专利名称：一种鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的毛细管电泳方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种小麦低分子量谷蛋白亚基的快速分离和鉴定方法，特别是涉及通过毛细管电泳(CE)技术对小麦低分子量谷蛋白亚基等位基因和不同品质特性品种(系)进行鉴定的方法。
背景技术：
小麦是人类重要的粮食作物，也是人类重要的蛋白质来源，其籽粒中贮藏的蛋白质主要由麦醇溶蛋白和麦谷蛋白组成，这两种蛋白的组成与含量在很大程度上决定了小麦的品质特性，是小麦品种鉴定和品质改良的重要遗传标记。贮藏蛋白中麦谷蛋白的分子量较大，是影响小麦面筋粘弹性的重要因素。根据还原条件下在SDS-PAGE中迁移率的不同可分为高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)。HMW-GS的组成和含量直接影响小麦面粉的烘烤质量，而LMW-GS则与面团的粘弹性密切相关。LMW-GS约占谷蛋白含量的80%左右。根据其在SDS-PAGE中迁移的快慢，依次分为C、B和D区，人们通常根据亚基在SDS-PAGE上所处的位置，将LMW-GS分为B、C和D三种类型的亚基。C亚基分子量为30，000 40，000道尔顿，B亚基分子量为40，000 50，000道尔顿，D亚基是LMW-GS 中分子量较大，数量较少的一类亚基。编码B型亚基的基因位点在第一部分同源群染色体短臂的Glu-3位点。编码C型亚基的基因位点可能在第一部分同源群染色体短臂的Gli-I 位点或在第六部分同源群染色体短臂的立点。D型亚基也许在67i-7位点。研究表明，小麦低分子量谷蛋白亚基基因位点与醇溶蛋白的基因位点紧密相连，如位点含有3种蛋白质基因ω醇溶蛋白基因、γ醇溶蛋白基因和低分子量谷蛋白亚基基因。这可能是醇溶蛋白基因位点m-D在生物进化过程中发生突变而分化成的3部分。小麦低分子量谷蛋白亚基是一种重要的蛋白质，大量研究表明，低分子量谷蛋白亚基位点的等位变异与硬粒小麦、普通小麦的品质差异具有高度相关性。Payne等于1984 年首先发现，小麦低分子量谷蛋白亚基与四倍体小麦品质相关，具有LMW-I型电泳图谱的小麦品种往往具有较差的加工品质，具有LMW-2型电泳图谱的小麦品种则恰恰相反。 Nieto-Taladriz等(1997)发现，构成LMW-1、LMW-2型的亚基是由Glu_3、立点上的等位基因控制，这样就可以解释为什么具有LMW-I或LMW-2的小麦的品质也会存在差异。 Pogna等(1990)和Ruizm等(1993)的研究证明，不同小麦低分子量谷蛋白亚基组成对面包的加工品质有不同的影响，而且低分子量谷蛋白亚基能够形成大聚合体蛋白，与面团筋力有显著关系。Brett等(199 的研究证实了小麦低分子量谷蛋白亚基对面包烘烤品质具有重要作用。Sissons等(1998)用RP-HPLC分离了一些小麦低分子量谷蛋白亚基进行品质研究，结果发现，N-端为METSHIPGL-的小麦低分子量谷蛋白亚基可以改善面粉的和面特性。与高分子量谷蛋白亚基相比，低分子量麦谷蛋白亚基的组成更为复杂，一个品种一般具有15-50个基因。因此，长期以来由于缺乏有效的分离方法，与HMW-GS相比，国内外对LMW-GS的研究相对滞后，例如常规分离方法SDS-PAGE分辨度不高，操作复杂， 无法进行定量分析，还要使用有毒试剂等。高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)虽然在一定程度上克服了 SDS-PAGE的不足，但其运行成本高，难以在实践中广泛应用，由于上述方法的局限性，急需建立一种新的、更加有效的分离鉴定技术。毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, CE)技术是过去20年来分离科学发展起来的一项新技术(Landers, 1991; Xu, 1993; BeanandLookhart, 2001)，在小麦蛋白质分离和品种鉴定中具有独特的优越性，应用前景广阔。