio_NAD+的辅酶。根据一种本发明的优选实施方式，本发明使用全自动生化分析仪测定甘氨酸时， 待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下(参数)自动取样，然后在下述条件下进行测定测定方法为速率法或二点终点法，温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为正反应，延迟时间1/0分钟，检测时间4/5分钟。根据另一种本发明的优选实施方式，本发明使用的试剂溶液配制成如下双剂试剂由所述的缓冲液、稳定剂、辅酶、还原型铁氧还蛋白、丙酰辅酶A与3-甲酰乙酸组成的试剂1 ；由所述的缓冲液、稳定剂、氰化氢合成酶、2-氧代丁酰合成酶与丙二酸半醛脱氢酶组成的试剂2 ；其中辅酶、氰化氢合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙二酸半醛脱氢酶、还原型铁氧还蛋白、丙酰辅酶A、3-甲酰乙酸在试剂1或试剂2中的位置是不限定的。根据另一种本发明的优选实施方式，本发明使用的试剂配制成如下三剂试剂由所述的缓冲液、稳定剂、辅酶、还原型铁氧还蛋白、丙酰辅酶A与3-甲酰乙酸组成的试剂1 ；
由所述的缓冲液、稳定剂、2-氧代丁酰合成酶与丙二酸半醛脱氢酶组成的试剂2 ；
由所述的缓冲液、稳定剂与氰化氢合成酶组成的试剂3 ；
其中辅酶、氰化氢合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙二酸半醛脱氢酶、还原型铁氧还蛋白、丙酰辅酶A、3-甲酰乙画g在试剂1、试剂2或试剂3中的位置是不限定的。
在本发明甘氨酸测定方法中使用的测定仪器可以是紫外/可见光分析仪，例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、天津喀纳斯光学分析仪器有限公司销1S的723可见分光光度计；半自动生化分析仪，例如上海伟思医用设备有限公司的BTS-330半自动生化分析仪；全自动生化分析仪，例如由迈瑞公司以商品名BS-300、奥林帕斯公司以商品名AU400、东芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或贝克曼公司以商品名CX20销售的全自动生化分析仪。
本发明还涉及甘氨·I测定试剂盒。该甘氨酸测定试剂盒由下述粉状试剂组成，在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂
缓冲液20-500mmol/L
稳定剂0.001-7mol/L
辅酶0.l-5mmol/L
氰化氢合成酶1000-80000U/L
2-氧代丁酰合成酶1000-80000U/L
丙二酸半醛脱氢酶1000-80000U/L
还原型铁氧还蛋白l-100mmol/L
丙酰辅酶Al-100mmol/L
3-甲酰乙酸l-100mmol/Lo
根据一种本发明的优选实施方式，本发明的甘氨酸测定试剂盒有
试剂1
缓冲液1OOmmo1/L
稳定剂500mmol/L
辅酶1. 25mmol/L
还原型铁氧还蛋白5mmol/L
丙酰辅酶A5mmol/L
3-甲酰乙酸5mmol/L ；
组成如下的试剂2
缓冲液IOOmmo1/L
稳定剂500mmol/L
氰化氢合成酶16000U/L
2-氧代丁酰合成酶18000U/L
丙二酸半醛脱氢酶12000U/L。
根据另一种本发明的优选实施方式，本发明的甘氨酸测定试剂盒有
试剂1
缓冲液IOOmmo1/L
稳定剂500mmol/L
辅酶1. 25mmol/L还原型铁氧还蛋白 5mmol/L丙酰辅酶A 5mmol/L3-甲酰乙酸 5mmol/L ；组成如下的试剂2 缓冲液IOOmmol/L稳定剂500mmol/L2-氧代丁酰合成酶 18000U/L丙二酸半醛脱氢酶 12000U/L ；组成如下的试剂3 缓冲液IOOmmol/L稳定剂500mmol/L氰化氢合成酶 16000U/L。根据另一种本发明的优选实施方式，在本发明的甘氨酸测定试剂盒中，所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液。优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(TriS-HCl)缓冲液、 磷酸盐缓冲液或“PBS”缓冲液。更优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(TriS-HCl)缓冲液或磷酸盐缓冲液。在本发明中，所述的稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、丙二醇、甘油、双乙酸钠或叠氮钠的稳定剂。更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油、硫酸铵或双乙酸钠的稳定剂。在本发明中，无论是单剂试剂、双剂试剂或三剂试剂，在本发明测定甘氨酸的方法中，所述的辅酶可以是一种或多种选自NADP+、NAD+或thio-NAD+的辅酶。使用本发明的甘氨酸测定试剂盒时，可以使用紫外/可见光分析仪，例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、天津喀纳斯光学分析仪器有限公司销售的723可见分光光度计；半自动生化分析仪，例如上海伟思医用设备有限公司的BTS-330半自动生化分析仪；全自动生化分析仪，例如由迈瑞公司以商品名BS-300、奥林帕斯公司以商品名AU400、东芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000 或贝克曼公司以商品名CX20销售的全自动生化分析仪。在采用本发明方法测定甘氨酸时，根据实验要求进行多次试验，然后将得到的这些试验结果按照下式计算出精密度(CV)S= V Σ (X-Xi) 2/η-1式中
