专利名称：具有增强的免疫球蛋白重链类别转换至Cε的高IgE动物模型的制作方法
技术领域：
本公开涉及重组小鼠和检验过敏反应治疗的方法。背景哮喘是一种令人虚弱的疾病，其影响发达国家人口的1/5。重度哮喘是住院治疗和医疗保健费用的主要原因。在临床实践中，根据通过皮肤点刺试验(prick test, SPT)或体外技术(RAST或ELISA)检测的针对局部空气变应原的循环IgE的存在或缺乏，将哮喘划分为特应性或非特应性。这些IgE抗体与肥大细胞上的高亲和力IgE受体(FceRI)相互作用，这可导致在变应原触发下的速发型超敏反应和疾病的急性恶化。大约1/3的成年哮喘患者被划分为非特应性的。他们倾向于具有更严重的疾病， 经常伴随慢性鼻窦炎，但除了他们缺乏对变应原的急性反应性以外，他们的疾病在临床上是类似的。过敏反应是一种免疫反应，通常是对特定类型的抗原(被称为变应原)的速发型超敏反应类型。这些反应引起过敏症、变应性鼻炎(枯草热)、荨麻疹和变应性哮喘的攻击，并可被普通的变应原例如豚草、花粉、蜜蜂或黄蜂毒、动物皮屑、霉菌或室内尘埃的成分 (例如螨虫)所触发。在哮喘、变应性鼻炎和特应性皮炎之间具有紧密的一致性；这些疾病中的一种的存在在受试者的一生中增加3至30倍另外2种疾病的相对风险。所有3种这些疾病与高水平的非特异性和抗原特异性血清免疫球蛋白E(IgE)相关。在人中，速发型超敏反应(IH)由在皮肤和别处的肥大细胞和嗜碱粒细胞表面所锚定的IgE同种型抗体介导。抗原和这些结合在细胞上的IgE分子的结合触发介体例如组胺从细胞中释放，这些介体引起代表过敏反应的临床现象例如组织肿胀、发痒或支气管平滑肌收缩。特异性针对给定变应原的IgE抗体通过B淋巴细胞在接触了该变应原后产生和分泌。最初，B淋巴细胞(或B细胞)表达IgM同种型抗体，其中每个B细胞固定产生特异性针对特定抗原决定簇的抗体。与具有该抗原决定簇的变应原和T淋巴细胞产生的某些因子二者的接触将诱发B细胞经历所谓的抗体重链类别转换，其中由B细胞产生的抗体的抗原特异性部分保持不变，但其连接至重链(以产生IgE抗体)而不是IgM同种型的μ-重链。这样的类别转换对给定的B细胞显然是永久的，之后其无论何时被刺激以进行分泌时，将分泌特异性针对所述变应原的IgE抗体。在小鼠中的卵清蛋白(OVA)诱发的哮喘是最常使用的人哮喘模型。认为Th2型细胞在OVA诱发的哮喘的发病机理中是关键的。尽管我们知道Th2淋巴细胞在变应性哮喘的开始、发展和持续中发挥重要作用，但有关免疫调节机制仍有许多有待了解。此模型不能模拟和高IgEQiyper IgE)相关的人疾病。已在大动物模型例如猫、狗、猪、绵羊和猴中描述了变应性哮喘模型。在这些物种中，猫科动物是特别引起关注的因为猫自发地产生特发性哮喘。然而，大动物模型很昂贵且费时并仅可使用有限的免疫学和/或分子工具。US 6118044(2000)提供了转基因小鼠，其组成型地表达由转基因编码的抗体类型分子，并且该分子具有IgE重链恒定区并特异性针对预定义的抗原(即TNP)。其对未知或非特异性抗原不提供多克隆应答。目前没有慢性气道疾病的理想模型，因为小鼠缺乏人哮喘的许多关键病理学特征，例如平滑肌的肥大细胞浸润。此外，几乎在所有小鼠中哮喘均在一段时间后自发消退， 因为小鼠不会患哮喘。因此，希望具有允许产生相对天然非人动物的提高的IgE应答的非人动物模型，其中抗体谱是多克隆的。目前，过敏反应的普通治疗包括回避可疑变应原；注射变应原作为免疫疗法以刺激一定的保护性机制并由此最终使宿主对变应原脱敏；药物例如皮质类固醇，其干扰过敏反应介体从肥大细胞释放；和药物例如抗组胺，其阻止释放的介体的生物学作用。然而，没有用于检测过敏反应治疗的理想动物模型，特别是对阻断B细胞中的IgE同种型转换、同时没有不良反应的治疗剂。因此，希望具有能够产生提高的IgE应答的细胞和/或动物。换句话说，希望选择性增强用于IgE产生的链转换重组率。发明概述尽管目前正在进行研究，仍然需要IgE参与哮喘、过敏反应和其他免疫病理学的体内模型，并且所述模型对非特异性抗原(即抗原不是预定义的)提供多克隆应答。也缺乏用于高IgE产生的体内动物模型，其中具有提高的血清IgE应答。本文提供了重组非人动物和使用其的方法，所述动物可用作用于寻找和/或评估抗变应性药物的可靠模型。在免疫球蛋白基因座内具有和野生型(即天然或未修饰的)免疫球蛋白基本上类似、并保留提供响应抗原攻击的免疫球蛋白完整组成成分潜能的基因组结构的动物模型将允许寻找和/或评估抗变应性药物，所述药物抑制B细胞中的IgE同种型转换。本公开提供了用于检测过敏反应治疗的动物模型。所述动物模型提供响应抗原攻击的广泛多样性的抗体产生，产生全部多样性的抗体同种型和具有针对抗原上的表位特异性的全部补体。所述动物模型还提供了进一步理解IgE对过敏反应和哮喘的生理学重要性的手段。在第一个实施方案中提供了靶向载体，其包含a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂/受体)，其选自对应NCBI登录号NT_166318(小家鼠(Mus musculus)染色体12基因组重叠群，品系C57BL/6J)的第 25470628至25468161位核苷酸(SEQ ID NO 5)的至少1500个核苷酸、至少1800个核苷酸、至少2000个核苷酸、至少2200个核苷酸和至少MOO个核苷酸；b)可选择的基因标记；c)期望的/供体DNA序列，其编码供体转换区；和d)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂/受体)，其选自对应 NCBI登录号NT_166318(小家鼠染色体12基因组重叠群，品系C57BL/6J 1)的第254706 至2546816位核苷酸(SEQ ID NO 8)的至少1500个核苷酸、至少1800个核苷酸、至少2000 个核苷酸、至少2200个核苷酸、至少MOO个核苷酸和至少观00个核苷酸。在一个方面靶向载体具有包含SEQ ID NO :4或5的5，臂。在一个实施方案中，5， 臂包含SEQ ID NO :4的第25-2471位残基(包含端点)。在另一个方面，5，臂与内源I ε的 3’和内源Se的5’区同源。在第二个方面，靶向载体具有包含SEQ ID Ν0:7或8的3’臂。 在一个实施方案中，3，臂包含SEQ ID Ν0:7的第2-Μ95位残基(包含端点)。在第三个方面，靶向载体具有可选择的基因标记，其选自新霉素和胸苷激酶。在另一个方面，可选择的基因标记是新霉素。在第四个方面，靶向载体具有两侧为Ioxp位点的可选择的基因标记。 在第五个方面，靶向载体具有选自人和小鼠的期望的转换区。在第六个方面，期望的转换区选自Sy，Sy1，SY^I，SY^*SY3。在第七个方面，期望的转换区是含有小鼠Sμ区的大部分的Hindlll/Nhel片段。在第八个方面，期望的转换区包含NCBI登录号NT_166318 (小家鼠染色体12基因组重叠群，品系C57BL/6J 1)的第25617172至25615761位核苷酸(SEQ ID NO :6)。在第九个方面Sy区包含4. 9 kb NheI-HindIII片段，所述片段从含有分离自 BAC克隆RP23-3ML16的基因组片段的质粒上经亚克隆得到。在第二个实施方案中提供了体外产生改变的胚胎干细胞的方法，其包括以下步骤a)在所述细胞中改变基因组DNA以增强类别转换重组(CSR)的可能性，以表达选自的C εb)通过添加与内源S ε区串联的至少一个另外的S ε拷贝增加S ε长度；c)Se区取代；和d)选择具有正确改变的基因组DNA的细胞。在一个方面，改变是用选自Sy，SY l，SY^i，SY2b和SY3的转换区取代S ε区。 在另一个方面，改变是用Sy区取代S ε区。在另一个方面，改变是用Sm取代任意受体S 区(S γ 1，S γ 2a，S γ 2b 禾口 S γ 3，Sa)或反之亦然。在第三个实施方案中提供了体外产生改变的胚胎干细胞(ESC)的方法，其包括以下步骤a)使用根据权利要求1的载体用Sy交换S ε区b)选择具有正确改变的基因组DNA的细胞。在一个方面，所述方法提供了这样的改变，即用选自Sy，Sy 1，SY 2a，SY 2b禾口 SY3的转换区取代Se区。在另一个方面，所述方法提供了这样的改变，即用Sy区取代 Se区。在另一个方面，所述方法提供了来自选自BALB/c或C57BL/6的小鼠品系的ESC。在第四个实施方案中提供了非人动物，其中a) IgH基因座的至少一个等位基因已被改变，以提高相对未改变的等位基因的 IgE表达/产生/分泌率；和
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b)具有选自下述的I gE谱i.所有血清抗体的IgE部分大于0. 04% ；ii. IgE 血清浓度大于 4，000ng/ml ；iii. IgG/IgE 比例低于 10。在第一个方面，非人哺乳动物具有大于4，000ng/ml，大于10，000ng/ml，大于 15，000ng/ml,大于 30，000ng/ml,大于 90，000ng/ml,大于 10 μ g/ml,大于 20 μ g/ml,大于 30μ g/ml，大于 40 μ g/ml，大于 50 μ g/ml，大于 60 μ g/ml，大于 70 μ g/ml，大于 80 μ g/ml， 大于90 μ g/ml或大于100 μ g/ml的IgE血清水平。在第二个方面，非人哺乳动物具有0. 1 和10之间的IgG/IgE比例。在第三个方面，非人哺乳动物具有100ng/mL和10000ng/mL之间的未攻击的(即静息)IgE血清浓度。在第四个方面，非人哺乳动物具有lOOOng/mL和 lOOOOOOng/mL之间的攻击后的(即激活的或刺激的)IgE血清浓度。在第五个方面，动物模型是非人脊椎动物。在第六个方面，动物模型是小鼠、大鼠、豚鼠、兔或灵长类。在第七个方面，本文描述的非人动物的基因组具有经改变以表达/产生更多IgE的IgH基因座的 Se区。在第八个方面，非人动物/哺乳动物模型具有通过基因打靶实现的改变。在第九个方面，非人哺乳动物具有至少 0. 04%, 0. 1 %, 0. 2%, 0. 3%, 0. 4%, 0. 5%, 0. 6%, 0. 7%, 0. 8%,0. 9%或 1. 0%的 IgE 部分。在第五个实施方案中提供了使用所述动物模型检测过敏反应治疗的方法，其包括在施用所述方法治疗变应性疾病以前、同时或之后使所述动物接触变应原，并评估IgE应答。在所述方法的第一个方面响应抗原攻击的IgE水平低于未经过敏反应治疗的水平。在第二个方面，检测的动物和对照动物是同窝出生仔畜。在第六个实施方案中提供了通过检测过敏反应治疗的方法鉴定的化合物作为药物治疗过敏反应的用途。在第七个实施方案中提供了可从本文描述的动物模型中得到的细胞系。在第八个实施方案中提供了从本文描述的动物模型中分离的细胞。在第九个实施方案中提供了产生非人动物模型的方法，所述方法包括a)将编码SEQ ID N0:6(Sy)的质粒的线性化片段显微注射至小鼠的受精卵中从而使所述片段掺入C ε -编码区的上游基因组DNA并与C ε -编码区有效连接，b)将所述受精卵转移至之前已经处理以诱发假孕的雌性小鼠的输卵管，和c)允许所述卵在所述雌性小鼠的子宫中发育。在第十个实施方案中提供了重组小鼠，在其种系中包含经改造的基因组，其中所述改造包含经改变以提高IgE产生率的IgH基因座的至少一个等位基因。在第一个方面， 重组小鼠具有这样的改变，即其包含用Sy区或其功能性部分替换Se。在第二个方面，S μ 功能性部分的长度在至少11Λ和101Λ之间。通过以下详细说明本发明的其他目的、特征和优势将变得显而易见。然而应当理解，详细说明和特定实施例尽管指示了本发明的优选实施方案，但仅以说明的方式提供，因为通过此详细描述，在本发明范围和精神内的多种改变和修改对本领域技术人员来说将是显而易见的。附图简述