但迄今为止国内外还未能建立小麦 LMW-GS的毛细管电泳分离和等位基因快速鉴定的方法。毛细管电泳仪器装置主要包括高压电源、进样系统、毛细管柱、检测器和记录系统五大部分。制作毛细管的材料-熔融硅胶的等电点(Pl)为1.5左右，在碱性和微酸性 (PH>2. 5)溶液中，熔硅表面的硅羟基(Si-OH)电离成Si0_，使其内表面带负电。负电荷表面在溶液中积聚相反电荷的离子，在管壁和溶液之间形成双电层。在高电场的作用下，双电层中的水合阳离子引起的流体整体将朝负极方向移动，即电渗。粒子在毛细管内一方面受到电场作用而在缓冲溶液中发生定向移动，即电泳。影响毛细管区带电泳分离效果的因素较多，主要包括操作电压、温度、缓冲溶液的类型与浓度、PH值、添加剂的选择与浓度的确定、 毛细管柱的改性等。由于LMW-GS组成十分复杂，实现高分辨、高重复性分离非常困难，因此，长期以来国内外都试图建立一种LMW-GS毛细管电泳分离方法，但都未能成功。要获得最佳分离方法，需要针对具体检测物对上述多种影响因素进行优化和筛选，以达到最佳分离效果。

发明内容
本发明的目的在于建立一种稳定、快速的毛细管电泳方法，从而可以对小麦低分子量谷蛋白亚基进行分离和鉴定。主要任务是解决针对小麦种子中贮藏的低分子量谷蛋白亚基进行鉴定，筛选出毛细管电泳的最佳电泳条件参数。通过该方法，可以快速准确的鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基和等位基因的组成，从而鉴定并表征不同品质特性的小麦品种和种质资源。本发明方法包括样品制备、毛细管电泳和数据处理分析，具体包括以下步骤 (1)样品制备
取200mg小麦面粉，加入Iml体积百分含量为70%的乙醇，涡旋30_60min，IOOOOrpm离心lOmin，去上清；加入Iml体积百分含量为55%的异丙醇，65°C水浴30min ；去上清，重复此步骤3次，用滤纸吸去残余上清；再加入0. Iml浓度为1%的DTT溶液和0. Iml溶液A，其中溶液A的组成为，异丙醇=IM Tris-HCl(pH6. 8):双蒸水=5:2:3，涡旋混勻，65°C水浴30min ； 再加入0. Iml浓度为1. 4%的4-乙烯基吡啶和0. Iml溶液A，涡旋混勻，65°C水浴30min ； 12000rpm离心15min ；取上清用40%体积百分含量丙酮室温沉淀3小时，12000rpm离心 15min,收集上清；将上清用80%体积百分含量丙酮在_20°C沉淀过夜，13000g离心15min， 收集沉淀，沉淀即为小麦低分子量谷蛋白亚基；
在上述沉淀中加入Iml体积百分含量为99%的乙醇，搅碎，IOOOOrpm离心lOmin，去上清；再加入80%体积百分含量丙酮，IOOOOrpm离心lOmin，去上清；干燥沉淀，加入50μ1色谱级乙腈溶液，其中含有终浓度为0. 1%的TFA，溶解，将得到的上清液用于毛细管电泳。
(2)毛细管电泳
电泳缓冲液为IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液，该缓冲液的pH值为2. 5，添加有终浓度为 18%乙腈和终浓度为0. 04%羟脯氨酰甲基纤维素，具体电泳条件参数为 毛细管长度40.2cm 毛细管内径50 μ m 运行电压 IlkV 毛细管温度38°C 样品槽温度13°C 进样9. 5 kV, 9 sec ；
所述IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液的制备方法为取85%体积百分含量的磷酸1.6ml， 甘氨酸2. Og,乙腈98ml，HPMC 0. 22g，加水定容至500ml，调节pH为2. 5，经0. 45 μ m滤膜过
滤ο在上述方法中，为了能够连续检测样品和保证检测结果的重复性和准确性，在进行毛细管电泳时，对毛细管进行冲洗必须按冲洗程序操作，按照冲洗目的的不同，冲洗程序具体分为以下四种情况
A、对于新的毛细管在使用前要进行预处理冲洗，冲洗程序如下
H2O6 min ；
0. IM NaOH6 min ；
IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液30 min ；