云-试验结果平均值；Xi-各次试验結果；Π-试验次数·N彡10CV = S/ X * 100%将得到的这些试验结果按照下式计算出相对极差~ (X + Y + Ζ)+3χ——第一批各次试验结果平均值γ——第二批各次试验结果平均值2—第三批各次试验结果平均值U——为X，Y，Z中的最大值γ——为X，Y，Z中的最小值每批试样数取η彡3经过大量试验确定，对于甘氨酸含量为0-2mmol/L的样品，其分析误差可以达到
く 5%。本发明方法的灵敏度可以达到0. 0001mmol/Lo通过大量试验确定，本发明方法測定甘氨酸含量范围是0-2mmol/L，本发明方法适 合于食品检测。
具体实施方式下述实施例说明本发明而不限制本发明的保护范围。实施例1 牛奶中甘氨酸含量的測定1)标准样品的制备将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中，再将甘氨酸浓度调整到1毫摩尔/升；2)待测样品预处理牛奶样品作为待测样品，无须预处理；3)空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其甘氨酸浓度为0毫摩尔/升；B、试剂溶液的制备本实施例的甘氨酸測定试剂为单剂试剂，它含有三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L甘油lmol/LNADP+0. 75mmol/L氰化氢合成酶16000U/L2-氧代丁酰合成酶18000U/L丙ニ酸半醛脱氢酶12000U/L还原型铁氧还蛋白5mmol/L
丙酰辅酶A3mmol/L3-甲酰乙酸4mmol/L。按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。C、待测牛奶样品，与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/50进行混合，在温度 37°C下反应5分钟，在主波长340nm与副波长405nm下进行测定，测定其吸光度随时间的变化ΔΑ(样品)为0.0667 ；D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤Α)标准样品的吸光度随时间的变化 △ Α (标准)为 0. 2124 ；Ε、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤Α)使用的水作为空白溶液的吸光度随时间的变化八六(空白)为0.0017 ；F、数据处理由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到
甘氨酸的含量
权利要求
1.一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的甘氨酸浓度测定方法，其测定的技术原理是根据下述氰化氢合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙二酸半醛脱氢酶的系列催化反应完成甘氨酸+2辅酶氰化氢合成酶氰化氢+ 二氧化碳+2还原型辅酶二氧化碳+丙酰辅酶A+还原型铁氧还蛋白2-氧代丁酰合成酶2-氧代丁酸+辅酶A+氧化型铁氧还蛋白辅酶A+3-甲酰乙酸+辅酶丙二酸-半酵脱氢酶二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶
2.一种甘氨酸的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下 2. 1样品准备2. 1.1标准样品的制备将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中，再将其浓度调整到1毫摩尔/升； 2. 1.2待测样品的制备待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中； 2. 1.3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其甘氨酸浓度为0毫摩尔/升； 2. 2试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、辅酶、氰化氢合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙二酸半醛脱氢酶、还原型铁氧还蛋白、丙酰辅酶A与3-甲酰乙酸，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、0. l-5mmol/ L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 与 l-100mmol/L ；2. 3待测样品与在步骤2. 2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制，可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；2. 4在与步骤2. 3)同样的条件下测定步骤2. 1. 1)标准样品的吸光度随时间的变化； 2. 5在与步骤2. 3)同样的条件下测定在步骤2. 1. 3)使用的水或缓冲液作为空白溶液的吸光度随时间的变化； 2. 6数据处理由步骤2. 3-2. 5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到甘氨酸的含量
3.根据权利要求1、2所述的测定方法，其特征在于使用全自动生化分析仪测定时，待 测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条 件下进行测定测定方法为速率法，温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副 波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为正反应，延迟时 间1/0分钟，检测时间4/5分钟。