图1是小鼠IgH基因座遗传改变的示意图。㈧在种系构型中直至Cm的可变区的基因组组织结构。(B)V(D) J重组组装功能性编码可变区生成产生低亲和力IgM的B细胞大型库。(C)B细胞活化伴随诱发AID和种系转录导致SHM，其中引入点突变至组装的V区 (星号)。连接在Sm和下游S区(例如Sgl)中AID介导的DSB (闪电符号)以产生新同种型(例如IgGl)的转录物。此外，通过连接间插序列产生被切除的环状片段。图2A展示了用于改造小鼠S ε区的基因打靶策略和重组位点的示意图。在底部显示了 Cre_l0XP重组后靶向的等位基因的结构。指示了限制性酶的切割位点。Rl表示EcoRI 的剪接位点。所有其他限制酶具有其全名。图2B是靶向载体pSW312的示意图。见实施例3。图3是用供体转换区替换S ε区之前和之后的小鼠IgH基因座的总示意图。在此图表中供体转换区是Sy。在上图中是未改造的IgH基因座；下图说明了如本文描述的经改造的IgE基因座。图4Α是未改造的(即野生型)基因组基因座的示意图，并说明了限制位点、探针和转换区的相对位置。黑色框代表5’同源臂。灰色框代表3’同源臂。图4Β是经改造的基因组基因座的示意图并说明了限制位点、探针和用Sm替换k 的转换区的相对位置。黑色框代表5’同源臂。灰色框代表3’同源臂。图4C是证明用S μ替换S ε的Southern印迹。野生型B6样品仅显示了相关大小的一条条带，表明存在单个基因组I ε区时，而靶向的胚胎干细胞样品显示了野生型和靶向的Se区(其中用Sy替换S O，显示为2条具有明显不同的大小的带。这表明成功的打靶和期望转换区的替换。图4D是证明用S μ替换S ε的Southern印迹。当野生型B6样品仅显示了相关大小的一条条带，表明存在单个基因组I ε区时，靶向的胚胎干细胞样品显示了野生型和靶向的S ε区(其中用Sy替换S O，显示为2条具有明显大小差异的带。这表明成功的打靶和期望转换区的替换。图5-11显示了本文描述的核苷酸。核苷酸碱基编码为Α或a是腺嘌呤；C或c是胞嘧啶；G或g是鸟嘌呤；T或t是胸腺嘧啶；M或m是腺嘌呤或胞嘧啶；S或s是胞嘧啶或鸟嘌呤；和N或η是腺嘌呤或胞嘧啶或鸟嘌呤或胸腺嘧啶。图5显示了来自小鼠的2条核苷酸序列。在Sm和k中发现基序GGGCTGGGCTG (SEQ ID NO 1，在图5A中显示)，第二个基序GAGCTGACT在k区中被轻微改造成GAGCTGAGCT (相比Sm基序具有一个添加的G) (SEQ ID NO :2，在图5B中显示)。图6显示了从IgH基因座的BamHI/PVuI片段中缺失的2055bp (SEQ ID NO :3)。图 7 显示了对应 NCBI NT_166318 的第 254706 至 25468161 位核苷酸的 A) SEQ ID NO :4,2471 bp 5，臂(129 小鼠)和 B) SEQ ID N0:5，2467bp 5，臂(C57B1/6J 品系)。图8显示了对应NCBI NT_166318 (小家鼠染色体12基因组重叠群，品系 C57BL/6J)的第25617172至25615761位核苷酸的SEQ ID NO :6 (以大写字母表示) (1141bp)。图 9 显示了对应 NCBI NT_166318 的第 25466106 至 25463273 位核苷酸的 A) SEQ ID NO 7, 3'臂(129 小鼠序列)和 B) SEQ ID NO 8,3'臂(C57B1/6J 序列)。图10 显示了 A) BamHI 上游的 3. 7kb (用于设计 5，探针)(SEQ ID NO 9)和 B) PVUI 至ECORI片段(用于3，探针的设计)(SEQ ID NO 10)。
图11显示了在实施例2中使用的探针。A)SEQ ID NO :11，Ι-mu正向-lQlbp)； 和 B)SEQ ID NO :12, C- ε 反向-1 (30bp) ； C) SEQ ID NO 13，E_mu 正向-2 (20bp) ；D) SEQ ID NO 14, C- ε 反向-2 (30bp) ；Ε) SEQ ID NO 15，正向SM5，(20bp) ；F) SEQ ID NO :16， 9225F(19bp) ；G) SEQ ID NO 17,9518F (26bp)；和 H) SEQ ID NO: 18，反向(30bp)。图12 是从 BAC RP23_i;35L12 Qnvitrogen)恢复的 IgE C57BL/6 基因组序列(用粗体、下划线字体显示待缺失的SE区)(SEQ ID NO 19)。图13A-D总结了在免疫刺激后在野生型(WT)和杂合子(HET)脾细胞中各种免疫球蛋白的细胞内水平的FACS数据。图13A是柱状图，显示对WT和HET动物二者在脂多糖(LPQ刺激后的IgM水平是相同的。图1 是柱状图，显示对WT和HET动物二者在脂多糖(LPQ刺激后的IgG3水平是相同的。图13C是柱状图，显示相比WT，在IL-4组合抗-⑶4(K4/40)刺激后在HET动物中的IgGl水平减少。图13D是柱状图，显示相比WT，在 IL-4组合抗-CD40 (4/40)刺激后在HET动物中的IgE水平增加。图14A-D总结了用于生成在图13中展示的数据的相同的脾细胞的ELISA数据。在刺激后第6天，在ELISA测定中使用用于FACS分析的相同的受激脾细胞(3只Het和3只 WT小鼠)的上清。和我们在FACS分析中观察到的一致，当用IL4/抗-⑶40刺激时，我们也观察到相比WT，在Het中IgE表达水平的增加和IgGl表达水平的减少。这提示在SmKI位点存在更频繁的断裂，其与至IgGl的转换竞争，并增加IgE转换的水平。LPS刺激作为对照，并显示WT和Het 二者具有类似的IgM和IgG3水平，提示当其他转换序列可用于类别转换时，所述基因座是完整的且正常发挥功能。发明详述现在将使用以下定义和实施例仅通过参考的方式详细描述本发明。明确引入本文提及的所有专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的所有序列作为参考。除非在本文中另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与此发明所属领域普通技术人员所通常理解的具有相同的含义。Singleton，等人，Dictiqnaky OF Miceobiology AND Moleculae Biology，第二版，John Wiley and Sons, New York (1994),禾P Hale & Marham, THE Haepee Collins Dict1Omey of Biology,Harper Perennial,NY(1991)为技术人员提供了在此发明中使用的许多术语的一般字典。尽管可使用与本文描述的方法和材料类似或等同的任意方法和材料实践或检验本发明，在此描述了优选的方法和材料。数字范围包括定义范围的数字。除非另外指出，核酸以5’至3’的方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左到右书写。 用于本领域的定义和术语，实践者可特别参照Sambrook等人，1989，和Ausubel FM等人， 1993。应当理解本发明不受限于描述的特定方法、实验方案和试剂，因为这些可以改变。数字范围包括定义范围的数字。除非另外指出，核酸以5’至3’的方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左到右书写，分别地。本文提供的标题不限制本发明的多个方面或实施方案，通过参考说明书整体可领会本发明的多个方面或实施方案。相应地，紧接在下面定义的术语可通过参考说明书整体被更充分地定义。定义提供了新的重组非人宿主，特别是哺乳动物宿主，通常是鼠科动物，其中所述宿主能够对免疫原(又称抗原)发动免疫应答。产生的免疫应答是抗体的完整库，尽管总血清Ig浓度具有提高的IgE成分或部分。“重组的”指动物或细胞的DNA含有基因工程改造。因此，例如，“重组的动物”可为这样的动物，其中至少一部分其细胞含有如本文描述的基因改造。类似地，“重组的细胞” 可为这样的细胞，其中其基因组具有如本文描述的基因改造。“非特异性抗原”指对身体而言是外源的任意物质(如免疫原或半抗原)，其单独引起免疫应答或在与较大的分子(如蛋白质)形成复合物后引起免疫应答，并且能够与免疫应答的产物(如抗体或T细胞)结合。如本文使用的，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类型(例如IgM或 IgG1)。如本文使用的，“同种型转换”指这样的现象，通过这种现象抗体的类型或同种型从一种Ig类型变为另一种Ig类型。如本文使用的，“非转换同种型”指当没有发生同种型转换时产生的重链同种型类型；编码非转换同种型的Ch基因通常是紧邻经功能性重排的VDJ基因下游的第一个Ch基因。如本文使用的，术语“转换序列”指负责转换重组的那些DNA序列。在类别转换重组(CSR)中，“转换供体”序列，通常是μ转换区将位于在转换重组中缺失的区域的5’(即上游)。“转换受体”区将位于待缺失区和替换恒定区(例如Y、ε，等等)之间。因为没有特定的总是发生重组的位点，最终的基因序列通常是不可预测的。本文中转换序列可与转换区互换使用。在本文描述的基因改造的(即重组的)动物中改造转换受体区以增加CSR从而提高血清IgE水平。S区是长度变化很大的大量、重复的内含子序列(在小鼠中从2.0至6. 51Λ范围的重复区)。哺乳动物S区在非模板链上通常富含G并主要由串联重复单元组成，其中某些基序占优势，例如 TGGGG，GGGGT, GGGCT, GAGCT 和 AGCT。如本文使用的术语“重排的”指一种重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中在基本上编码完整Vh或\结构域的构象中，V区段的位置分别紧邻D-J或J区段。可通过与种系DNA的比较鉴定重排的免疫球蛋白基因座；重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源元件。当涉及V区段时如本文使用的术语“未重排的”或“种系构型”指这样的构型，其中V区段没有经过重组以紧邻D或J区段。参见图1。用于核酸，术语“基本同源”表示2种核酸或其指定序列，在最佳比对和比较时， 在合适的核苷酸插入或缺失的情况下，至少约80%的核苷酸，通常至少约90%至95%，和更优选至少约98至99. 5%的核苷酸相同。可选地，当区段在选择性杂交条件下与互补链杂交时为基本同源。核酸可在全细胞中、在细胞裂解物中或以部分纯化或基本纯化的形式存在。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl显带(banding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他方法将核酸从其他细胞成分或其它污染物，例如其他细胞核酸或蛋白质中纯化出来时，核酸是“分离的”或“处于基本纯化的”。见F. Ausubel，等人，编Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York (1987)。
