专利名称：维生素b12 elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测维生素B12的酶联免疫试剂盒。
背景技术：
维生素是各种生物维持正常生理功能所必需的一类低分子有机化合物，它们大多数是生化代谢过程中的主要辅酶，在体内参与、调节、控制许多合成和分解代谢，当生物体缺乏维生素时，就会引发物质代谢障碍，引起多种疾病。维生素B12又叫钴胺素，其主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血，防止大脑神经受到破坏。维生素B12对于促进畜禽生长特别是在促进幼畜生长发育方面效果显著，在畜禽体内主要以参与一碳单位和丙酸代谢发挥作用，影响遗传物质的合成，还能维持神经功能的完整性，是畜禽不可缺少的营养原料。养殖生产过程中，常规饲料中的维生素B12—般作为安全用量，额外添加适量维生素B12可以提高畜禽生产性能，带来可观的经济效益。近年来，余林梁等报道了以HPLC测定维生素H，邓富良等用HPLC同时测定注射用水溶性维生素中维生素H和叶酸，任一平、龙朝阳等以HPLC测定食品中的叶酸，杨谊等以HPLC测定维生素B12。隋玉荣等用离子对色谱法测定了维生素B12及叶酸的含量，H.B.L1、Heudi用不同波长同时测定了维生素H、叶酸和维生素B12，宋金春等通过优化色谱条件，建立了同一波长条件下HPLC同时测定注射用水溶性维生素中维生素H、叶酸及维生素B12含量的方法。另外维生素B12的测定方法主要有比色法、电化学分析法、离子交换法、激光共振拉曼光谱法等，这些方法均是先测定样品中Co含量，由钴含量换算成VB12的含量，操作繁琐，选择性较差。刘保生等建立了利用A0-R6G能量转移荧光猝灭法测定维生素B12的新方法。免疫学检测方法也应用于维生素B12的检测中，采用间接竞争ELISA方法测定维生素B12含量的方法，简便、快速、灵敏度高，稳定性好，能满足维生素B12的现场大批量样品的快速筛选。

实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的维生素B12检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中维生素B12的测定，减少了检测样本所需要的时间。本实用新型的技术方案是:一种检测维生素B12的酶联免疫试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、13瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋,其特征在于:采用96孔聚苯乙烯酶标板作为固相载体，酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，在试剂盒酶标板微孔条上预包被维生素B12偶联抗原制成检测板，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，以塑料硬膜为盖板膜，将5瓶Iml梯度浓度的标准品溶液、Iml高浓度标准品溶液、12ml酶标二抗、7ml维生素B12抗体工作液、7ml底物液A液、7ml底物液B液、7ml终止液、40ml浓缩洗涤液、50ml复溶液试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质检报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的维生素B12将和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗维生素B12的抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含维生素B12的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中维生素B12含量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒检测谷物类(玉米面、黄豆面、小米面、大米面)、牛奶、奶粉中维生素B12，具有很高的灵敏度，样本的最低检测限为谷物4μ g/kg，回收率为85%±15% ;奶粉4 μ g/kg，回收率为80%土 10% ;原奶I μ g/L,回收率为85%土 15% ;成品奶2 μ g/L,回收率为90%±10%。本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、振荡器、涡旋仪、离心机、匀浆机和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是:能快速、简便、灵敏、准确地用于维生素B12的检测。

图1为本实用新型酶标板的侧面纵剖面图(长为8.55cm)；图2为本实用新型酶标板的侧面横剖面图(长为12.8cm)；图3为本实用新型酶标板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具侧视图。参见附图:酶标反应微孔条(2)预包被维生素B12偶联抗原(3)固定于酶标板的外框支撑架(I)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装50ml复溶液；白色帽的白色塑料试剂瓶(6)用于封装7ml底物液A液，红色帽的黑色塑料试剂瓶(6)用于封装7ml底物液B液，黄色帽的白色塑料试剂瓶(6)用于封装7ml终止液，红色帽的白色塑料试剂瓶(7 )用于封装12ml酶标二抗，绿色帽的白色塑料试剂瓶(7 )用于封装7ml维生素B12抗体工作液，黑色帽的棕色玻璃瓶(8)用于封装Iml/瓶的标准品溶液及Iml高浓度标准品溶液；盒体(9)是硬纸盒；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为:40ml浓缩洗涤液瓶位(18)，50ml复溶液瓶位(11 )，7ml底物液A液瓶位(14)，7ml底物液B液瓶位(13)，7ml终止液瓶位(12)，7ml维生素B12抗体工作液瓶位(16)，12ml酶标二抗瓶位(15)，5种Iml/瓶各种浓度的标准品溶液及I瓶Iml高浓度标准品溶液瓶位
(17)。
具体实施方式