4.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于，所述的稳定剂是一种或多种 选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠、叠氮钠等防腐剂的稳定剂；所述的 缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烧-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸 缓冲液、磷酸氧二钠-梓檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼 砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液；所述的辅酶是一种或多种选自NADP+、 NAD+ 或 thio-NAD+ 的辅酶。
5.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于 5. 1所述的试剂溶液配制成如下单剂试剂它是由所述的缓冲液、稳定剂、辅酶、还原型铁氧还蛋白、丙酰辅酶A、3-甲酰乙酸、氰 化氧合成酶、2-氧代丁酰合成酶与丙二酸半酸脱氧酶组成的； 5. 2所述的试剂溶液配制成如下双剂试剂试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、辅酶、还原型铁氧还蛋白、丙酰辅酶A与3-甲酰 乙酸组成的；试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、氰化氧合成酶、2-氧代丁酰合成酶与丙二酸半 酸脱氧酶组成的；其中辅酶、氰化氧合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙二酸半酸脱氧酶、还原型铁氧还蛋白、 丙酰辅酶A、3-甲酰乙酸在试剂1或试剂2中的位置是不限定的。·5.3所述的试剂配制成如下三剂试剂试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、辅酶、还原型铁氧还蛋白、丙酰辅酶A与3-甲酰 乙酸组成的；试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、2-氧代丁酰合成酶与丙二酸半酸脱氧酶组成的；试剂3，它是由所述的缓冲液、稳定剂与氰化氧合成酶组成的； 其中辅酶、氰化氧合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙二酸半酸脱氧酶、还原型铁氧还蛋白、 丙酰辅酶A、3-甲酰乙酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置是不限定的。
6.一种甘氨酸测定试剂盒，其特征在于·6. 1它由下述粉状试剂组成，在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直 接使用的液体试剂缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L辅酶0. l-5mmol/L氰化氧合成酶1000-80000U/L·2-氧代丁酰合成酶 1000-80000U/L 丙二酸半酸脱氧酶 1000-80000U/L还原型铁氧还蛋白丙酰辅酶A 3-甲酰乙酸l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/Lo6. 2根据权利要求6. 1所述的甘氨酸测定试剂盒，其特征在于它有组成如下的试剂1 缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L辅酶0.l-5mmol/L还原型铁氧还蛋白l-100mmol/L丙酰辅酶Al-100mmol/L3-甲酰乙酸l-100mmol/L ；组成如下的试剂2 缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L氰化氢合成酶1000-80000U/L2-氧代丁酰合成酶1000-80000U/L丙二酸半醛脱氢酶1000-80000U/L。6. 3根据权利要求6.1所述的甘氨酸测定试剂组成如下的试剂1 缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L辅酶0.l-5mmol/L还原型铁氧还蛋白l-100mmol/L丙酰辅酶Al-100mmol/L3-甲酰乙酸l-100mmol/L ；组成如下的试剂2 缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L2-氧代丁酰合成酶1000-80000U/L丙二酸半醛脱氢酶1000-80000U/L ；组成如下的试剂3 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂0.001-7mol/L氰化氢合成酶 1000-80000U/L。
全文摘要
本发明涉及利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的甘氨酸含量的测定方法、试剂的组成及成分，其测定的技术原理是依据氰化氢合成酶、2-氧代丁酰合成酶、丙二酸半醛脱氢酶的系列催化反应完成，本发明还涉及一种甘氨酸测定试剂盒。本发明的测定方法灵敏度高、误差小，因此本发明的测定方法与试剂盒可以广泛地应用于食品检验。
文档编号G01N21/33GK102297998SQ20101020937
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月23日 优先权日2010年6月23日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司