尽管经常是天然序列(除了改造的限制位点等等)，来自cDNA、基因组或混合物的本发明的核酸组合物可被突变，其中依照标准技术提供基因序列。对编码序列，这些突变可如期望地影响氨基酸序列。特别是，考虑与天然V、D、J、恒定、转换序列和其他本文描述的这些序列基本同源的或从其来源的DNA序列(其中“来源的”表示一条序列和另一条序列同一或是从另一条序列改造而来)。当核酸被置于与另一个核酸序列有功能性关系时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则启动子或增强子和编码序列是有效连接的。就转录调控序列而言，有效连接指被连接的DNA序列是连续的，并且当必须连接2个蛋白质编码区时，被连接的DNA序列是连续的且符合读框的。对转换序列，有效连接表示所述序列能够影响转换重组。用抗体库响应外源抗原刺激的非人动物的设计需要动物体内含有的免疫球蛋白基因在整个B细胞发育途径中正确发挥功能。重链基因的正确功能包括同种型转换。因此， 构建本发明的基因以产生同种型转换和以下一种或多种(1)高水平和细胞类型特异性表达，( 功能性基因重排，( 激活和应答等位基因排斥，(4)表达足够的初级库，( 信号转导，(6)体细胞超变，和(7)在免疫应答期间显性化IgE抗体基因座。在小鼠中，以5，-V(D) J-Cμ -C δ -C y 3~C y I-C γ 2b_C γ 2a_C ε -Ca -3'的顺序排列CH基因。CSR在转换⑶区发生，其是在每个CH基因5’的1-至10-千碱基(kb)重复 DNA元件。CSR由Cm上游的S区(Sm)和下游S区之间的重组产生，伴随间插序列的缺失。免疫球蛋白免疫系统通过产生抗体响应外源侵入者(抗原)。抗体是蛋白质分子，其将自身附着至入侵的微生物并将其标记，以将其破坏或阻止其感染细胞。抗体是抗原特异性的。也就是说应答抗原接触而产生的抗体对该抗原是特异性的。哺乳动物产生4种同种型(或类型)的Ig =IgM, IgG，IgE和IgA，分别由μ , Y , ε和α恒定区编码。相关IgG亚型由不同的C Y区编码。每种Ig同种型专门用于抗原去除的特定模式。IgM，由B细胞合成的第一种同种型，激活补体。IgG，在血清中最多的同种型，结合吞噬细胞上的受体。IgG抗体穿过胎盘以提供对胎儿的母体保护。IgA抗体在分泌物中富含，例如眼泪和唾液；其包被入侵的病原体以阻止其增殖。IgE抗体可提供对抗寄生线虫类的保护，但在发达国家它们是坏人它们结合嗜碱粒细胞和肥大细胞，激活组胺释放并导致变应性应答。免疫原(或抗原)可触发抗体应答。对许多不同类型抗原的成功识别和根除需要抗体间的多样性；其氨基酸组成的多变允许其与许多不同抗原相互作用。据预测人产生约 100亿不同的抗体，每种能够结合不同的抗原表位。尽管在单个个体中产生巨大的不同抗体库，但产生这些蛋白质可利用的基因数是有限的。已进化出一些复杂的遗传机制以允许脊椎动物B细胞从相对少数的抗体基因产生多种多样的抗体库。B细胞发育B细胞在其变为成熟的功能细胞前在骨髓和脾中经历了一系列分化关卡。在这些关卡发生例如是否继续分化或经历细胞死亡的决策，并主要围绕免疫球蛋白B细胞受体 (BCR)和其作为抗原结合和信号转导分子发挥功能的能力。最开始的2个这样的关卡是骨髓中的pro-B至pre-B的转变，其中新合成的重(H)链联合替代轻(L)链以形成pre-BCR， 在pre-B至未成熟B细胞的阶段中，H链联合传统L链以形成BCR。不能形成pre-BCR或 BCR的细胞经历凋亡(程序性细胞死亡)，而那些可以形成BCR的细胞继续分化。移动至外周的成熟B细胞可被抗原激活并变成分泌抗体的浆细胞或记忆B细胞，记忆B细胞可更快速地响应第二次抗原接触。当抗原激活的B细胞停止增殖时它们可分化为成熟浆细胞。浆细胞本质上是“抗体工厂(见 Hardy & Hayakawa，B Cell Development Pathways, Annu Rev Immunol. (2001) 19 :595-621.)最初，所有B细胞产生IgM抗体。编码m重链可变区结构域的V、D和J元件的位置和免疫球蛋白重链(IgH)基因座5’末端的编码IgMC区的Cm外显子毗连。在适当的刺激后，B细胞可通过类别转换改变其产生的抗体的同种型，同时保留其抗原特异性。类别转换通过名为类别转换重组(CSR)的机制在重链基因座内发生。此机制依赖在每个恒定区基因(除了 S-链中)上游的DNA中发现的名为转换(S)区的保守核苷酸基序。在此过程中， 基因组DNA被剪接并重新连接以将VDJ元件并置于分别编码IgG、IgE和IgA同种型的、， ε和α链的C区外显子中。此过程导致编码不同同种型抗体的免疫球蛋白基因。S 区在活化的B细胞中表达CY，Ce，和Ca基因的抗体类别转换的分子基础是重组，其将新的Ch基因置于VDJ基因的3’端旁。Ig类别转换重组的表观位点位于S区内，在每个 Ch基因(除了 CJ5’存在的高度重复的DNA序列中。至少部分测序了所有鼠科动物和大部分人的S区。它们的长度是1-101Λ，高度重复和富含GC。鼠科动物和人Sli几乎相同地由2个五聚体序列GAGCT和GGGGT和七聚体序列 (C/T)AGGTTG组成。所有其他S区也含有多拷贝的五聚体序列。除了 Sli,所有鼠科动物S区由序列和长度均不同的串联重复组成，在SyI，Sy 3和Sy 2b中为49bp的重复，在SJa中为 52bp的重复，在Sa中为80bp的重复和在Se中为40bp的重复。在人和鼠科动物中，Sij与Se
区的同源性比Sli与\区更高,SpSe 区彼此间具有相当大的同源性。S区在人和小鼠间足够保守，以致能够使用人S区作为底物用于鼠科动物细胞中的转换重组。在2种物种间SU、SE和Sa区比Sy区更同源。事实上，在k中发现小鼠Sm基序GGGCTGGGCTG(SEQ ID NO 1),第二个基序GAGCTGACT在％区中被轻微改造成GAGCTGAGCT (相比Sm基序具有一个添加的G) (SEQ ID NO 2)。S区的长度经历相当大的等位基因变化(长度多态性)，指示对给定S区的特定大小没有功能上的要求。IgE和血清IgE水平免疫球蛋白E(IgE)是仅在哺乳动物中发现的抗体类型(或免疫球蛋白“同种型”)。其在过敏反应中发挥重要作用，并特别与1型超敏有联系。IgE也与针对大多数寄生虫例如曼森氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni)、旋毛虫(Trichinella spiralis)和肝片吸虫(Fasciola hepatica)的免疫系统应答有关，并可能在对抗某些原生动物寄生虫例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的免疫防御中很重要。尽管IgE通常是最少的同种型——在正常(“非特应性”)个体中，相比10mg/ml 的IgG(在大多数经典适应性免疫应答中起作用的同种型)，血清IgE水平仅为IgE浓度的 0. 05%——其能够触发最强烈的免疫反应。特应性个体在其血液中可具有高达普通IgE水平10倍的IgE (如在高IgE综合征患者中)。可特异性识别“变应原”(通常是蛋白质，例如尘螨DerPlJg i^elDl，草或豚草花粉，等等)的I gE与其高亲和力受体Fc ε RI具有独特的长期相互作用，使能够介导炎症反应的嗜碱粒细胞和肥大细胞变得“待发”，易于释放例如组胺、白三烯和某些白介素的化学物质，这导致许多与过敏反应相关的症状，例如哮喘中的气道收缩，湿疹中的局部炎症，变应性鼻炎中增加的粘液分泌和增加的血管渗透性，表面上这允许其他免疫细胞可以进入组织，但这可导致血压的潜在致命下降，如在过敏反应中。尽管已相当好地了解了每种应答的机制，目前仍不太了解为什么一些变应性患者产生如此剧烈的敏感反应而其他人则仅仅是流鼻涕。总血清IgE浓度检测允许测量在血清样品中的总IgE水平。提高的IgE水平和过敏反应的存在相关。一种检测总血清IgE的方法是raisT(试纸放射免疫吸附试验)。此检测涉及使血清样品与已用放射性碘标记的IgE反应。在试验程序结束时计算的结合的放射性碘，其与血清样品中的总IgE量成比例。在临床免疫学中，通过浊度测定法(或比浊法)测量单个类型免疫球蛋白的水平以表征患者的抗体谱。测量I gE水平的其他方法是ELISA、 免疫荧光、蛋白质印迹、免疫扩散和免疫电泳。认为使用UniCAP 250 系统(Pharmacia， Uppsala, Sweden)测量的总血清IgE浓度大于100kU/L的是提高的。在一例研究中，使用灵敏的双抗体放射免疫测定测量IgE，没有明显变应性症状的正常受试者的血清IgE范围从6至lOOOng/ml变化超过130倍。在患有变应性呼吸疾病的患者中IgE浓度的范围和正常受试者的具有相当程度的重叠，但大约35%的未治疗变应性个体具有高于正常受试者 97百分位的IgE浓度，51%的未治疗变应性个体具有高于正常受试者95百分位的IgE浓度。(见G. J. Gleich, A. K. Averbach禾口H. A. Swedlund,Measurement of IgE in normal and allergic serum by radioimmunoassay. J. Lab. Clin. Med. 77(1971)，p.690.)在另一例研究中，正常成人的IgE水平的几何平均数是105ng/ml并具有5至 2045的95%区间。据报导成人中的IgE正常水平为约100至400ng/ml，是IgG正常水平的 1/400，000。(见 Waldmann 等人，The Journal of Immunology, 1972，109 :304-310 ；又见 Medical Immunology-第十版(2001) TG Parslow, DP Stites, AI Terr 禾口 JB Imboden, 编，表7-2)。用于比较在年轻人04-43岁)、老年人(66-96)和百岁老人(99-108)中的血清 Ig 水平，见 Listi 等人，A Study of Serum Immunoglobulin Levels in Elderly Persons That Provides New Insights into B Celllmmunosenescence. Ann. N. Y. Acad, ki (2006) 1089 :487-495。特别地，正常个体的年龄和性别相关免疫球蛋白血清浓度见 Listi等人(见上)的表2。尽管IgE通常仅占有所有血清抗体的极小部分(0.004% )，从临床观点来看免疫球蛋白E(IgE)极其重要，因为其在变应性疾病的关键地位。在变应性应答中参与2种特化的炎症细胞类型肥大细胞和嗜碱粒细胞携带特异性针对IgE抗体的独特的高亲和力Fc受体。因此，尽管IgE在血液和组织液中具有极低的浓度(约I(T7M)，这些细胞的表面始终具有从血液中吸附的、担当抗原受体的IgE抗体。当肥大细胞或嗜碱粒细胞被动结合的IgE 分子接触抗原时，肥大细胞或嗜碱粒细胞施放引起许多变应性疾病的急性临床表现的炎症介体物质。提高的血清IgE水平也可表示蠕虫或某些其他类型的多细胞寄生虫的感染。和 IgG和IgD—样，IgE仅以单体形式存在。Fc受体似乎主要识别ε链的CH3结构域。见
