专利名称：用磁性纳米粒子固定葡萄糖氧化酶测定痕量葡萄糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用磁性纳米粒子固定葡萄糖氧化酶的电致化学发光技术快速测定痕量葡萄糖的方法，可用于人血液中葡萄糖含量的测定。
背景技术：
葡萄糖是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质。它的氧化反应放出的热量是人类生命活动所需能量的重要来源。作为人体的基本元素和最基本的医药原料，它的作用和用途十分广泛，既可直接应用于人体，又可用于食品加工和医药化工。它能迅速增加人体能量、耐力、可用作血糖过低、感冒发烧、头晕虚脱、四肢无力及心肌炎等症的补充液，对癌症也有一定的治疗作用。
实现葡萄糖的快速定量检测在生物化学、临床化学以及食品分析等领域具有重要意义。迄今为止，已有许多有关葡萄糖检测方法的报道，如电化学检测，表面增强拉曼散射光谱检测，光度法检测，化学发光检测和电致发光检测等。但采用磁性纳米粒子固定葡萄糖氧化酶(GOD)的电致发光检测葡萄糖的传感器未见报道。电致化学发光也称为电化学发光，它是通过电化学反应直接或间接引发的化学发光现象，是一类电位控制的电极氧化还原反应。近年发展起来的电致化学发光分析方法，是将电化学技术与化学发光检测相结合的一种分析方法，兼备二者的优点灵敏度高，线性范围宽，反应和时空可控性好。发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、选择性好的传感器，对痕量(如lymol/L)的葡萄糖进行测定的方法。
构思如下研究发现鲁米诺与双氧水体系在电极电压的作用下能产生非常强的电致化学发光，而鲁米诺和双氧水的浓度对该发光有显著的正线性关系。当固定鲁米诺的浓度，通过葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖间接产生双氧水时，电致化学发光的强度仅与一定浓度范围内的葡萄糖呈线性关系，在此基础上采用磁性纳米粒子固定葡萄糖氧化酶(GOD)从而建立了一种测定微量葡萄糖的电致化学发光分析方法。
本发明涉及酶促反应，属于酶传感器。当电极表面生成双氧水时，溶液中的鲁米诺与之发生电化学反应，从而产生能发出一定波长的光的激发态物质而发光。光的峰强度ip 在一定范围内与葡萄糖的浓度成正比。
具体步骤如下
(1)分别截取铁棒和玻璃管，并把铁棒和玻璃管的两端磨平、洗净；将固体石蜡和碳粉按质量比为2 4 1比例混合，稍加热至石蜡熔化，搅拌均勻，填入玻璃管中；将铁棒插入玻璃管的一端中，用石蜡固定住，冷却后，除去管外多余杂物，并在光滑纸上抛光表面， 为保证足够大的磁力；玻璃管的另一端电极端为石蜡碳糊薄层，制得固体石蜡碳糊电极； 最后玻璃管石蜡碳糊的薄层的一端碳糊电极在使用前分别用体积比为11的硝酸和无水乙醇清洗，然后用二次蒸馏水冲洗干净；
(2)称取 FeCl3 · 6H20 和 FeSO4 · 7H20,以 Fe2+/Fe3+ =1:2 的摩尔比溶解在二次蒸馏水中得混合溶液，滴加体积百分比为25%的氨水使混合溶液pH = 9 12，室温下搅拌 20 40分钟，然后升温到80°C并保持溶液pH = 9 12不变，加热熟化20 40分钟；制备的黑色悬浮液超声10 30分钟，在磁铁分离下，用热水洗涤到中性得磁性纳米!^e3O4粒子；
(3)称取45-55mg步骤⑵所得的磁性纳米狗304粒子超声分散在15_25mL无水乙醇中，搅拌下加入0. 1 0.3mL体积百分浓度为98% Y -氨丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌反应9 20小时，收集的磁性粒子分别用无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗后定容得氨基化后的磁性纳米!^e3O4粒子；
(4)用磁铁吸住步骤(1)制得的固体石蜡碳糊电极的铁棒端，取步骤C3)制得的氨基化后的磁性纳米!^e3O4粒子滴加在步骤(1)制得的电极表面，晾干后，滴加体积百分浓度为0. 25%的戊二醛在修饰电极表面，放入4°C冰箱1小时后，用水淋洗并吹干，然后滴加葡萄糖氧化酶溶液，放入4°C冰箱中过夜；使用前，把电极置于搅动的蒸馏水中清洗5 10分钟；每次使用后，移去磁铁，用蒸馏水冲洗，洗去磁性纳米复合葡萄糖氧化酶粒子以便更新电极；电极不用时放入4°C冰箱中保存；
