专利名称：镁(离子)诊断/测定试剂盒及镁(离子)的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种镁(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定镁 (离子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
镁测定方法很多，概括起来有比色法、荧光法、离子层析法，离子选择性
电极法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(MS)、同位素稀释质谱法(ID-MS)等。
镁测定的决定性方法是同位素稀释质谱法，参考方法是原子吸收分光光度 法法。这些方法虽然结果准确，但设备复杂，费用昂贵，不适合常规实验室 和自动分析。
比色法是应用最广泛的方法，包括甲基麝香草酚蓝法(MTB)、达旦黄法、 邻甲酚酞络合酮法(0CPC)、钙镁试剂(Calmagite)法、以及新近报道的2-(8，-羟基喹啉-5，-磺酸-7，-偶氮)-变色酸(8Q5SAC)法。比色法操作简便， 费用低，适合常规实验室应用。但存在试剂空白吸光度高，胆红素和其它阳 离子的干扰，试剂稳定性差及试剂中含有腐蚀性或毒性成分等缺点。
离子选择性电极法可测定生理溶液中镁离子活度。采用中性载体 (ETH7025)液膜离子选择电极测定准确度较高。但还存在钙干扰(生理范围 内)Ca2+最大干扰10%等不足。
离子色谱法测定血清总镁在测定之前需对样本进行预处理，包括酸化稀 释和过滤。Thienpont等使用该法对五种国际标准和技术学会用火焰原子吸收 分光光度法的定值血清进行了分析，结果平均偏差仅为0. 35%，认为离子色谱法可作为总镁测定有价值的参考方法。
Mg2+的酶法测定技术在近几年研究非常活跃，取得较大进展。已应用于Mg2+
测定的酶学方法有①己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；②甘油激酶、 磷酸甘油氧化酶和过氧化物酶偶联法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶 偶联法；④酶联化学发光法；⑤磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶 联法；⑥异柠檬酸脱氢酶法；⑦谷氨酰胺合成酶和乳酸脱氢酶偶联法。酶法 检测镁结果准确，干扰影响小，适合于自动化分析。由于酶试剂不断更新， 使测定快速、灵敏，操作简便，因而具有较好的应用前景。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还 原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定镁 (离子)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的镁(离子) 诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生 化分析仪上进行镁(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可 以得到切实的推广应用。
本发明镁(离子)浓度测定方法原理如下
葡萄糖+腺苷三磷酸己糖激酶/Mg^葡萄糖-6-磷酸+
腺苷二磷酸
腺苷二磷酸+谷氨酰胺+磷酸根谷氨酰胺合成酶腺苷三磷酸
+氨+谷氨酸
谷氨酸+水+辅酶谷氨酸脱氢酶氨离子+酮戊二酸+
还原型辅酶
这种方法应用需要镁离子激活的己糖激酶(hexokinase; EC 2.7丄1; EC2.7丄2)酶(偶)联谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC6.3丄2)、谷氨酸 脱氢酶(Glutamate dehydrogenase; EC 1.4.1.2; EC 1.4.1.3)酶促反应速率比 色法。在镁离子的激活下，己糖激酶酶解腺苷三磷酸反应产生腺苷二磷酸， 再通过(偶)联合谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在 340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nrn处有吸收峰)，从而得 以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度 上升的速度，可以测算镁(离子)的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无 论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明镁(离子)诊断/测定试剂 盒较为理想
缓冲液励mmol/L
稳定剂500 mmol/L
辅酶3 mmol/L
己糖激酶10000 U/L
谷氨酰胺合成酶12000U/L
谷氨酸脱氢酶12000U/L
葡萄糖20 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L
谷氨酰胺3 mmol/L
磷酸根3 mmol/L
本发明的镁(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、己糖激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、谷氨酰胺、磷酸根。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、谷氨酰胺、磷酸根。 试剂2
缓冲液、稳定剂、己糖激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶。 辅酶、己糖激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、 谷氨酰胺、磷酸根在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉 状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、谷氨酰胺、磷酸根。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、己糖激酶。 辅酶、己糖激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、
谷氨酰胺、磷酸根在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以 是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定镁(离子)浓度的方法，其辅酶 可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括:
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100mmol/L
稳定剂500 mmol/L
辅酶3 mmol/L
己糖激酶10000U/L
谷氨酰胺合成酶12000U/L
谷氨酸脱氢酶12000U/L
葡萄糖20 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L
谷氨酰胺3 mmol/L
磷酸根3 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37X:，反应时间10分钟，起始吸光度 《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测镁(离子)样品与试剂 的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左 右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。
实施例二
本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
8稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
葡萄糖 20 mmol/L
腺苷三磷酸 3 mmol/L
谷氨酰胺 3 mmol/L
磷酸根 3 mmol/L 试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
己糖激酶 10000 U/L
谷氨酰胺合成酶 12000 U/L
谷氨酸脱氢酶 12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度
《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测镁(离子)样品与试剂
1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大
约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪
下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大
实施例三
本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括-试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
葡萄糖 20 mmol/L
腺苷三磷酸 3 mmol/L
谷氨酰胺 3 mmol/L
磷酸根 3 mmol/L 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
谷氨酰胺合成酶 12000 U/L
谷氨酸脱氢酶 12000 U/L 试剂3
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
己糖激酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定镁(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时 间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被 测镁(离子)样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方 向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大 小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪
器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.001;吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达6mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.12 ± 0.03 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种酶比色法及酶联法的镁(离子)的浓度测定方法，其方法原理如下葡萄糖+腺苷三磷酸 <u>己糖激酶/Mg</u><u>2+</u> 葡萄糖-6-磷酸+ 腺苷二磷酸腺苷二磷酸+谷氨酰胺+磷酸根 <u>谷氨酰胺合成酶</u> 腺苷三磷酸 +氨+谷氨酸谷氨酸+水+辅酶 <u>谷氨酸脱氢酶</u> 氨离子+酮戊二酸+ 还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出镁(离子)的浓度大小测定结果。
2. —种镁(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20——500 mmol/L稳定剂1——-4000 mmol/L辅酶1—6 mmol/L己糖激酶1000———80000 U/L谷氨酰胺合成酶1000———腸OO U/L谷氨酸脱氢酶1000-——80000 U/L葡萄糖1—50 mmol/L腺苷三磷酸1—50 mmol/L谷氨酰胺1_50 mmol/L磷酸根1—50 mmol/L其中，磷酸根可以用磷酸二氢盐取代。试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、己糖激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、谷氨酰胺、磷酸根组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、辅酶、己糖激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、谷氨酰胺、磷酸根组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、谷氨酰胺、磷酸根组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、己糖激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶组成。辅酶、己糖激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、谷氨酰胺、磷酸根在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、己糖激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、谷氨酰胺、磷酸根组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、谷氨酰胺、磷酸根组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、己糖激酶组成。辅酶、己糖激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、谷氨酰胺、磷酸根在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂l一"4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的镁(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定镁(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、谷氨酰胺、磷酸根、己糖激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464371SQ20071019216
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司