13Medical Immunology-第十版(2001 ；见上)。尽管在人中免疫球蛋白E的血清浓度多变，但超过约2500ng/ml的血清IgE水平明确地和多种疾病相关。在小鼠中报导了类似的低水平IgE (见Pinaud等人，Localization of the 3' IgH locus Elements that Effect Long-Distance Regulation of Class Switch Recombination, Immunity(2001) 15(2) :187-199) 基因打靶和质粒基因打靶是一种利用改造的外源DNA片段和小鼠胚胎干(ES)细胞基因组之间的同源重组的技术。在引入的DNA片段和天然染色体内含有的相同区域之间的重组将导致染色体的部分被改造的DNA所替换。然后将这些改造的ES细胞注射至胚泡，在那里它们可掺入并和来自ICM(内细胞团)的分裂球一起促进胎儿发育。简单地说，设计基因靶向载体，其通过同源重组将给定基因的野生型等位基因替换为突变形式。然后将靶向的ES细胞植入2-4天的胚泡并转移至假孕母亲(见下)。本文使用的靶向载体具有4种成分a. 5’臂(又称为5’侧翼区)；b.选择标记；c.编码供体转换区的DNA序列；和d.3，臂(又称为3，侧翼区)。5’臂是和待替换的转换区5’末端同源的DNA片段。选择标记在同源重组后赋予可选择的表型。选择标记两侧可为Ioxp位点。供体转换区可在选择标记之前或之后。3’ 臂是和待替换的转换区3’末端同源的DNA片段。5’和3’侧翼区可为任意长度，但取决于同源性的程度。如本文使用的在2个DNA 序列部分之间的“基本同源”指所述序列部分足够同源，从而当DNA片段被共同引入重组感受态细胞中时易于进行可检测的重组。如果2个序列部分的核苷酸序列彼此至少40%，优选至少60%，更优选至少80%和最优选100%同一，则2个序列部分基本同源。这是因为同源性量的减少导致成功同源重组的频率的相应减少。可将序列同源性的实用下限功能性地定义为这样的同源性量，即如果进一步减少则不能在重组感受态哺乳动物细胞中介导可检测的DNA片段同源重组。5’和3’侧翼区的各自同源序列部分为优选至少500bp，更优选 lOOObp，次最优选约1800bp和最优选大于1800bp。理想地，在打靶构建体中使用标记基因替换缺失序列。可使用多种标记，特别是允许正选择的标记。特别引人关注地是使用G418抗性，其来自新霉素磷酸转移酶基因 ("neo")的表达。在基因组中标记基因的存在指示已发生过整合。当S ε区是待替换的区域时，供体转换区可为Sy，S γ 1，S γ h，S γ 2b或S γ 3区。 供体区应当是在受激的未重组条件下(即转换区未被改变)导致其相关的重链以高于Cε 的水平表达的区域。在大多数情况下，将使用通过Southern印迹杂交的DNA分析确定整合的位置。通过使用针对插入物和同源整合将发生的区域两侧的5’和3’区的探针，可以证明同源打靶已发生。也可有利地使用PCR检测同源重组的存在。可使用与打靶构建体内的序列互补的和与位于构建体外且在靶基因座上的序列互补的PCR引物。这样，只有发生了同源重组才可以得到在互补链上存在2条引物的DNA分子。通过证明期望大小的片段，例如使用 Southern印迹分析，支持同源重组的存在。一旦制备了打靶构建体和去除了任意不想要的序列，例如原核序列，现在可将构建体引入靶细胞，例如ES细胞(见下)。可使用任意将DNA引入靶细胞的方便的技术。技术包括原生质体融合，例如酵母原生质球细胞融合，脂质转染，电穿孔，磷酸钙介导的DNA 转移或直接显微注射。在转化或转染了靶细胞后，可通过正和/或负标记的方式选择靶细胞，如上面所示的新霉素抗性和阿昔洛韦或更昔洛韦抗性。然后通过限制性分析、电泳、Southern分析、 PCR等等进一步分析显示期望表型的那些细胞。通过鉴定在靶基因座上显示存在期望改变的片段，可以鉴定已发生同源重组从而以增强至C ε的转换的方式改变IgH的细胞。胚胎干(ES)细胞方法a)引入cDNA至ES细胞在 Teratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, E.J. Robertson编，(IRL Press 1987)中详细描述了培养ES细胞和之后产生重组动物的方法，将DNA引入ES细胞的多种方法例如电穿孔、磷酸钙/DNA沉淀和直接注射，在此处引入其中的教导。通过几种方法之一完成重组ES细胞期望克隆的选择。在涉及序列特异性基因整合的情况下，共沉淀用于重组的具有目的基因的核酸序列或控制其表达的序列和编码标记例如新霉素抗性的基因。通过在Lovell-BadRe,Teratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, E. J. Robertson 编，(IRL Press 1987)或在 Potter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,7161(1984)中详细描述的几种方法之一进行转染。磷酸钙/DNA沉淀、直接注射和电穿孔是优选的方法。在这些程序中，将若干ES细胞，例如 0. 5X106置于组织培养皿中并用线性化的核酸序列和Img pSV2neo DNA(Southern和Berg， J. Mo 1. Appl. Gen. 1 :327-341(1982))的混合物转染，所述混合物在50mg脂转染试剂存在下在100 μ 1终体积中沉淀。用补充了抗生素例如G418 (在200至500 μ g/ml之间)的在DMEM 中含有10%胎牛血清的选择培养基饲养细胞。使用克隆环(cloning ring)分离抗G418的细胞集落并扩增。从抗药克隆中提取DNA并使用Southern印迹实验(使用核酸序列作为探针)鉴定携带期望核酸序列的那些克隆。在一些实验中，使用PCR方法鉴定目的克隆。引入ES细胞的DNA分子也可通过同源重组的方法整合进染色体，如Capecchi， (1989) Science 244 :1观8_1292所述。直接注射导致高效率的整合。通过从注射的ES细胞库制备的DNA的PCR鉴定期望的克隆。在细胞克隆之后通过PCR鉴定库中的阳性细胞 (Zimmer和Bruss，Nature 338,150-153 (1989)) 通过电穿孔的DNA引入效率较低并需要选择步骤。Joyner 等人，Nature 338，153-156 (1989)和 Capecchi，(1989)描述了重组事件的阳性选择(即neo抗性)和双重阳性-阴性选择(即neo抗性和更昔洛韦抗性)和之后通过PCR鉴定期望的克隆的方法，在此处引入其中的教导。B.胚胎回收和ES细胞注射使用改自对小鼠使用的标准技术的方法诱导雌性动物超数排卵，即注射怀孕母马血清促性腺激素(PMSG ；Sigma)和48小时后注射人绒毛膜促性腺激素(hCG ；Sigma)。在hCG 注射后立即将雌性动物和雄性动物置于一起。注射hCG约1天后处死交配过的雌性动物并从切除的输卵管中回收胚胎并置于具有0.5%牛血清白蛋白(BSA;Sigma)的Dulbecco' s磷酸缓冲液中。用透明质酸酶(lmg/ml)去除周围的卵丘细胞。然后洗涤原核胚胎并置于含 0. 5% BSA(EBSS)的Earle平衡盐溶液中，置于具有5% CO2,95%空气的湿润空气的37. 5°C 培养箱中直到注射时。使用与雄性动物交配的自然周期或超数排卵的雌性动物收获胚胎用于ES细胞的注射。在成功交配后回收合适年龄的胚胎。从交配的雌性动物的子宫角中冲洗出胚胎并置于添加10%小牛血清的Dulbecco改良的必需培养基中用于ES细胞的注射。使用内径约 20 μ m的玻璃显微操作针将约10-20个ES细胞注射进胚泡。C.将胚胎转移至假孕雌性动物随机周期的成年雌性动物与输精管被切除的雄性动物交配。这样交配接收者雌性动物使它们在需要植入含有ES细胞的胚泡时处于交配后的2. 5至3. 5天(用于小鼠，或用于较大的动物的话更久)。在胚胎转移时，麻醉接收者雌性动物。通过在输卵管正上方的体壁中制造切口暴露卵巢并取出卵巢和子宫。在子宫角用针穿孔，通过此孔转移胚泡。转移后，将卵巢和子宫推回体内并通过缝合关闭切口。如果要进行另外的转移，则在对侧重复此程序。在 Hogan 等人’ Manipulating the mouse embryo, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1986)中详细描述了操作胚胎和DNA显微注射的方法，在此处弓I入其中的教导。这些技术可容易地应用与其他动物物种的胚胎，并且尽管成功率较低，认为这些技术对本领域技术人员来说是常规操作。D.重组动物的鉴定从幼年动物中取出样品(l-2cm小鼠尾)。对较大的动物可使用血液或其它组织。 为了检测在同源重组实验中的嵌合体，即检查打靶的ES细胞对动物的贡献，在小鼠中使用皮毛颜色，尽管在较大动物中可检查血液。制备DNA并通过Southern印迹和PCR 二者分析以检测重组建立者(rg动物和其后代(F1和rg。一旦鉴定了重组动物，通过常规育种建立品系。Southern 分析通过标准酚提取程序或通过铯梯度离心从细胞系中得到DNA。A.酚提取用HBSS缓冲液洗涤烧瓶中的细胞，然后加入2. 5ml/100cm2的裂解溶液(1%十二烷基磺酸钠/150mM NaCl/10mM EDTA/10mM Tris, pH 7.4)。在所有细胞溶解后，将其转移至50ml圆锥管并加入0. 4mg/ml终浓度的蛋白酶K。将裂解物在65°C孵育10分钟以失活 DNA酶，然后在37°C孵育过夜。对此裂解物加入已在50mM Tris,pH 8. 0中平衡的等体积新鲜酚，在室温(约22-24°C)轻轻地颠倒管5分钟，然后以2000g离心5分钟，将上(水)层转移至第二个管。然后加入等体积的50%酚/50%氯仿(ν/ν)，重复颠倒离心过程。然后将上清转移至第三个管，加入等体积的氯仿。在第三个颠倒离心循环后，将上清转移至第四个管，并加入1/10体积的3Μ醋酸钠，2. 5倍体积的冷乙醇沉淀DNA。在用70%乙醇洗涤得到的沉淀并空气干燥沉淀后，将其在TE缓冲液(IOmM Tris pH 7. 4/lmM EDTA)中重悬，并加入50% μ g/ml终浓度的RNA酶(通过在70°C加入新鲜悬浮的酶30分钟将RNA酶制备成无DNA酶的)。然后用等体积的1 ISS-酚氯仿提取溶液。如上通过离心分离相，并用等体积的氯仿提取上清。如上离心后，用等体积的氯仿提取上清。离心后，用12.5ml乙醇沉淀上清中的DNA，然后用70%乙醇洗涤并空气干燥。然后在TE缓冲液中悬浮沉淀，通过在^OnM处的0. D.读数测定DNA产量和通过沈0/观0比率测定纯度。