专利名称：一种生物素的酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测含维生素食品和维生素产品中的生物素含量的酶联免疫试剂盒，属于食品成分的检测分析技术领域。背景资料生物素又名维生素B7、维生素H等，分子式为C11H18O3N2S,由咪唑酮环和一个带戊酸的四氢噻吩环结合而成，为含硫的单羧酸环。生物素是机体维持正常生理机能所必需的一种维生素，是一项重要的营养指标，同时也是重要的食品添加剂之一，对人和动物的新陈代谢意义重大。其作为羧化、脱羧和脱氢反应酶系的辅助因子，是丙酮酸羧化酶、乙酰辅酶 A羧化酶、丙酰辅酶A羧化酶和甲基丁烯酰辅酶A羧化酶的羧基载体，在脂类、蛋白质、 碳水化合物和核酸的代谢过程中起重要作用。愈来愈多的研究表明，生物素不仅是动物正常生理活动的必需酶的辅助因子，还有促进免疫器官生长，增强免疫机能的作用。无论人还是动物缺乏生物素都会出现食欲下降、生长缓慢、脱发或神经受损等问题，孕期生物素缺乏对人类还会有潜在致畸性。成人每天需要100至200毫克的生物素。由于生物素的独特功能，已被广泛应用于医药、维生素制剂、饮料、婴幼儿食品、饲料添加剂等行业中。近几年，生物素的发展越来越多地受到人们的关注。生物素检测方法的研究，更是成为很多行业的研究焦点。目前，用于生物素测定的方法主要有生物法、化学法、酶法、微生物法和高效液相色谱(HPLC)法。其中，生物法由于其实验周期长，人力、物力消耗多，逐渐不被使用；化学法和酶法的灵敏度受样品种类变化的影响较大，适用范围较窄，有待于进一步改进。微生物测定法灵敏度高但准确度不高，且耗时长，对操作人员的技术要求较高。 如果有较完整的前期样品处理方案，HPLC法将会是一种更为稳定、快速的方法。但其缺点在于仪器设备造价过高，且样品的前处理较为复杂，不适合成分复杂、杂质干扰大的样品测定。与HPLC法相比，免疫分析法作为一种测定生物素的新型有效的方法，近年来获得迅速发展，并投入商品化应用。酶联免疫(ELISA)法测定原理基于抗原-抗体反应，省去了样品冗长而繁琐的前处理过程，更适合于成分较为复杂难于分离处理的样品检测。该法已广泛应用于各种生物大分子(如细菌、病毒及蛋白质等)、小分子(半抗原)物质等的检测。目前报道的检测生物素的ELISA法大多基于生物素-亲和素系统，生物素与亲和素有相当强的亲和力(Kd = I(T15M)，已被广泛用于细胞化学、免疫组织化学、免疫测定等。但是生物素-亲和素系统中， 亲和素是一种高碱性(PH = 0.5)糖蛋白，易引起较强的非特异性结合。最近Bager报道抗生物素抗体有模拟亲和素功能的作用，并显示较好的特异性。

发明内容
本发明的目的是解决传统检测方法存在的不足，提供一种操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查的，用于检测牛奶、奶粉、饮料等含维生素食品和维生素产品中生物素含量的酶联免疫检测试剂盒及方法。本研究在获得完全抗原，制备抗生物素特异性抗体的基础上，建立了针对生物素的间接竞争ELISA检测方法，用于定量检测含维生素的食品和维生素产品中的生物素含量，结果表明该方法简便、快速、特异性强，灵敏度高。本发明的检测原理为当在微孔条上预包被生物素偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入生物素特异性抗体溶液，样本中的生物素或生物素标准品与酶标板上包被的生物素偶联抗原竞争生物素特异性抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与样本中生物素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中生物素的含量。同时也可根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度生物素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中生物素含量的浓度范围。本发明提供的生物素的酶联免疫检测试剂盒中试剂的组成包括(1)包被有生物素包被抗原的酶标板；(2)生物素的特异性抗体；(3)酶标记抗抗体；(4)生物素标准品溶液；(5)浓缩磷酸盐缓冲液；(6)浓缩洗涤液；(7)底物显色液；(8)终止液。其中所述的生物素包被抗原是将生物素半抗原与卵清蛋白偶联得到的，生物素包被抗原的浓度为0. 2 1 μ g/ml。所述生物素特异性抗体是由生物素与分子量范围是6. 7KDa 6. SKDa的牛血清蛋白的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔制备得到；其中所述生物素特异性抗体的工作浓度为 1 20000。所述的酶标记抗抗体是采用过碘酸钠将辣根过氧化物酶与羊抗兔抗体进行偶联得到的；所述酶标记抗抗体的工作浓度为1 2000。所述的生物素标准品溶液的浓度依次为0. 1 μ g/L、1 μ g/L、4 μ g/L、10 μ g/L、 25μ g/L、50y g/L、100ng/ml、250y g/L、1000y g/L、10000y g/L。