(4)检测方法
室温下，选取扫描速率为50mV/s，扫描范围为+0. 2 +1. 4V(vs. SCE)，光电倍增管高压600v，采样速率10T/S，放大级数3，测量时间60s进行循环伏安法试验，测量不同浓度葡萄糖在含0. 5mmol/L鲁米诺的pH为8. 00.的lmol/L硼酸钠缓冲溶液的电致化学发光的强度，绘制工作曲线；葡萄糖在1.0X10—5 1.0X10-2mol/L浓度范围内与电致化学发光峰强度呈良好的线性关系ip = 65. 4C+23.9，相关系数R = 0. 9987，检测限为1 μ mol/L。
本发明克服了现有技术存在过于复杂等诸多缺点，灵敏度高，对于葡萄糖的检测易于自动化。


图1为本发明实施例葡萄糖含量与电致化学发光峰强度ip的关系图。
图2为本发明实施例溶液pH值对电致化学发光峰强度ip的影响。
图3为本发明实施例鲁米诺的含量与电致化学发光峰强度ip的关系图。
具体实施方式
实施例
(1)分别截取铁棒和玻璃管，并把铁棒和玻璃管的两端磨平、洗净；将固体石蜡和碳粉按质量比为3 1比例混合，稍加热至石蜡熔化，搅拌均勻，填入玻璃管中；将铁棒插入玻璃管的一端中，用石蜡固定住，冷却后，除去管外多余杂物，并在光滑纸上抛光表面，为保证足够大的磁力；玻璃管的另一端电极端为石蜡碳糊薄层，制得固体石蜡碳糊电极；最后玻璃管石蜡碳糊的薄层的一端碳糊电极在使用前分别用体积比为11的硝酸和无水乙醇清洗，然后用二次蒸馏水冲洗干净；
(2)称取 FeCl3 ·6Η20 和 FeSO4 ·7Η20，以 Fe2+/Fe3+ =1:2 的摩尔比溶解在二次蒸馏水中得混合溶液，滴加体积百分比为25%的氨水使混合溶液pH = 11，室温下搅拌30分钟，然后升温到80°C并保持溶液pH = 11不变，加热熟化30分钟；制备的黑色悬浮液超声 20分钟，在磁铁分离下，用热水洗涤到中性得磁性纳米!^e3O4粒子；
(3)称取48mg步骤⑵所得的磁性纳米狗304粒子超声分散在20mL无水乙醇中， 搅拌下加入0. 2mL体积百分浓度为98 % γ -氨丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌反应12小时，收集的磁性粒子分别用无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗后定容得氨基化后的磁性纳米 Fe3O4粒子；
(4)用磁铁吸住步骤(1)制得的固体石蜡碳糊电极的铁棒端，取步骤C3)制得的氨基化后的磁性纳米I^e3O4粒子滴加在步骤(1)制得的电极表面，晾干后，滴加体积百分浓度为0. 25%的戊二醛在修饰电极表面，放入4°C冰箱1小时后，用水淋洗并吹干，然后滴加葡萄糖氧化酶溶液，放入4°C冰箱中过夜。使用前，把电极置于搅动的蒸馏水中清洗8分钟。每次使用后，移去磁铁，用蒸馏水冲洗，洗去磁性纳米复合葡萄糖氧化酶粒子以便更新电极。电极不用时放入4°C冰箱中保存。
(4)检测方法
室温下，选取扫描速率为50mV/s，扫描范围为+0. 2 +1. 4V(vs. SCE)，光电倍增管高压600v，采样速率10T/S，放大倍数3，测量时间60s进行循环伏安法试验，测量不同浓度葡萄糖在含0. 5mmol/L鲁米诺的0. lmol/L硼酸钠缓冲溶液(pH 8. 0)的电致化学发光的强度，绘制工作曲线，其结果见附图1。葡萄糖在1X10—5 1.0X10-2mol/L浓度范围内与电致化学发光强度呈良好的线性关系ip = 65. 4C+23. 9，相关系数R = O. 9987，检测限为 1 μ mol/L0
pH值和温度的影响
鲁米诺的ECL反应需在碱性条件下进行(pH 8. 5 10. 0)，考虑到葡萄糖氧化酶的生物活性受PH值影响较大，本文考察了 pH = 7. 0 9. 5的范围内，电致化学发光强度的变化。在鲁米诺浓度为0. lmmol/L，葡萄糖浓度为lmmol/L时，pH值的影响结果见附图2。从图中可以看出，当pH = 8. 0时，鲁米诺的ECL强度最大，实验选择测定在pH = 8. 0的硼酸钠缓冲溶液中进行。
