专利名称：光谱定量的自动分析方法
技术领域：
本发明涉及一种光谱定量的自动分析方法，可用于评价仪器对特定样品在给定条件下的定量测量能力，自动确定最佳定量分析参数及其范围，实现最佳效果的样品浓度测量。属于分光光度技术领域。
背景技术：
定量分析是分光光度技术的重要组成之一。其中的一项基本分析内容就是从样品的光谱(吸光度)推算出样品的浓度，其理论基础是比尔定律。
在实际工作中已发展出了多种具体方法，如波长定量、归一化波长定量、面积定量、速度定量等。波长定量是从样品的整个光谱曲线中选出一个波长点，在该波长处，样品的吸光度与浓度有良好的线性关系。这一关系可以用线性拟合确定出来。归一化波长定量先选一个波长点对光谱进行归一化，然后选出另一个波长点作线性拟合。面积定量则要在光谱曲线中选择两个波长点，曲线在这两个波长点之间所围的面积与样品浓度有良好的线性关系。与前三种方法稍有不同，速度定量利用的是样品反应过程中记录下来的吸光度变化速率曲线，在速率曲线上选取一个合适的时间点。在该时间点处，样品的吸光度变化速率与样品的浓度有良好线性关系。这些定量方法中的线性拟合常使用最小二乘法。为了便于说明，将这些方法中的吸光度、吸光度曲线的面积和吸光度变化速率都称为光度量，而将这些方法使用时所选的波长点或时间点称为定量参数。这样，波长定量和速度定量法都只有一个定量参数，而归一化波长定量和面积定量法需确定两个定量参数。
在完全理想的情况下，定量参数可以在其允许取值范围内任意选择。但实际测量时，多种因素，如反射光的存在，仪器本身精密度的限制，样品的化学条件等，都会对样品的光度量和浓度之间的线性关系产生不同程度的影响。这样，定量参数取某些值时，光度量与浓度间仍有良好的线性关系，而另一些取值下，不能得到准确的定量结果。因此，选择合适的定量参数是高质量的光谱定量分析的必要步骤。
在传统方法中，定量参数的确定需要繁琐的人工操作。分析人员要反复地尝试选用不同的定量参数，在每一次选择后计算光度量，对光度量和浓度进行拟合，考察其线性程度的优劣。虽然可以利用一些已有的实践经验来帮助选择定量参数，如使用波长定量时，通常会尝试选择样品的某一吸收峰波长进行浓度测量，这仍是一个费时费力的过程。并且，由于工作量的限制，尝试的次数也是有限的，无法保证确定的定量参数总是能达到最佳的定量分析效果。

发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足及实际需要，提供一种光谱定量的自动分析方法，能代替繁琐的人工方法而自动确定定量参数，以实现最佳效果的样品浓度测量。
为实现这样的目的，本发明方法的关键是自动遍历定量参数的所有可能取值。在每一取值下，自动完成光度量计算，使用最小二乘法拟合光度量与样品被测量的线性关系，以最小二乘法的相关系数为指标评判线性程度的优劣，最后给出一个最佳的定量参数以及“相关系数～定量参数关系图”。整个过程可利用计算机自动实现。
本发明的方法包括如下具体步骤1、确定光谱定量分析方法及定量参数。从非归一化波长定量、归一化波长定量、面积定量和速度定量四种定量方法中选择一种用于定量分析，同时也确定了所使用的定量参数。然后进入自动遍历的循环过程。
本发明的方法首先提供四种预设的定量方法，包括非归一化波长定量、归一化波长定量、面积定量和速度定量，可以按需要选择其中的一种。确定定量方法的同时，也就确定了该方法所需的定量参数及其取值范围。非归一化波长定量的定量参数为一个波长点，取值范围是光谱曲线的波长范围。归一化波长定量和面积定量都需两个波长点作为定量参数，取值范围也是光谱曲线的波长范围。速度定量的定量参数是一个时间点，取值范围是样品反应过程的记录时间。
2、进入自动遍历循环后，每一次循环的开始，在定量参数的可能取值范围内自动选择一个尚未尝试过的值作为当前值。自动取值过程是这样的非归一化波长定量和速度定量都只有一个定量参数，取值从允许范围的最小值开始，依次增大。归一化波长定量和面积定量方法都需要两个定量参数，则先选定第一个波长，第一个波长也是从允许范围的最小值开始取值。然后，第二个波长的取值从第一个波长的当前值开始，逐次增大。并且，在第二个波长的可能取值尚未全部尝试之前，第一个波长的值固定不变。
3、定量参数在当前循环中的取值确定后，接着按定量参数的当前值计算光度量。非归一化波长定量的光度量值就是当前波长对应的吸光度值。归一化波长定量先在第一个波长点处对光谱曲线归一化，再取第二个波长处对应的吸光度值(已归一化后的)作为光度量值。面积定量则要计算光谱曲线在当前的两个波长点之间所围的面积，作为光度量的值。速度定量的当前时间点对应的吸光度变化速率就是光度量。