所述浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaCl 80g、KH2P042. Og^Na2HPO4 · 12H20229. 0g、KCl 2. Og的水溶液。所述浓缩洗涤液是含有体积分数0. 05%吐温-20的pH7. 4,0. lmol/L的磷酸盐缓冲液。所述的底物显色液包括显色液A与显色液B，显色液A为四甲基联苯胺溶液，显色液B为pH5. 0 6. 0的过氧化脲溶液，使用时显色液A与显色液B等体积混合后使用；所述的终止液为2mol/L的盐酸溶液。本发明提供的酶联免疫检测试剂盒可用于含维生素食品和维生素产品中生物素含量的检测。本发明的优点和有益效果本发明中检测食品中生物素的酶联免疫试剂盒采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测牛奶、奶粉、饮料等食品中生物素的含量，样品前处理过程简单，能同时检测大批样品。本发明采用高特异性的生物素多克隆抗体，检验方法简便易行，具有特异性高、灵敏度高、准确度高等特点，将在食品、饲料和维生素产品中生物素含量的检测中发挥重要作用。


图1为本发明生物素抗体的抑制率曲线。图2为本发明生物素的酶联免疫试剂盒的工作曲线。下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。
具体实施例方式实施例1、试剂盒关键组分的制备1、免疫原的合成将生物素与牛血清蛋白(BSA)采用EDC法进行偶联得到免疫原。具体包括以下步骤A、分别称取生物素22. 7π^(51.5μπι01)，水溶性碳二亚胺 (EDC) 98. 7mg(514. 7 μ mol)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 29. 6mg(257. 4 μ mol)，依次溶于 5mL DMF中，避光、室温磁力搅拌反应M小时；B、将 10011^(1.5“11101)854(分子量范围为6.71(03 6.81(03)溶于 IOmL 磷酸盐缓冲液(PBS) (0. 01M, ρΗ7· 4)中；C、将“步骤A的产物”缓慢加入到“步骤B的产物”中，室温磁力搅拌反应3小时； 反应结束后，将反应液转移到半透膜中，在0 4°C用PBS缓冲液(0.01M，pH7. 4)透析3天， 期间每4 6小时更换一次透析液；随后用蒸馏水透析3天，期间每4 6小时换一次透析液；透析完毕，用冷冻干燥机冻干，得到黄色絮状固体即为免疫原(生物素与牛血清蛋白的偶联物)，-20°C保存，备用。2、生物素包被抗原的合成将生物素与卵清蛋白(OVA)采用混合酸酐法进行偶联得到包被抗原。具体步骤如下A、称取49mg(lll. 1 μ mol)生物素溶于5mL无水DMF(N-N 二甲基甲酰胺) 中振荡溶解，加入^μ (122.2μπι01)三正丁胺，冰浴反应30分钟，然后逐滴加入 20. 2yL(155. 5ymol)氯甲酸异丁酯，室温反应1小时。B、称取 IOOmg OVA (卵清蛋白)(2. 22 μ mol)溶于 PBS 中。C、将“步骤A的产物”逐滴加入到“步骤B的产物”中，室温搅拌反应过夜。反应结束后，先后用PBS缓冲液(0. 01M，pH7. 4)和蒸馏水透析6天，期间更换透析液；透析完毕，用冷冻干燥机冻干，得到黄色絮状固体即为包被抗原(生物素与卵清蛋白的偶联物)，-20°C 保存，备用。3、生物素特异性抗体的制备采用雄性新西兰大白兔作为免疫动物，以生物素与牛血清蛋白的偶联物为免疫原。首次免疫，将弗氏完全佐剂与免疫原按1 1混合成油包水的乳浊液，每只兔注射0.5mg免疫原，进行背部皮下多点注射(5 10点)；20天后第一次加强免疫，用弗氏不完全佐剂与等体积免疫原混合，进行第二次免疫，剂量减半，方法同首免；以后每隔两周加强免疫一次，第五次不加佐剂只用生理盐水进行末次免疫，注射七天后进行心脏采血。血液在4°C静置过夜，次日lOOOOrpm离心15分钟得抗血清，即为生物素多克隆抗体。4、酶标板的制备用碳酸盐缓冲液(0. 05M，pH9. 6)将步骤2中制备的生物素包被抗原稀释成0. 2 1 μ g/mL,酶标板的每孔加入100 μ L，37°C温育浊或4°C过夜，倾去包被液，每孔加入300 μ L 洗涤液洗涤3次，拍干；然后每孔加入封闭液250 μ L，37°C温育池，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用铝膜真空密封4°C保存。5、酶标记抗抗体的制备酶标记抗抗体的制备是将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶采用过碘酸钠法或戊二醛法与羊抗兔抗体偶联并纯化提取，得到酶标记抗抗体。实施例2、ELISA检测方法的建立1、抗体与包被抗原浓度的优选(方阵法)纵向用实施例1步骤2中制备的生物素包被抗原按5.0yg/mL、2.0yg/mL、 1. 0 μ g/mL、0. 5 μ g/mL、0. 2 μ g/mL、0. 