B、进样前对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下
0. IM NaOH8 min ；
H2O8 min ；
IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液20 min ；
C、当一次鉴定测定多个样品时，两次样品检测之间要进行冲洗，冲洗程序如下 0. IM NaOH4 min ；
IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液4 min ；
D、检测结束后对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下
0. IM NaOH3 min ；
IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液2 min。通过本发明方法可以建立重要LMW-GS的标准毛细管电泳图谱，进而形成对优质亚基和等位基因进行鉴定的一套完整的技术体系。本发明方法可以应用于小麦品种鉴定、小麦品种改良和鉴定小麦品种低分子量谷蛋白亚基等位基因等各个方面。本发明方法的优点是
(1)样品用量少、速度快只需半粒种子(约15mg)即可进行多次分析。利用本发明方法可以在21min内完成一个样品的分离，效率明显高于常规的SDS-PAGE方法。(2)分辨度高一个品种一般可分离出25-40个蛋白组分，常规SDS-PAGE方法一般只能分离出8-15个组分，对一些亲缘关系很近以及SDS-PAGE图谱相同的品种，用本方法仍能有效鉴定。
(3)重复性高峰迁移时间和峰高的相对标准偏差(RSD)分别小于0. 5%和1%。从进样到结果分析自动化程度高，简便易于操作。(4)分离自动化程度高毛细管电泳从进样到结果分析自动化程度高，简便易于操作，这是传统SDS-PAGE方法所无法比拟的。(5)分析成本低、无污染只需廉价毛细管和一些常用试剂，用量很少，无毒害，对环境无污染。


图1为普通小麦“中国春”的低分子量谷蛋白亚基毛细管电泳标准图谱。图2为济麦20等六个不同品质特性小麦品种的低分子量谷蛋白亚基毛细管电泳图谱。图3为两个近等基因系ArilM-3 (18)和Aril27_6 (20)低分子量谷蛋白亚基等位基因、Glu-B3d, Glu~B3g)毛细管电泳鉴定。
具体实施例方式实施例1、小麦低分子量谷蛋白亚基标准CE指纹图谱的构建 (1)取样及样品制备
取小麦“中国春”单粒种子(首都师范大学遗传与生物工程实验室繁育和保存有中国春种子)，用刀片去掉胚端，准确称量200mg后用硫酸纸和小铁锤扎碎成细粉，放入1. 5ml离心管中；加入体积百分含量为70%的乙醇Iml涡旋30-60min，IOOOOrpm离心lOmin，去上清。 加入体积百分含量为55%的异丙醇1ml，65°C水浴30min，IOOOOg离心lOmin，去上清并用滤纸吸干，重复3次。加入0. Iml浓度为1%的DTT和0. Iml溶液A，其中溶液A的组成为，异丙醇=IM Tris-HCl(pH6. 8):双蒸水=5:2:3，涡旋混勻，65°C水浴30min ；再加入0. Iml浓度为1. 4%的4-乙烯基吡啶和0. Iml溶液A，涡旋混勻，65°C水浴30min, 12000rpm离心15min。 取上清用体积百分含量为40%的丙酮室温沉淀3小时，12000rpm离心15min，收集上清；将上清用体积百分含量为80%的丙酮在-20°C沉淀过夜，13000g离心15min，收集沉淀，沉淀即为小麦低分子量谷蛋白亚基。在沉淀中加入1 ml体积百分含量为99%的乙醇，搅碎，IOOOOrpm离心lOmin，去上清。再加入体积百分含量为80%的丙酮，搅碎，IOOOOrpm离心lOmin，去上清。然后用真空干燥仪干燥沉淀，在沉淀中加入50μ1色谱级乙腈溶液，其中含有终浓度为0. 1%的TFA，溶解，得到的上清液用于毛细管电泳(可在4°C下可以保存4周以上)。(2)毛细管电泳