一、样本的前处理(I)谷物(玉米面、黄豆面、小米面、大米面)[0018]称取1.0g±0.05g均质物至IOml聚苯乙烯离心管中，加入4ml 0.8mol/L磷酸盐缓冲溶液，用振荡器振荡3min，3000g以上室温离心5min ;取ΙΟΟμΙ上清液加入400μ1复溶液，用振荡器振荡3min,混勻；取50μ1用于分析。(2)奶粉称取1.0g±0.05g均质物至IOml聚苯乙烯离心管中，加入4ml 10% NaCl溶液,立即用振荡器振荡3min ;使其完全溶解；取ΙΟΟμΙ上述溶解液加入400 μ I复溶液，用振荡器振荡3min,混勻；取50μ1用于分析。(3)原奶直接点板分析。(4)成品奶取50 μ I牛奶样本加450 μ I复溶液混匀；取50 μ I用于分析。二、使用试剂盒的操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20_25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号:将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品/样本和抗体工作液:加标准品/样本50 μ I到对应的微孔中，然后加入抗体工作液50 μ I/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应30min。6、洗板:小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液(用去离子水将20X浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释)250 μ I/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。7、加酶标二抗:加入酶标二抗100 μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤6。8、显色:加入底物液A液50μ I/孔，再加底物液B液50μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。9、测定:加入终止液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第I种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含维生素B12的含量成负相关。1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(μ g/L)。假设样本I的吸光度值为0.32，样本2的吸光度值为0.585，标准液吸光度值分别是:0μ g/L为
2.000 ；0.2μ g/L 为 1.595 ;0.6μ g/L 为 1.05 ; 1.8 μ g/L 为 0.520 ;5.4 μ g/L 为 0.22。则样本I的浓度范围是1.8 μ g/L -5.4 μ g/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中维生素B12的浓度范围；样本2的浓度范围是0.6 μ g/L-1.8 μ g/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中维生素B12的浓度范围。2、定量分析[0039](I)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，即
权利要求1.一种维生素B12的ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、13瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋，其特征在于:酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被维生素B12偶联抗原制成的检测板，13瓶试剂分别为5瓶标准品溶液、I瓶高浓度标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、复溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被维生素B12偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液5瓶，Iml/瓶，浓度分别为O μ g/L，0.2 μ g/L，0.6μ g/L, 1.8 μ g/L, 5.4 μ g/L ;高浓度标准品溶液I瓶，Iml ;酶标二抗I瓶，12ml ;抗体工作液I瓶，7ml ;底物液A液I瓶，7ml ;底物液B液I瓶，7ml ;终止液I瓶，7ml ;浓缩洗涤液I瓶，40ml ;复溶液I瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测维生素B12的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、维生素B12抗体工作液、5个浓度的标准品溶液、高浓度标准品、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、复溶液。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中的维生素B12与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗维生素B12的抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含维生素B12的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中维生素B12的含量。与仪器分析技术相比具有使用方便、灵敏度高等特点，可在维生素B12的检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/543GK202975021SQ20122038031
公开日2013年6月5日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者何方洋, 冯才伟, 吴鹏, 赵赫, 吴小胜, 刘琳, 张荃, 石洁 申请人:北京勤邦生物技术有限公司