1 μ g/mL 的系列浓度包被酶标板，100 μ L/ 孔，37 V放置2小时，用洗涤液300 μ L/孔洗板三次；再用封闭溶液250 μ L/孔封闭，4°C放置过夜，洗板三次；横向加入100 μ L/孔一系列稀释的实施例1步骤3中制备的生物素特异性抗体 (1 2500至1 80000)，37°C放置30分钟，洗板三次；加入100 μ L/孔1 2000的酶标记抗抗体即辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体，37°C放置30分钟，洗板三次；加入100 μ L/孔的底物显色液，37°C显色15分钟后，加入50 μ L/孔的终止液，用酶标仪测定450nm处吸光度值。以吸光度值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。优选结果抗体浓度为1 20000，包被抗原浓度为0.2 μ g/mL。2、抗体灵敏度的测定根据上述对抗体及包被抗原浓度的优选实验，选择并确定抗体浓度为1 20000， 包被抗原浓度为0. 2 μ g/mL进行抗体的灵敏度的测定A、包被用0. 05M、pH9. 6的碳酸盐缓冲液将生物素的包被抗原配成0. 2 μ g/mL的溶液，每个酶标板的反应孔中加100 μ L，37°C放置2小时，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3 次，300 μ L/孔，每次3钟，拍干。(此步简称洗涤，下同)。B、封闭用封闭溶液封闭上述已包被的酶标板，250 μ L/孔，4°C放置过夜，然后洗涤。C、加样加稀释生物素抗体(1 20000, 50 μ L/孔)与不用浓度的生物素标准品溶液(50yL/孔)于上述已封闭的反应孔中，37°C放置30分钟，然后洗涤。D、加酶标记抗抗体于各反应孔中，加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1 2000) 100 μ L/孔，37°C孵育30分钟，洗涤。E、显色于各反应孔中加入新鲜配置的显色液100 μ L/孔(显色液A 50yL+显色液B50yL)，37°C反应15分钟。F、终止于各反应孔中加入终止液50 μ L/孔，立即用酶标仪检测。G、计算过程检测结果以抑制率计算，％抑制率=% B/ByB是加入生物素标准品作为竞争后的吸光值，Btl是未加生物素标准品的吸光值。计算药物的半数(50% )抑制率浓度(IC5tl)即为该抗体的灵敏度。测定结果抗体灵敏度IC5tl = 8. 5 μ g/L。实施例3、检测生物素的酶联免疫试剂盒的组建组建检测生物素的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分A、包被有生物素包被抗原(生物素与卵清蛋白的偶联物)的固相载体(酶标板)；B、生物素特异性抗体工作液(体积比浓度为1 20000)；C、生物素标准品溶液，浓度分别为:0· 1μ g/L、ly g/L、4y g/L、10y g/L、25y g/L、 50 μ g/L、lOOng/ml、250 μ g/L、1000 μ g/L、10000 μ g/L ；D、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体工作液(工作浓度为1 2000)；E、浓缩磷酸盐缓冲液是每升含 NaCl 80g、ΚΗ2Ρ042· Og、Na2HPO4 · 12Η20229· Og、 KCl2. Og的水溶液。F、浓缩洗涤液是上述浓缩磷酸盐缓冲液加入体积比浓度为0. 05 %的吐温 20 (Tween20)；G、底物显色液显色液A为四甲基联苯胺溶液；显色液B为pH5. 0 6. 0的过氧化脲溶液；H、终止液浓度为2mol/L的盐酸溶液。实施例4、样品中生物素含量的检测1、样品前处理A、牛奶将牛奶样品在4°C，10000转/分钟离心15分钟，脱除脂肪层；将脱脂的牛奶用磷酸盐缓冲液稀释10倍，得到待测样品。B、奶粉称取IOg奶粉加入90ml蒸馏水溶解，4°C，10000转/分钟离心15分钟，
脱除脂肪层；将脱脂的牛奶用磷酸盐缓冲液稀释成10倍，得到待测样品。C、维生素功能饮料样品于4°C，10000转/分钟离心15分钟后取上清，用磷酸盐缓冲液稀释100倍，得到待测样品。D、维生素片或胶囊称取Ig样品，用IOOml蒸馏水溶解，然后在4°C，10000转/分钟离心15分钟，取上清，用磷酸盐缓冲液稀释成1 10，得到待测样品。2、用实施例3中组建的试剂盒检测A、加样向包被有生物素包被抗原的酶标板微孔中加入生物素标准品溶液或样本溶液50 μ L，然后加入生物素抗体溶液50 μ L，用盖板膜封板，37°C恒温箱中反应30min ；B、洗涤倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液300 μ L，洗涤3次，拍干；C、加酶标记抗抗体溶液每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体溶液 100yL，37°C恒温箱中反应30min ；D、洗涤倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液300 μ L，洗涤3次，拍干；Ε、加显色液每孔加入显色液10(^1^(显色液々和显色液8各5(^0，371恒温箱避光显色15min ；F、终止每孔加入终止液50 μ L ；F、读数用酶标仪测定450nm处的吸光度值。3、检测结果分析