①仪器设备采用Beckman Coulter公司生产的PA 800型高效毛细管电泳仪系统(配有软件用于系统操作和数据处理)进行CE分析。②毛细管弹性石英毛细管柱，内径为50Mm、长度为40. 2cm (检测长度30cm)，外层涂有聚酰亚胺保护层，内壁均未涂层。③电泳缓冲液IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液(pH 2. 5，添加有18%乙腈和0. 04% 羟脯氨酰甲基纤维素HPMC)。500ml浓度为IOOmM的磷酸-甘氨酸缓冲液的制备方法85% 的磷酸1. 6ml,甘氨酸2. Og,乙腈98ml，HPMC 0. 22g，加双蒸水定容至500ml，调节pH为2. 50，经0.45um滤膜过滤，4°C保存。④毛細管柱冲洗方法
A、新毛細管预处理程序
H2O6 min ；
0. IM NaOH6 min ；
IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液30 min ；
B、进样前冲洗
0.IM NaOH8 min ；
H2O8 min ；
IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液20 min ；
C、样品间冲洗程序
0. IM NaOH4 min ；
IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液4 min ；
D、结束实验冲洗
0. IM NaOH3 min ；
IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液2 min。⑤电泳參数
运行电压11 kV 毛細管温度38°C 样品槽温度13°C 进样9. 5 kV, 9 sec
电极 由+向_
⑥数据处理利用软件进行数据处理，同时将电泳结果转换成ASC码，进行Excel处 理分析。(3)指纹图谱构建根据各蛋白组分的迁移时间、峰高、峰面积等參数构建标准指 纹图谱。小麦“中国春”的低分子量谷蛋白亚基毛細管电泳标准图谱如图1所示。实施例2、利用实施例1构建的标准图谱对小麦品种进行鉴定
(1)实验操作取济麦20、中优9507、周麦16、小偃6号、京东8号、京411 (由中国农 业科学院作物科学研究所提供)等6个不同品种的小麦的种子，取样及样品制备、毛細管电 泳、标准图谱的构建等同实施例1。(2) CE图谱分析根据不同小麦品种低分子量谷蛋白亚基组分的迁移时间、峰高、 峰面积等參数的差异，分析其电泳组成特征。每个小麦品种重复电泳3次，计算峰迁移时 间、峰高、峰面积的相对标准偏差(RSD)，获得各个小麦品种水溶性蛋白组分的平均值和相 对标准差，作为品种真实性和纯度鉴定或品种权保护的标准电泳图谱。(3)品种或种质鉴定进行品种真实性和品种权保护鉴定吋，每个小麦品种随机取 样分析10粒种子，每个样品重复分离3次，根据电泳图谱的差异进行品种或种质鉴定。进 行品种纯度鉴定时，随机取50-100粒种子，重复分离3次，然后与标准图谱比较，计算品种 纯度。济麦20等6个不同小麦品种低分子量谷蛋白亚基的CE图谱比较如图2所示。
实施例3、利用实施例1构建的标准图谱，鉴定小麦品种不同LMW-GS等位基因 (1)实验操作取济麦20、中优9507、周麦16、小偃6号、京东8号、京411 (由中国农业
科学院作物科学研究所提供)等不同品种的小麦的种子，取样及样品制备、毛细管电泳、图谱分析等同实施例1和同实施例2。(2) CE图谱分析根据不同小麦品种低分子量谷蛋白亚基组分的迁移时间、峰高、 峰面积等参数的差异，分析其电泳组成特征。每个品种重复电泳3次，计算峰迁移时间、峰高、峰面积的相对标准偏差(RSD)，获得各个水溶性蛋白组分的平均值和相对标准差，作为品种真实性和纯度鉴定或品种权保护的标准电泳图谱。(3)标准图谱构建通过对两个近等基因系ArilM-3和Aril27_6的低分子量谷蛋白亚基的电泳图谱的比较分析，鉴定不同基因的编码位点，作为基因位点蛋白筛选鉴定的标记。等位基因鉴定为Aril27-6 ^-^, Ari 124-3 :67^/-^ ，通过该标记可以对似位点进行快速鉴定。两个近等基因系ArilM-3 (18)和Ari 127-6 (20)低分子量谷蛋白亚基等位基因的毛细管电泳图谱比较如图3所示。