4、光度量计算完成后，用最小二乘法对光度量和样品浓度进行线性拟合，并计算最小二乘法的相关系数。相关系数可以反映拟合的线性程度的优劣。将当前的定量参数以及对应的相关系数都记录下来，并且把当前的相关系数与之前的循环中得到的相关系数比较，找出最大的相关系数记录下来。
5、判断当前的定量参数取值是否已遍历其所有可能取值，若定量参数仍有新的取值可以尝试，则继续循环直到完成整个遍历过程。对于非归一化波长定量，定量参数如已取到了最大的波长点，可结束循环。对于归一化波长定量和面积定量，如果两个波长都已取到最大的波长，表示可以结束循环。而在速度定量中，循环结束的标志是已尝试了最大的时间点。自动遍历结束后，由于步骤4中的工作，将会找到一个最大的相关系数。这个相关系数对应的定量参数值就是该种样品使用该方法时所需的最佳的定量参数。同时，各个定量参数的取值与对应的相关系数也已随着遍历过程，在步骤4中自动记录下来了。
6、显示结果。在完成了步骤5之后，就已得到了一系列的与定量参数的各个取值相对应的相关系数，以及一个最大的相关系数。这个最大的相关系数所对应的定量参数值可以使当前样品的定量分析达到最佳结果。因而，就用这个定量参数对吸光度数据作一次分析，得到的拟合直线以作图的方式显示出来。同时，用相关系数对相应的定量参数取值作图，得到“相关系数～定量参数关系图”。
在“相关系数～定量参数关系图”上，分析人员可以进一步观察定量参数取值对定量分析结果的影响，也可以以此为参考分析某个试验方法或试验设备进行浓度定量测量的效果。
本发明适用于各种可获取连续光谱曲线的光谱类仪器的单组分测量工作。为分光光度分析人员提供了一个快速、简便的方法来确定最佳的定量参数取值，并为评价仪器的测量效果提供辅助的信息。分析人员只需准备一些用于定标的样品溶液进行测量，在得到所有的光谱数据之后使用本方法即可。分析人员可直接使用建议的最佳定量参数，或以“相关系数～定量参数关系图”为参考对定量参数的取值作出针对性的选择和修正，获得最佳的定量分析结果。
本发明用计算机的自动化过程代替人工操作，大大减少了分析时间和工作量，也不易产生疏漏的情况，结果更准确、直观。


图1是本发明方法的流程图。
图2是采用了本发明方法的一台小型超高速紫外可见光谱仪测量到的不同浓度的蛋白质溶液谱线。
图3是分析后得到的“相关系数～波长关系图”。
图4是分析后得到的最佳定量波长处的拟合定量线。
具体实施例方式以下结合附图及具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
本发明的方法流程如图1所示。
如图1所示，本方法的流程分为6个步骤。其中，步骤2、3、4和5构成了本发明关键的自动遍历过程。下面，对6个步骤分别加以简单说明1.选择定量方法。由分析人员在预设的4种方法中选择一种，同时也就确定了方法所需的定量参数类型、数量和取值范围。
2.定量参数自动取值。方法自动为定量参数在允许范围内取值。
3.光度量计算。在定量参数的当前取值下计算光度量。
4.最小二乘拟合，寻找最佳相关系数。用最小二乘法进行线性拟合，同时计算相关系数。记录该相关系数及当前的定量参数值，并找出最大的相关系数。
5.自动遍历控制。控制自动遍历的循环过程何时结束，标准是定量参数已使用了所有可能取值。
6.显示结果。自动遍历结束后，得到了一系列定量参数值和相应的相关系数的记录，以及一个最大的相关系数及对应的定量参数值，也即最佳的定量参数值。用相关系数对定量参数值作图，得到直观的“相关系数～定量参数关系图”。用方法确定的最佳定量参数值对吸光度数据作一次分析，拟合直线也用作图方式显示。
实施例在小型超高速紫外可见光谱仪的光谱分析模块中使用了本发明。对该光谱仪测量得到的浓度为1.000mol/L、0.500mol/L、0.250mol/L、0.125mol/L的蛋白质溶液的光谱数据进行定量分析。四种浓度的蛋白质溶液的光谱图见附图2。
使用本发明的方法在该光谱仪进行蛋白质溶液的非归一化波长定量时，帮助选择定量波长。
实施步骤如下(1)选择定量方法。蛋白质溶液的光谱曲线见图2。因为蛋白质溶液的光谱有明显的吸收峰，基本没有背景吸收，所以选择了非归一化波长定量方法。同时也就确定了定量参数只有一个，类型是波长。它的取值范围从吸光度数据确定，是190nm～820nm之间的2048个波长点；(2)定量参数自动取值。波长从最小的190nm开始取值，逐次增大。如果用波长点的序号表示，就是从1开始，每一次增加1。
(3)光度量计算。非归一化波长定量的光度量就是吸光度值。可以直接从四条蛋白质溶液的光谱上查取当前波长值对应的吸光度值。