用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液 (0标准)的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。以生物素标准品浓度(yg/ L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制抑制率曲线(图1)和工作曲线(图2)。 用同样的方法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出样本中生物素的含量。实施例5、试剂盒灵敏度、精密度和准确度试验(一 )试剂盒精密度和准确度试验向不含生物素的牛奶样品中添加生物素标准品，使生物素在样品中的终浓度分别为10yg/L、50yg/L、100yg/L，来检测生物素的回收率和变异系数。每个浓度的回收率和变异系数都以不同的5天的5个重复数据进行计算，根据绘制的工作曲线(图2)的线性方程进行回收率的定量计算。结果见下表。
权利要求
1.一种生物素的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中试剂的组成包括(1)包被有生物素包被抗原的酶标板；(2)生物素的特异性抗体；(3)酶标记抗抗体；(4)生物素标准品溶液；(5)浓缩磷酸盐缓冲液；(6)浓缩洗涤液；(7)底物显色液；(8)终止液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的酶标板中包被的生物素包被抗原是将生物素半抗原与卵清蛋白偶联得到的；所述的生物素包被抗原的浓度为0. 2 1 μ g/ ml ο
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的生物素特异性抗体是由生物素与分子量范围是6. 7KDa 6. SKDa的牛血清蛋白的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔制备得到；其中所述生物素的特异性抗体的工作浓度为1 20000。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的酶标记抗抗体是采用过碘酸钠将辣根过氧化物酶与羊抗兔抗体进行偶联得到的；所述酶标记抗抗体的工作浓度为 1 2000。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的生物素标准品溶液的浓度依次为 0. 1μ g/L、ly g/L、4y g/L、10y g/L、25y g/L、50y g/L、100ng/ml、250y g/L、1000y g/L、 10000 μ g/L0
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述浓缩磷酸盐缓冲液是每升含 NaC180g、ΚΗ2Ρ042· 0g、Na2HPO4 · 12H20229. 0g、KCl 2. Og 的水溶液。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述浓缩洗涤液是含有体积分数0.05% 吐温-20的pH7. 4,0. lmol/L的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的底物显色液包括显色液A与显色液B，显色液A为四甲基联苯胺溶液，显色液B为pH5. 0 6. 0的过氧化脲溶液，使用时显色液A与显色液B等体积混合后使用；所述的终止液为2mol/L的盐酸溶液。
9.权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒在检测含维生素食品和维生素产品中生物素含量的应用。
全文摘要
本发明公开了一种生物素的酶联免疫检测试剂盒，属于酶联免疫吸附分析技术领域。所述试剂盒中的组分包括包被有生物素包被抗原的酶标板；生物素特异性抗体；酶标记抗抗体；生物素标准品溶液；浓缩磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液；底物显色液；终止液。本发明的酶联免疫试剂盒利用生物素多克隆抗体进行酶联免疫检测，灵敏度IC50=8.5μg/L。在牛奶样品中最低检测限为4.0μg/L，变异系数<12.1%，回收率为78.2～95.4%。本发明的酶联免疫试剂盒检验方法简便易行，具有特异性强、灵敏度高、准确度高等特点，将在含维生素食品和维生素产品中生物素含量的快速定量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/82GK102539790SQ201110460028
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者孟萌, 宋佩, 尹永梅, 张太昌, 徐志环, 王鹏, 田溪, 薛虎寅, 邢玥, 郗日沫 申请人:南开大学