权利要求
1.一种小麦低分子量谷蛋白亚基的毛细管电泳方法，包括如下步骤(1)样品制备取小麦种子，去掉胚端，按每200mg加入Iml体积百分含量为70%的乙醇的比例进行混合，涡旋30-60min，IOOOOrpm离心lOmin，去上清；加入Iml体积百分含量为55%的异丙醇， 65°C水浴30min ；去上清；再加入0. Iml浓度为1%的DTT和0. Iml溶液A，其中溶液A的组成为，异丙醇1M pH6. 8的Tris-HCl 双蒸水=5:2:3，涡旋混勻，65°C水浴30min ；再加入 0. Iml浓度为1. 4%的4-乙烯基吡啶和0. Iml溶液A，涡旋混勻，65°C水浴30min ； 12000rpm 离心15min ；取上清用40%体积百分含量丙酮室温沉淀3小时，12000rpm离心15min，收集上清；将上清用80%体积百分含量丙酮在_20°C沉淀过夜，13000g离心15min，收集沉淀，沉淀即为小麦低分子量谷蛋白亚基；在上述沉淀中加入Iml体积百分含量为99%的乙醇，搅碎，IOOOOrpm离心lOmin，去上清；再加入80%体积百分含量丙酮，IOOOOrpm离心lOmin，去上清；干燥沉淀，加入50μ1乙腈溶液，其中含有终浓度为0. 1%的TFA，将得到的上清液用于毛细管电泳；(2)毛细管电泳电泳缓冲液为IOOmm磷酸-甘氨酸缓冲液，该缓冲液的ρΗ值为2. 5，添加有终浓度为 18%的乙腈和终浓度为0. 04%的羟脯氨酰甲基纤维素，具体电泳条件参数为 毛细管长度40.2cm 毛细管内径50 μ m 运行电压 IlkV 毛细管温度38°C 样品槽温度13°C 进样9. 5 kV, 9 sec ；所述IOOmm磷酸-甘氨酸缓冲液的制备方法为取85%体积百分含量的磷酸1.6ml， 甘氨酸2. Og,乙腈98ml，HPMC 0. 22g，加水定容至500ml，调节ρΗ为2. 5，经0. 45 μ m滤膜过滤ο
2.根据权利要求1所述的毛细管电泳方法，其特征在于在进行毛细管电泳之前，对毛细管按下述程序进行冲洗A、对于新的毛细管在使用前要进行预处理冲洗，冲洗程序如下 H2O6 min ；·0.IM NaOH6 min ；IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液30 min ；B、进样前对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下·0. IM NaOH8 min ；H2O8 min ；IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液20 min ；C、当一次鉴定测定多个样品时，两次样品检测之间要进行冲洗，冲洗程序如下 0.IM NaOH4 min ；IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液4 min ；D、检测结束后对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下0·1M NaOH3 min ；IOOmM磷酸-甘氨酸缓冲液2 min。
3.权利要求1或2所述方法在小麦品种鉴定中的应用。
4.权利要求1或2所述方法在小麦品种改良中的应用。
5.权利要求1或2所述方法在鉴定小麦品种低分子量谷蛋白亚基等位基因中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的毛细管电泳方法。通过该方法可以建立小麦低分子量谷蛋白亚基的标准毛细管电泳图谱，进而形成对小麦优质亚基进行鉴定的一套完整的技术体系。根据蛋白质峰迁移时间和峰面积鉴定品种和种质、筛选优质亚基和等位基因，实现小麦品质快速改良。
文档编号G01N27/447GK102323320SQ20111015080
公开日2012年1月18日 申请日期2011年6月7日 优先权日2011年6月7日
发明者晏月明, 李婧 申请人:首都师范大学