在4°C下在TE中储存DNA制剂。B.培养细胞的RNA和DNA的氯化铯制备用HBS洗涤烧瓶中的细胞，然后加入2. 5ml/100cm2的异硫氰酸胍(GIT)缓冲液。 异硫氰酸胍缓冲液是4M GIT/25mM醋酸钠，ρΗ6/0.8% β-巯基乙醇(ν/ν)。在3_5分钟轻轻摇晃后，将细胞裂解物置于Beckman SW4 IlOml超速离心管中的細1氯化铯缓冲液的上层。用GIT缓冲液装满管至接近顶端，然后以32，000rpm(174，OOOxg)在200C过夜旋转。然后移出管上部2/3的GIT溶液并丢弃，将管下部1/3的含有DNA的CsCl溶液转移至第二个管。在200 μ 1的0. 3Μ醋酸钠，ρΗ 6中重悬管底部的RNA沉淀并转移至1. 5ml微量离心管中。对此管加入750 μ 1乙醇并将管在干冰上放置10分钟。在微量离心10分钟后，弃上清， 加入300μ1 70%乙醇并再次微量离心管。弃上清，在真空离心机中干燥沉淀。在200μ1 dH20中重悬沉淀。将RNA制剂以乙醇沉淀的形式储存在-70°C。用dH20稀释含有DNA的 4ml CsCl0对此加入30ml冷乙醇。回收DNA沉淀，转移至新的50ml管并用70%乙醇漂洗， 然后空气干燥。然后在I3K缓冲液中重悬沉淀，并加入IOmg蛋白酶K。在65°C孵育15分钟后，在37°C过夜孵育溶液。然后用1 ISS-酚氯仿和随后用氯仿提取水解物，乙醇沉淀， 和定量，如上所述。C.限制性消化、电泳和Southern转移限制性内切酶消化条件根据供应商的建议。对基因组DNA，限制性消化为37°C下 4-6小时。对简单的DNA制剂(克隆的或PCR扩增的)，孵育是在37°C下1-2小时。大体上，在150 μ 1体积中消化10 μ g DNA。通过加入3 μ 15Μ NaCl和375 μ 1 (2. 5倍体积)冷乙醇沉淀消化物，在4°C微量离心10分钟，用500 μ 1冷70%乙醇洗涤并微量离心。在真空微量离心机中空气干燥沉淀并在17 μ 1电泳缓冲液(常规地是TAE缓冲液)和3μ 1凝胶上样缓冲液(含有50%甘油/1%饱和溴酚蓝的TAE缓冲液)中重悬沉淀， 加热至68°C 10分钟，并上样至琼脂糖凝胶的孔中，同时在单独的孔中上样λ-HindIII消化物作为大小标记。凝胶中的琼脂糖浓度为1.0%。在电泳8-16个小时后，用溴化乙锭染色凝胶，测量和记录标记条带的迁移距离并对凝胶拍照。将消化的DNA真空转移至Nytran膜。将凝胶放置在真空装置上的Nytran膜上，用 500ml 0. 4M Na0H/0. 8M NaCl覆盖并使用50cm水的真空压力进行4分钟。移去NaCl-NaOH 溶液，加入500ml IOX SSC，并使用50cm水压进行30-60分钟。然后在80°C烘烤Southern 印迹2小时并在蔬菜冷冻袋中储存。D. Southern 杂交将Southern印迹置于可热密封的塑料袋中并和IOml含有IM NaCl, 1% SDS, 10% 硫酸葡聚糖和200 μ g/ml鲱精DNA的预杂交缓冲液孵育，在65°C孵育15分钟。然后剪掉袋子一角，加入放射性标记的寡核苷酸探针(约107dpm)。重新密封袋并在烘箱或水浴中置于 65°C并轻轻摇晃或摇动12-16小时。然后从袋中移出膜，并在一系列逐渐稀释和温度增高 (严格度增加的)的SSC缓冲液中洗涤直到背景放射性相对特异性结合的探针较低。然后在暗室中将膜放进塑料袋中，并将塑料袋置于装备有增强屏的X射线胶片盒中，加入一张 Kodak XAR-5胶片并根据信号强度将密封的暗盒置于-70°C下不同时间。通常，在不同的时CN 102333874 A
说明书
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期曝光是有效的。在Kodak X-OMAT自动显影剂中冲洗胶片。膜可被重新杂交数次。可通过在沸腾的0. IXSSC中加热2分钟剥离Nytran膜上标记的探针。B细胞培养可通过负选择从脾中纯化B细胞。简单来说，用抗体包被单细胞悬浮物中的T细胞并通过补体裂解消耗。将剩余的脾细胞置于不连续Percoll (GE Healthcare)梯度的上层。可从66%至70%的界面上挑选出静息B细胞和使用全部B细胞(50-70% Percoll界面)。可在由补充10%热失活FBS，100u/ml青霉素和链霉素，2mM L-谷氨酰胺，ImM丙酮酸钠，IOmM Hepes, IOOmM非必需氨基酸和5xl(TsM 2-巯基乙醇的RPMI 1640培养基(Sigma Aldrich)组成的B细胞培养基中培养B细胞。确认体内高IgE的产生将使用本领域已知的技术检测重组动物中提高的IgE血清水平。例如，可使用 ImmunoCAP特异性IgE血液试验(文献中也将其描述为CAP RAST、CAP FEIA (荧光酶免疫测定)和 Pharmacia CAP)。其他方法是本领域已知的。这些方法包括例如酶联免疫吸附测定和可能的FACS， 使用抗IgE抗体。酶联免疫吸附测定，又称ELISA、酶免疫测定或EIA，是主要在免疫学中使用的生化技术，用于检测样品中抗体或抗原的存在。荧光激活的细胞分选(FACS)是分析单细胞的大混合群体的有力技术。较高比例的IgE阳性细胞将指示提高的血清IgE水平。杂交瘤的产生使用本领域已知的标准技术制备产生IgE的杂交瘤。见例如KOhler &Milstein (1975)Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256 :495,禾口K6hler &Milstein (1976)Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion. Eur. J. Immunol. 6 :511。
简单地说，洗涤免疫的脾细胞并在合适条件下与骨髓瘤细胞融合。M小时后使杂交瘤暴露在HAT或其他选择试剂中，未融合的骨髓瘤细胞将死亡。未融合的脾细胞也具有有限的寿命，然后杂交瘤细胞是培养中留下的唯一增殖的细胞。类别转换的测定测定是本领域已知的并在例如Shinkura, R.等人Nat. Immunol. (2003)4,435 441 和 Zarrin，等人，Nat. Immunol. (2004)5,12751281 中描述。简单地说，用抗-CD40 和 IL-40刺激脾细胞4天以产生杂交瘤或刺激6天以进行ELISA。可使用单克隆抗-IgE抗体检测IgE (突变的等位基因)。可通过多克隆抗-I gE抗体(Southern Biotechnology Associates)测量总 IgE0又见例如 Southern 禾口 Berg(Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Appl Genet(1982) 1 :327-341)描述的Southern印迹分析以评估在IgH基因座中的DNA重排和CSR。ε种系转录标记B细胞承担IgE合成的第一步。因此，可使用RT-PCR检查ε 免疫球蛋白重链种系的基因转录物(GLTs ； ε GLTs)，ε环形转录物(CTs ；I ε -C μ CT或 I ε C y CT),和编码IgE重链的mRNA( ε mRNA)和激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)(见I1aWiar 等人，J Allergy Clin Immunol (2007) 119 (1) :213-218)。
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在下面的实施例公开中，使用以下简称eq(当量)；M(摩尔)；μ M(微摩尔)； N(正常)；mol (摩尔)；mmol (毫摩尔)；μ mol (微摩尔)；nmol (纳摩尔)；g (克)；mg (毫克)；kg(千克)；yg(微克)；L(升)；ml(毫升)；μ (微升)；cm(厘米)；mm(毫米)； ym(微米)；nm(纳米)；°C .(摄氏度)；h(小时)；min(分钟)；sec(秒)；msec (毫秒)； Ci (居里)mCi (毫居里)；μ Ci (微居里)；TLC(薄层层析)。
实施例在以下实施例中进一步详细描述本发明，实施例无意在任何方面限制本发明所要求保护的范围。附图旨在被认为是本发明的说明书和描述的组成部分。通过参考其中描述的所有内容明确引入本文引用的所有参考。提供以下实施例以说明而不是限制要求保护的本发明。实施例1基因打靶/突变小鼠的产生此实施例说明了靶向载体的构建，胚胎干细胞(ES)的转化和突变小鼠的产生。a) 一般程序a)胚胎干细胞(EQ的转化基于NCBI中可获得的NT_166318的序列信息设计打靶构建体。(又见Waterston 等人，Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature. (2002)420(6915) :520-62)。从 1 或 C57B6 BAC 克隆上分离并扩增 BamHI/PVuI 片段(7022 bp，具有Se区(129小鼠)；7355 bp具有Se区(B6小鼠))。从BamHI/PVuI片段中缺失以下序列(5’ 一 3’ ；SEQ ID NO 3)并用Neo盒和含有小鼠Sm区大部分的Hindlll/Nhel片段(见图2和SEQ ID NO 6)替换。tgggttaagcagagctgtgctgggctggtatgagctggtccaagttgggc50
taaacagagctgggccaggctagtatgagctggtctgaactacactaagc100
aggactaggctgggctgagctgagctggactggctggacttggctgagat150
gtgttgagctgggttaagtatggctgggctgggctggcctgggctgggct200
ggactggattggtatgagctggtccaagttgggctaagcagagctgggcc250
aggctggtatgagctggtctaaactgaactaagtagggctgggctaagct300
gagctggtctacactagcctgacctgagctagggtaggctggactgggct350
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tgggcttggctgagctgagtcaagatggtctgagttgatttgagttggct850
aagctaagctgagctacactgaactaggcaaggctgggctggaaaggtct900
gggttaagttaggagggacttggcttggcttagctgggccaagctaggct950
gaactgggctgaactgagctgagctgggctgagctgggctgagctgggct1000
gagctgggcaaggctaaactggaatggactgaattggcctaagatgggcc1050
cggctaagctaagtaaggctgccctgaactgagcaggactggcctggcct1100
ggattgacctggcatgagcttaacttgactagactagtctatcttgggtg1150