(4)线性拟合。光度量计算完成后，得到了四个对应于不同浓度溶液的吸光度值，用最小二乘法将这些吸光度值对样品浓度进行线性拟合，计算相关系数。将相关系数和当前的波长值记录下来，并且寻找出最大的相关系数。相关系数越大，表明用于拟合的数据的线性程度越好，从而定量分析的结果越准确可靠；(5)自动遍历控制。自动遍历控制的目的是使定量参数使用所有可能取值，而没有遗漏。非归一化波长定量的波长取值是从小到大依次进行的，只需判断波长值是否已使用了820nm。如果用波长点序号表示，则检查是否已使用了2048个波长点；(6)显示结果。用步骤4中保存的波长值和相关系数记录作图，得到“相关系数～波长关系图”。找到的最大相关系数对应的波长值，就是用非归一化波长定量方法对蛋白质溶液进行定量分析的最佳波长。在该波长处进行一次定量分析，得到的拟合直线也作图显示。
非归一化定量“相关系数～波长关系图”见图3。从图中看到，220nm～280nm以及370nm～420nm波段有较高的线性程度。与光谱图比较，370nm～420nm波段正是样品吸收峰所在处，这与传统方法常选用吸收峰定量分析是一致的。方法给出的建议最佳定量波长为227nm，该波长处的拟合直线见图4。从图上可以看到，数据点和拟合直线的重合程度非常好，用这个关系进行浓度的定量测量可以得到准确可靠的结果。
由使用结果可见，本发明可以帮助用户快速、方便地完成对样品的定量分析，极大地提高了工作效率。
权利要求
1.一种光谱定量的自动分析方法，其特征在于包括以下步骤1)确定光谱定量分析方法及定量参数从预设的非归一化波长定量、归一化波长定量、面积定量和速度定量四种定量方法中选择一种用于定量分析，非归一化波长定量的定量参数为一个波长点，取值范围是光谱曲线的波长范围，归一化波长定量和面积定量都需两个波长点作为定量参数，取值范围也是光谱曲线的波长范围，速度定量的定量参数是一个时间点，取值范围是样品反应过程的记录时间，然后进入自动遍历的循环过程；2)进入自动遍历循环后，每一次循环的开始，在定量参数的可能取值范围内自动选择一个尚未尝试过的值作为当前值，非归一化波长定量和速度定量的取值从允许范围的最小值开始，依次增大，归一化波长定量和面积定量方法则先选定第一个波长，从允许范围的最小值开始取值，第二个波长的取值从第一个波长的当前值开始，逐次增大，在第二个波长的可能取值尚未全部尝试之前，第一个波长的值固定不变；3)定量参数在当前循环中的取值确定后，按定量参数的当前值计算光度量，非归一化波长定量的光度量值就是当前波长对应的吸光度值，归一化波长定量先在第一个波长点处对光谱曲线归一化，再取第二个波长处对应的已归一化后的吸光度值作为光度量值，面积定量则要计算光谱曲线在当前的两个波长点之间所围的面积作为光度量的值，速度定量的当前时间点对应的吸光度变化速率就是光度量；4)光度量计算完成后，用最小二乘法对光度量和样品浓度进行线性拟合，并计算最小二乘法的相关系数，将当前的定量参数以及对应的相关系数都记录下来，并且把当前的相关系数与之前的循环中得到的相关系数比较，找出最大的相关系数记录下来；5)判断当前的定量参数取值是否已遍历其所有可能取值，若定量参数仍有新的取值可以尝试，则继续循环直到完成整个遍历过程，对于非归一化波长定量，定量参数如已取到了最大的波长点，可结束循环，对于归一化波长定量和面积定量，如果两个波长都已取到最大的波长则可以结束循环，在速度定量中，循环结束的标志是已尝试了最大的时间点；6)自动遍历结束后，将得到的一系列的与定量参数的各个取值相对应的相关系数作图，得到“相关系数～定量参数关系图”，将最大相关系数对应的最佳定量参数对吸光度数据作一次分析，得到的拟合直线以作图的方式显示出来。
全文摘要
一种光谱定量的自动分析方法，先在预设的非归一化波长定量、归一化波长定量、面积定量和速度定量四种定量方法中确定一种所需的光谱定量分析方法及定量参数，然后在自动遍历的循环过程中，按定量参数的当前值计算光度量，用最小二乘法对光度量和样品的被测量进行线性拟合，将当前的定量参数以及对应的相关系数都记录下来，并找出最大的相关系数，自动遍历结束后，得到“相关系数～定量参数关系图”，以及建议的最佳定量参数。本发明为取得最佳的光谱定量分析结果提供了一种自动化的分析方法，可评价仪器对特定样品在给定条件下的定量测量能力，给出最佳定量分析参数及其范围，为分光光度计和光谱仪用户提供参考。
文档编号G01N21/17GK1544917SQ20031010873
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月20日 优先权日2003年11月20日
发明者倪一, 黄梅珍, 袁波, 林峰, 窦晓鸣, 倪 一 申请人:上海交通大学