aactgggctaagcaggactaatctggcctgatctgagctagactgaacta1200
ggctaagctgagctgagtttagcttggctgaactgggctgggctgcactg1250
aactgtattgagctatgtagaactgagctggtcttgtctgaggtgggttg1300
ggctggtctgggctgaaccagattgcactagactgagcttagctggacct1350
ggctgagctggactgcattgtgctaaactggctctctttagaccgagctt1400
agctggactggactgagctaggttgggtgggctgatctaagctgagctag1450
gctggtctcacctgaggaatgctgtgctgtgctgagctgaactaaactga1500
gctcagctaaggaagtgtgagctagactgagctgagctaggctgggttgg1550
gctgaactgagctaccttgggtggactaggctgagctgagctgggttgag1600
ctgagctatagatttggttggactggactggattgggctaaactgaactg1650
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agctaaactaagttgagtggggctaagaggagctgagtgaggctgggctg1750
gaatgagctaggctagggttgtgagctagggttgtactggtctaagctga1800
gtttagctgagagaggctgggctagacttccataaggtggctgagtcata1850
ctacagtgcactgagctgtgttgagcttaacttggattaagtggaatggg1900
ttgagctggctgaactgggctgaactgagataaactagactgagctggga1950
cacgctgggacgagctggaacgagctagaattactgttctaatctgatct2000
gggctgaggtaaactgggcctggttgagctctactaggctaagtagagtt2050
gagct2055可构建靶向129SvEv ES细胞的类似构建体用于提供在IgH基因座中存在的品系等位基因差异。B.胚胎干细胞(EQ的转化使用PvuI限制酶线性化上述质粒。在70%乙醇中洗涤DNA，之后沉淀，在50 μ 1 TE中重悬。使用本领域已知的技术(见例如iTempleton等人，Efficient gene targeting in mouse embryonic stem cells, Gene Therapy (1997)4 :700-709)，通过电穿孔用线性化载体转化IO6 ES细胞并用G418 (400 μ g/ml)选择。然后使用cre/loxP重组系统缺失Neo 基因。通过Southern分析鉴定正确靶向的克隆，使用从鉴定为重组体的构建体(在图2中显示)的SEQ ID N0:9(用于5，探针)和SEQ ID NO :10(用于3，探针)设计的2条至少 300bp的探针。C.产生突变小鼠产生种系小鼠以创造具有改造的IgH基因座的小鼠。将显示Sy/S ε同源重组的 ES细胞克隆注射至C57B6胚泡，然后将得到的雄性嵌合体与C57B6雌性交配。通过皮毛颜色评估在杂合和纯合突变小鼠中的种系转移。
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II.详细程序A.靶向载体构建使用重组和标准分子克隆技术构建靶向ES细胞中的C57BL/6 IgE基因座的构建体。见例如 Liu等人,Ahighly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Research(2003)vol. 13(3)pp. 476-84。基于NCBI中可获得的NT_166318的序列信息设计打靶构建体。(又见Waterston 等人，Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature. (2002)420(6915) :520-62)。首先，从含有C57BL/6转换ε (本文中称为SE、Se或SO区/序列的小鼠 BAC(RP23-135L12 ；Invitrogen,Carlsbad,CA)中分离6988 bp基因组片段(SEQ ID NO 19 ； 图13)，并引入含有负选择标记白喉毒素A(DTA)的名为“pBlight-DTA”的质粒(见Warming 等人，Mol. Cell. Biol. (2006)26(18) :6913-22)中，以用于之后的胚胎干(ES)细胞打靶，得到“pBlight-DTA-IgE”。其次，使用同源重组将loxP-PGK-em7-Neo-BGHpA-loxP-HindIIUalI-AscI-NheI 盒插入IgE片段，将内源S ε区替换为两侧有IoxP位点(floxed)的Neo和多聚接头以用于之后的转换mu区(本文中称为SMu、Sy或Sm)的插入(“pBlight-DTA-IgE-lox-Neo-lo x-MCS，，)。最后，从BAC RP23-135L12 (Invitrogen)分离含有 C57BL/6SMu 的 4. 9kbHindIII-NheI 片段，并使用三向连接(将均来自 pBlight-DTA-IgE-Neo-MCS 的 6. 2kb XhoI-HindIII 片段和 4. Ikb XhoI-NheI 片段连接至 4. 9kbHindIII-NheI Smu 片段)将此片段克隆至 pBlight-DTA-IgE-lox-Neo-lox-MCS。将得到的构建体称为“pSW312”(pBlight_D TA-IgE-lox-neo-lox-Smu)。见图 2B。B.胚胎干细胞(EQ的转化使用标准方法(G418正选择和DTA负选择)打靶C57BL/6ES细胞，使用PCR和 Taqman分析鉴定阳性克隆。通过Southern印迹分析确认正确打靶的克隆，使用HindIII 消化的基因组DNA和外部3’探针(构建体3’末端和内源IgE HindIII位点之间的序列) (SEQ ID NO 20)taatggacgatcgggagataactgatacacttgcacaaactgttctaatc50
aaggaggaaggcaaactagcctctacctgcagtaaactcaacatcactga100
gcagcaatggatgtctgaaagcaccttcacctgcaaggtcacctcccaag150
gcgtagactatttggcccacactcggagatgcccaggtaggtctacactc200
gcctgatgtccagacctcagagtcctgagggaaaggcaggctctcacaca250
gcccttcctccccgacagatcatgagccacggggtgtgattacctacctg300
atcccacccagccccctggacctgtatcaaaacggtgctcccaagctt348C.产生突变小鼠产生种系小鼠以创造具有改造的IgH基因座的小鼠。将显示Sy/S ε同源重组的 ES细胞克隆注射至C57B6胚泡，然后将得到的雄性嵌合体与C57B6雌性交配。通过皮毛颜色评估在杂合和纯合突变小鼠中的种系转移。实施例2
体外刺激(抗-⑶40/IL4 ；LPS)以诱导同种型转换以下实施例详细描述了如何收集B细胞和分析B细胞的类别转换重组(CSR)。用抗CD40 (1 μ g/mL ；HM40-3，Pharmingen)和 IL-4 (25ng/mL)，或脂多糖(LPS, 20yg/mL)体外刺激来自6-8周大的野生型或杂合子动物的脾细胞。在6孔板的一个孔中在补充10%胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100单位/mL青霉素-链霉素和100 μ M β-巯基乙醇的RPMI培养基中接种1. 5χ106细胞(0. 5xl06/mL)。刺激后，在第4_5天使用活化的B细胞培养物产生杂交瘤细胞(使用标准方法；见例如Monoclonal Antibodies =Methods and Protocols in Methods in Molecular Biology U007) vol. 378 :1-13)或通过 ELISA (第 6天)测量Ig水平。使用单克隆抗小鼠抗体(Pharmingen)检测Ig水平，然后用碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgGl (Southern Biotechnology)作为检测抗体。使用纯化的小鼠 Ig(Pharmingen)作为标准物。使用PE抗-小鼠Ig(Pharmingen)抗体在脾细胞上进行表面Ig染色。在刺激后第4天进行FACS分析。在FACS Scan (Becton Dickinson)上收集样品并使用Flojo分析软件分析。通过Southern印迹分析评估CSR。简单地说，使用杂交瘤细胞克隆的基因组DNA 评估IgH基因座中的DNA重排和CSR。用EcoRI (NEB)限制酶过夜消化杂交瘤细胞基因组 DNA(约150ul)并通过在0.7%琼脂糖凝胶上上样样品解析消化物。然后将解析的样品转移至kta-探针印迹膜(Bio-Rad)，通过紫外线交联和/或在80°C真空烘箱中烘烤(20min) 固定，然后用32P标记的I-mu，C-mu, I-ε或C- ε探针根据标准Southern印迹实验方案 (Molecular Cloning,第三版Vol. 1，第6. 33-6. 64页)标记。通过将膜置于X射线胶片 (Kodak)上显像标记的DNA。为了测序在IgE阳性杂交瘤细胞克隆中的S-mu和S- ε CSR连接，使用巢式PCR扩增和测序此区域。首先我们使用I-mu正向-1 :5，-CTCTGGCCCTGCTTATTGTTG-3，(SEQ ID NO 11)和 C- ε 反向-1 :5，-CCTGATAGAGGCTGTGAGAAAGGAAGGACC-3，(SEQ ID NO 12)引物用PCR从基因组杂交瘤细胞DNA中扩增此区域。PCR循环为94°C 2min ； (94°C IOsec, 60°C 30sec和68°C 150sec) X35个循环，68°C 7min。将此PCR步骤的产物用作模板(2ul) 用于第二个 PCR 循环，使用以下引物E-mu 正向-2 :5，-AGACCTGGGAATGTATGGTT-3，(SEQ ID NO 13)禾口 C-ε 反向-2 :5，-TAGGTTAGACTTATTTATATCACTGCATGC-3，(SEQ ID Ν0:14)。 除了退火温度降至55°C以外，PCR程序同上。然后凝胶纯化(Quigen)PCR产物并使用以下引物直接测序正向SM5，5，-GTTGAGAGCCCTAGTAAGCG-3，(SEQ ID NO 15) ；9225F 5，-TTGAGAGCCCTAGTAAGCG-3，(SEQ ID N0:16) ；9518F TGAGCTCAGCTATGCTACGCGTGTTG-3‘( SEQ ID NO 17)；反向5，-GCCCGATTGGCTCTACCTACCCAGTCTGGC-3，(SEQ ID N0:18)。实施例3细胞内I gE染色和FACS分析此实施例展示了在暴露于不同刺激后从杂合小鼠和野生型小鼠得到的组织的细胞内IgE染色和FACS分析。离心0. 5xl06脾细胞并在FACS缓冲液(PBS+0. 5%胎牛血清)中重悬。Wlyg/ 样品加入抗-IgE 抗体(e-Bioscience, San Diego, CA ；货号 14-5992-85)以封闭表面 IgE 分子。细胞在4°C孵育15min，然后用FACS缓冲液洗2次并通过在1700rpm离心3分钟沉淀。在含胎牛血清的PBS中重悬沉淀的细胞。涡旋细胞并以200μ 1/样品加入 BD Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences, San Jose，CA ；货号554722)以固定细胞。在4°C孵育20min。用IXBD Perm/Wash 缓冲液(BD Biosciences, San Diego, CA ；Cat. No. 554723)洗细胞2次，并在250 μ 1含有Fc封闭剂的IX BD Perm/Wash缓冲液中重悬细胞。然后使用细胞等分试样用于生物素-同种型对照(e-Bioscience，13-4301-82)或抗-IgE-生物素 (e-Bioscience，13-5992-82) —同与 B220-FITC 以 1 200 的最终抗体稀释染色。在 4°C 孵育30min。用IXBD Perm/Wash缓冲液洗细胞2次。以1 200稀释加入在IX BD Perm/Wash中的链霉抗生物素。在4°C孵育lOmin。用BD Perm/Wash缓冲液洗2次，并在200 μ 1 FACS缓冲液中重悬细胞，然后使用 BD FACS Calibur设备和CellQuest Pro程序进行FACS分析以分析细胞。结果在图13中显示。在图13中可见，相比WT，IgE阳性染色的细胞数增加。FACS 结果显示，相比WT动物在Het动物中表达IgE的B细胞百分比增加(约2倍)，而相比WT 在Het中的IgGl水平下降了约一半。这证明具有SmKI (替换Se)增加了至IgE的转换，同时通过竞争此基因座降低了转换至IgGl的机会。实施例4IgE测定/测量此实施例展示了使用ELISA(lumineX或常规ELISA)测量在未攻击或攻击的重组动物中或在体外细胞培养物中的IgE。对体外细胞培养物，可使用LPS或抗CD40/IL4刺激细胞。Luminex小鼠7-plex免疫球蛋白同种型分型测定此测定使用多重测定试剂盒(Millipore Beadlyte小鼠免疫球蛋白同种型分型试剂盒，货号48-300)在单个孔中用Luminex 仪器系统对小鼠单克隆细胞培养上清或血清样品(使用Millipore小鼠同种型分型血清稀释液)进行同种型分型(重链IgGl，IgGh， IgG2b，IgG3，IgA, IgE, IgM ；和轻链κ 或 λ )。在使用前，应该以14，OOOXg离心细胞培养上清以去除任意颗粒。类似地，应该在测定前离心(SOOOXg)血清和血浆样品以去除颗粒和脂层。这将避免阻塞洗涤板和样品针。基于小珠的多重测定所使用的材料Millipore Beadlyte小鼠免疫球蛋白同种型分型试剂盒，货号48-300 (包含 Beadlyte细胞因子测定缓冲液，货号43-002，Beadlyte小鼠多重免疫球蛋白小珠，货号 42-045，Beadlyte小鼠免疫球蛋白阳性对照，货号43-008，Beadlyte抗-小鼠κ轻链， PE(100Χ)，货号 44-(^9，Beadlyte 抗-小鼠 λ 轻链，PE(100Χ)，货号 44-0 )。Millipore Beadlyte小鼠同种型分型血清稀释液(5X)，货号43-033，含1 %牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。Ig标准曲线试剂=Millipore =Beadlyte小鼠多重免疫球蛋白标准物(IgGl， IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA, IgE, IgM)，冻干的，来自 balb/c 小鼠，货号 47-300。过滤板MiIlipore多层筛-HA 0. 45um无表面活性剂。
Millipore过滤系统(注意可使用提供ddH20的任意系统)。可根据制造商的说明书进行测定。进行基于小珠的多重测定的一般实验方案(适当地)离心样品以在用合适的稀释液稀释以前沉淀任意颗粒。将标准物在合适的稀释液中重悬，并使用2倍连续稀释制备8点标准曲线。用每孔50-100 μ 1测定稀释液润湿过滤板。板的配备加入50 μ 1标准物或样品至每个孔。超声波处理偶联的小珠15-20s以产生均勻的悬浮物。充分涡旋小珠至少10s。将小珠稀释至每孔1500个珠，并加入25 μ 1 稀释的小珠悬浮物至每孔。黑暗中在室温孵育15min (孵育时间可变换，通常在15min和池之间。可在4°c过夜进行小珠和样品的初步孵育以获得较大的低端灵敏度)。洗涤步骤对过滤板底部应用真空歧管以去除液体并吸干。通过加入75 μ 1测定稀释液洗涤，抽真空并吸干。重复洗2次。在75 μ 1测定稀释液中重悬小珠。加入25μ1检测抗体溶液至各个孔。黑暗中在室温孵育15min。对过滤板底部应用真空歧管以去除液体并吸干。通过加入125 μ 1测定稀释液洗涤，抽真空并吸干。重复洗2次。在125 μ 1测定稀释液中重悬小珠。在平板振动器上孵育lmin。在Luminex 100仪器上读取结果。数据评估从4-PL或5-PL曲线上外推出样品浓度。在刺激后第6天，使用在FACS分析中使用的相同的受激脾细胞(3只Het和3只 WT小鼠)上清用于如上所述的ELISA测定。和我们在FACS分析中观察到的一致，当用IL4/ 抗-⑶40刺激时，我们也观察到相比WT在Het中IgE表达水平的提高和IgGl表达水平的降低。这提示在SmKI位点中发生了更频繁的断裂，其与至IgGl的转换竞争并增加IgE转换的水平。LPS刺激充当对照并显示WT和Het 二者具有类似的IgM和IgG3水平，提示当其他转换序列可用于类别转换时所述基因座是完整的且正常发挥功能。见图14。总小鼠IgE结合ELISA进行此测定以定量未免疫的和免疫动物二者中的小鼠IgE血清水平。i.用捕获抗体包被在包被缓冲液(0. 05M碳酸盐/碳酸氢盐，pH 9. 6)中稀释纯化的抗-小鼠IgE 捕获 mAb (大鼠抗-mu IgE，克隆 R35-92BD Pharmingen, San Diego, CA，储存于 4°C。货号 553416(0. 5mg/ml))至2yg/mla。以每孔100 μ 1加入增强的蛋白质结合ELISA板(例如 Nunc免疫板，货号464718,384孔)。摇晃板以确保捕获抗体溶液覆盖所有孔。将板盖上盖子并在4°c孵育过夜。[注意可以在37°c进行ι小时。]用PBS/Tween (PBS+0.05% Tween 20)洗板3次。每次洗涤时，用200 μ 1 PBS/ Tween 充满孔并在吸去或倾倒前保持至少lmin。在最后一步时将板在纸巾上轻拍以去除多余的缓冲液。ii.封闭用每孔50 μ 1 封闭缓冲液(PBS+0. 5% BSA+IOppm Proclin pH 7. 4)封闭板。将板盖上盖子并在室温孵育ι小时并轻轻振荡。如上用pbs/ Tween 洗板3次。iii.应用标准物和样品将第1列留为空白孔(即不加抗原，每孔仅为25 μ 1封闭缓冲液)。使用第2和3列作为标准物的重复，每孔25 μ 1 用500ug/ml储存标准抗体制备从lOng/ml (1 50，000)起始的标准浓度的标准曲线。进行连续1 2稀释(PBS+0. 5% BSA+0. 05% Tween 20+15ppmProclin+0. 2% BgG+0. 25 % CHAPS+5mM EDTA，pH 7.4)。小鼠 IgE 标准曲线10. 0，5· 0， 2. 50,1.25,0. 625,0. 313，0. 156，0ng/ml。测定对照是如下稀释的小鼠IgEK同种型对照 (BD Bioscience，货号 557079，主要储液0. 5mg/ml，在 4°C保存):8ng/ml, 4ng/ml, 0. 5ng/ ml。使用剩余的列加入在封闭缓冲液中不同稀释的样品，每孔25μ1。用测定稀释液 (PBS+0. 5% BSA+0. 05% Tween 20+15ppm Proclin)以 1 25 的最小初始稀释 1 3 连续稀释血清样品，使用Hamilton稀释器。将板盖上盖子并孵育2小时同时轻轻振荡。[注意可在室温进行至少ι小时或4°c过夜]。如上用PBS/ Tween 洗板6次，然后孵育ι小时同时振荡。IV.与检测抗体孵育每孔加入25 μ 1生物素化的抗-小鼠IgE (大鼠抗-mu IgE-生物素，克隆R35-118， BD Pharmingen, San Diego, CA,0. 5ug/ml，4°C，货号 553419)。将板盖上盖子并在室温孵育30分钟同时轻轻振荡。如上用PBS/ Tween 洗板6 次。V.加入链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(SAv-HRP)在封闭缓冲液中以1 20，000稀释链霉抗生物素-HRP(GE Healthcare，以前的 Amersham Biosciences, Piscataway, NJ，lmg/ml，储存于 4°C,货号 RPN4401)至终浓度 50ng/mL·每孔加入25 μ 1然后孵育30分钟同时振荡。[注意也可使用抗生物素蛋白-HRP 代替链霉抗生物素-HRP，如本领域提到的进行适当修改。]将板盖上盖子并在室温孵育 30min。如此实验方案上面提到的用pbs/ Tween 洗板6次。VI.加入底物和显色混合1 份 TMB A 至 1 份 TMB B (TMB 过氧化物酶溶液 A 和 B (KPL, Gaithersburg, MD, 货号分别是50-76-02和50-65-02)，储存于4°C )。对每孔加入25 μ 1 TMB底物并摇晃。在室温孵育15min用于显色并加入25 μ 1 IM H3PO4淬灭显色。在450_650nm处读板。从标准曲线上插补血清样品IgE水平。实施例5用杂交瘤细胞定量抗体同种型使用本领域已知的技术构建杂交瘤细胞。使用实施例4的测定表征免疫球蛋白同种型。然后进一步表征抗体的结合亲和力、表位特征和在相关途径上的作用模式。实施例6免疫TNP-0VA ；OVA ；Ficol以诱导体内同种型转换此实施例说明了如本文描述的重组动物的体内免疫。通过腹膜内注射在IOOul无菌PBS中的TNP-0VA 50ug/明矾2mg或TNP-Ficoll 50ug腹膜内免疫年龄为8周体重约25-30g的8周大性别匹配的Balb/C小鼠，在第28天加强。在第3，7，14，21，28，35和42天经尾静脉收集60ul样品用于抗体同种型测量，使用在实施例4中描述的测定。ii.抗原诱导的腹膜炎模型和在腹膜液中的组胺测量动物和致敏程序通过皮下(s. c.)注射0. 4ml含有吸附在1. 6mg氢氧化铝(Andersson &Brattsand, 1982)中IOOgLg卵清蛋白的0. 9% w/v NaCl (盐水)主动致敏在巴斯德学院 (Pasteur Institute) (Paris, France)饲养的年龄为 8 周体重约 25_30g 的 Balb/C 小鼠。 7天后，动物接受相同剂量的卵清蛋白(在A1(0H)3存在下)并在7天后使用。抗原诱导的腹膜炎通过腹膜内(i. p.)注射0. 4ml合有在无菌盐水中稀释的2. 5或25gm/ml卵清蛋白溶液(1或IOyg卵清蛋白作为每腔注射的最终剂量)诱导腹膜炎。对照动物接受相同体积的无菌盐水。在抗原攻击后的不同时间间隔(30min-164h)，通过过量乙醚使动物安乐死并打开腹腔，然后用3ml肝素化盐水(10U/ml)洗涤。回收了大约90%的最初体积。在极少的情况下，当在腹腔中发现出血时，使用动物。 使用本领域已知的方法测量组胺水平。实施例7巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)感染诱导 IgE此实施例说明了对寄生虫巴西日圆线虫感染的IgE应答。巴西日圆线虫在小鼠中的发育过程已被良好表征(Love，Nippostrongylus brasiliensis infections in mice :the immunological basis of worm expulstion, (1975)Parasitiology 70 :11)。在小鼠中一旦感染性幼虫(L3)穿透了皮肤，它们经淋巴和血管系统被转运至肺。在气管-食管迁移后，第4阶段幼虫(约15-35%的最初L3剂量) 被运送至小肠腔并成熟。在幼虫接种后第7天感染明显。在感染明显后不久，在粪便卵输出的快速减少后进行幼虫排出(约第9天)，在第12天几乎完成。以前已描述了巴西日圆线虫在实验室条件下的维持，感染方法，幼虫转移和收集幼虫以计数(Love & Ogilvie, Nippostrongylus brasiliensis in young rats. Lymphocytes expel larval infections but not adult worms. (1975)Clin.Exp. Immunol. 21 :155)。从虫载片上纯化活虫。计数纯化的虫并以2500虫/ml在磷酸缓冲液 (PBS)中重悬。通过皮下注射以500虫ΛΟΟιιΙ感染小鼠，如Ogilvie所描述(Reagin-Iike antibodies in animals immune to he lminth parasites Nature (1964) 204 :91)。用正常饮食维持感染的小鼠并无限制地提供含抗生素的水(0. 5g多粘菌素B和IOg硫酸新霉素在5000ml ddH20中)5天。在第9天检查小鼠的肺炎症和在第9和15天使用实施例4中提供的方法检查血清IgE水平。实施例8用一组变应原致敏诱导IgE(气道，皮肤)此实施例说明了对不同变应原的IgE应答。以不同剂量注射了一组变应原(临床上使用的)例如尘螨D. farinae, D. pteronyssinus、美国蜚蠊(Cockroach)、细链格孢(Alternar ia tenuis)、曲霉混合物、 Cladosporidium herbarum、猫、狗、车前草-酢浆草(Sorrel)混合物、短豚草、西方橡树混合物、草混合物/百慕大/Johnsonand真菌和其他变应原，并如上述评估血清免疫球蛋白水平。实施例9施用期望治疗后血清IgE或记忆IgE阳性B细胞的评估此实施例说明不同治疗在不同条件下是如何影响IgE应答的。以类似的方式评估了预防性和治疗性干预二者。提到建议的治疗剂时旨在包括预防性和治疗性干预二者。测量了未免疫动物的血清IgE浓度。将动物随机分配为7个组之一。第一组将不接受治疗性干预或抗原攻击。第二组仅接受载体(即无抗原)然后接受建议的治疗剂。第三组接受抗原攻击然后接受建议的治疗剂。第四组接受建议的治疗剂然后仅接受载体。第五组接受建议的治疗剂然后接受抗原攻击。第六组仅接受载体(即无建议的治疗剂)。第七组仅接受抗原攻击(即无建议的治疗剂)。抗原攻击和施用建议的治疗剂(或反过来)的时间可变化以测定最佳施用时间。在此期间测量动物IgE水平以评估建议的治疗剂调节IgE血清水平的能力。在第 3，7，14，21，观，35和42天(抗原攻击后)经尾静脉收集60ul样品用于抗体同种型测量，使用在实施例4中描述的测定。应当理解本文描述的实施例和实施方案仅为了说明的目的，建议本领域技术人员根据其进行多种修改或改变，这些修改或改变也被包括在本申请的精神和范围和随附的权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请用于所有目的在此处以其整体引入作为参考。工业适用性本文提供的胚胎干细胞允许产生体内模型的对非特异性变应原的IgE应答。本文描述的体内动物模型提供了对非特异性变应原的完整IgE应答。表1:序列总结
权利要求
1.一种靶向载体，其包含a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂/受体)，其选自对应NCBI登录号 NT_166318 (小家鼠染色体12基因组重叠群，品系C57BL/6J)的第254706 至25468161位核苷酸的至少1500个核苷酸、至少1800个核苷酸、至少2000个核苷酸、至少2200个核苷酸和至少MOO个核苷酸；b)可选择的基因标记；c)期望的/供体DNA序列，其编码供体转换区；和d)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂/受体)，其选自对应NCBI 登录号NT_166318(小家鼠染色体12基因组重叠群，品系C57BL/6J)的第254706 至 25468161位核苷酸的至少1500个核苷酸、至少1800个核苷酸、至少2000个核苷酸、至少 2200个核苷酸、至少MOO个核苷酸和至少观00个核苷酸。
2.权利要求1的靶向载体，其中5，臂包含SEQID NO 4或5。
3.权利要求1的靶向载体，其中5’臂与内源Iε的3’区和内源Se的5’区同源。
4.权利要求1的靶向载体，其中3，臂包含SEQID NO 7或8。
5.权利要求1的靶向载体，其中可选择的基因标记选自新霉素和胸苷激酶。
6.权利要求1的靶向载体，其中可选择的基因标记是新霉素。
7.权利要求1的靶向载体，其中可选择的基因标记两侧是Ioxp位点。
8.权利要求1的靶向载体，其中期望的转换区来自小鼠。
9.权利要求1的靶向载体，其中期望的转换区选自Sy，Sy1，SY 2a，SY 2b禾口 SY 3。
10.权利要求1的靶向载体，其中期望的转换区是含有小鼠Sm区大部分的HindIII/ NheI片段。
11.权利要求1的靶向载体，其中期望的转换区包含对应NCBI登录号NT_166318(小家鼠染色体12基因组重叠群，品系C57BL/6J 1)的第25617172至25615761位核苷酸。
12.体外产生改变的胚胎干细胞的方法，其包括以下步骤a.在所述细胞中改变基因组DNA以增强CSR的可能性，从而表达选自下述的Cεi.通过添加与内源Sε区串联的至少一个另外的S ε拷贝增加S ε长度；ii.Se区取代；和b.选择具有正确改变的基因组DNA的细胞。
13.根据权利要求12的方法，其中所述改变是用选自Sy，SYl，SY2a，SY2b禾口Sy3 的转换区取代S ε区。
14.根据权利要求12的方法，其中所述改变是用Sy区取代Sε区。
15.体外产生改变的胚胎干细胞的方法，其包括以下步骤a)使用根据权利要求1的载体用Sy交换Sε区b)选择具有正确改变的基因组DNA的细胞。
16.根据权利要求15的方法，其中所述改变是用选自Sy，Sγ 1，S γ 2a，S γ 2b禾口 S γ 3 的转换区取代S ε区。
17.根据权利要求15的方法，其中所述改变是用Sy区取代Sε区。
18.权利要求15的方法，其中所述ESC来自选自BALB/c或C57BL/6的小鼠品系。
19.一种非人动物，其中a)IgH基因座的至少一个等位基因已被改变，以提高相对未改变的等位基因的IgE表达/产生/分泌率；和b)具有选自下述的IgE谱i.全部血清抗体的IgE部分大于0.04% ；ii.IgE血清浓度大于4，000ng/ml ；iii.IgG/IgE 比例低于 10。
20.一种非人哺乳动物，其具有经改变以表达IgE分子大于4000ng/ml的水平的基因组。
21.一种非人哺乳动物，其具有在0. 1和10之间的IgG/IgE比率。
22.—种非人哺乳动物，其具有在lOOng/mL和lOOOOng/mL之间的未攻击的(即静息)IgE血清浓度。
23.一种非人哺乳动物，其具有在lOOOng/mL和lOOOOOOng/mL之间的攻击后的(即活化)IgE血清浓度。
24.权利要求19的动物模型，其中所述动物模型是非人脊椎动物。
25.权利要求19的动物模型，其中所述动物模型是小鼠、大鼠、豚鼠、兔或灵长类。
26.权利要求19的非人动物/哺乳动物模型，其中所述非人动物的基因组具有经改变以表达/产生更多IgE的IgH基因座的S ε区。
27.权利要求19的非人动物/哺乳动物模型，其中所述改变通过基因打靶实现。
28.使用权利要求19的动物模型检测过敏反应治疗的方法，其包括在施用所述方法治疗变应性疾病以前、同时或之后使所述动物接触变应原，并评估IgE应答。
29.权利要求观的方法，其中所述IgE应答低于未经过敏反应治疗的。
30.权利要求观的方法，其中所述检测动物和对照动物是同窝出生仔畜。
31.通过权利要求观的方法鉴定的化合物作为药物在治疗过敏反应中的用途。
32.可从权利要求19的动物模型得到的细胞系。
33.从权利要求19的动物模型中分离的细胞。
34.产生非人动物模型的方法，所述方法包括a)将编码SEQID NO :6(Sy)的质粒的线性化片段显微注射至小鼠的受精卵中，从而使所述片段掺入C ε -编码区的上游基因组DNA并与C ε -编码区有效连接，b)将所述受精卵转移至之前已经处理以诱发假孕的雌性小鼠的输卵管，和c)允许所述卵在所述雌性小鼠的子宫中发育。
35.重组小鼠，在其种系中包含经改造的基因组，其中所述改造包含改变IgH基因座的至少一个等位基因，以提高IgE产生率。
36.权利要求35的重组小鼠，其中所述改变包含用Sy区或其功能性部分替换Sε。
37.权利要求35的重组小鼠，其中所述Sy功能性部分的长度在至少11Λ和101Λ之间。
全文摘要
本文描述了具有Sε区改变从而具有提高的IgE水平的重组非人细胞和动物。本文也描述了在IgH基因座中的改变，其允许增强类别转换重组(CSR)从而使期望的重链同种型相比未改造细胞以提高的水平表达。
文档编号G01N33/50GK102333874SQ201080009394
公开日2012年1月25日 申请日期2010年2月26日 优先权日2009年2月27日
发明者A·A·扎林, S·米萨吉 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司