同时，酶的催化活性与温度也有很大关系，实验用集热式恒温加热磁力搅拌器控制水浴温度，考察了 20 60°C范围内酶电极的电流响应，发现当温度达到40°C时，电流响应最大，随着温度的升高，电流有下降的趋势。考虑到温度过高，葡萄糖氧化酶因变性而影响酶电极的使用寿命，实验均在室温25°C下进行。
鲁米诺的浓度的影响
固定其他条件不变，在0. 01 1. 2mmol/L范围内考察了鲁米诺的浓度对电致化学发光强度的影响。所得结果见附图3。由图可见，葡萄糖浓度是lmmol/L时，随着鲁米诺的浓度由0. Olmmol/L增大到0. 5mmol/L时，溶液的ECL值快速增大，当鲁米诺的浓度大于 0. 5mmol/L时，ECL的强度趋于平稳。因此，实验中鲁米诺的用量为0. 5mmol/L。
电极在分析测试中的应用
对人血清中葡萄糖的含量进行了测定，结果表明，该方法和医院采用的临床分析方法所得结果相吻合。为进一步验证该方法的准确性，采用标准加入法测定了样品的回收率，结果见表1。可见，该方法用于临床样品的分析测定，结果令人满意。
表1 人血清中葡萄糖的测定及回收率试验结果(n = 5)
权利要求
1. 一种测定痕量葡萄糖的方法，其特征在于具体步骤为(1)分别截取铁棒和玻璃管，并把铁棒和玻璃管的两端磨平、洗净；将固体石蜡和碳粉按质量比为2 4 1比例混合，稍加热至石蜡熔化，搅拌均勻，填入玻璃管中；将铁棒插入玻璃管的一端中，用石蜡固定住，冷却后，除去管外多余杂物，并在光滑纸上抛光表面，为保证足够大的磁力；玻璃管的另一端电极端为石蜡碳糊薄层，制得固体石蜡碳糊电极；最后玻璃管石蜡碳糊的薄层的一端碳糊电极在使用前分别用体积比为11的硝酸和无水乙醇清洗，然后用二次蒸馏水冲洗干净；(2)称取FeCl3·6Η20和FeSO4 ·7Η20，以Fe2+/Fe3+ =1:2的摩尔比溶解在二次蒸馏水中得混合溶液，滴加体积百分比为25%的氨水使混合溶液pH = 9 12，室温下搅拌20 40分钟，然后升温到80°C并保持溶液pH = 9 12不变，加热熟化20 40分钟；制备的黑色悬浮液超声10 30分钟，在磁铁分离下，用热水洗涤到中性得磁性纳米!^e3O4粒子；(3)称取45 55mg步骤⑵所得的磁性纳米狗304粒子超声分散在15_25mL无水乙醇中，搅拌下加入0. 1 0.3mL体积百分浓度为98% Y -氨丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌反应9 20小时，收集的磁性粒子分别用无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗后定容得氨基化后的磁性纳米!^e3O4粒子；(4)用磁铁吸住步骤(1)制得的固体石蜡碳糊电极的铁棒端，取步骤C3)制得的氨基化后的磁性纳米!^e3O4粒子滴加在步骤(1)制得的电极表面，晾干后，滴加体积百分浓度为 0. 25%的戊二醛在修饰电极表面，放入4°C冰箱1小时后，用水淋洗并吹干，然后滴加葡萄糖氧化酶溶液，放入4°C冰箱中过夜；使用前，把电极置于搅动的蒸馏水中清洗5 10分钟；每次使用后，移去磁铁，用蒸馏水冲洗，洗去磁性纳米复合葡萄糖氧化酶粒子以便更新电极；电极不用时放入4°C冰箱中保存；(4)检测方法室温下，选取扫描速率为50mV/s，扫描范围为+0. 2 +1. 4V(vs. SCE)， 光电倍增管高压600v，采样速率10T/S，放大级数3，测量时间60s进行循环伏安法试验，测量不同浓度葡萄糖在含0.5!1111101/1鲁米诺的？!1为8.00.的lmol/L硼酸钠缓冲溶液的电致化学发光的强度，绘制工作曲线；葡萄糖在1.0\10-5 1.0\10-2!1101/1浓度范围内与电致化学发光峰强度呈良好的线性关系ip = 65. 4C+23. 9，相关系数R = O. 9987，检测限为 1 μ mol/L0
全文摘要
本发明公开了一种用磁性纳米粒子固定葡萄糖氧化酶测定痕量葡萄糖的方法。在碳糊电极表面，通过磁性纳米粒子而修饰固定在电极表面的葡萄糖氧化酶氧化溶液中的葡萄糖生成双氧水，双氧水与鲁米诺溶液形成电致化学发光体系。该体系在电极电压的作用下产生非常强的电致化学发光信号和电化学信号。光信号强度在一定范围内与溶液中的葡萄糖浓度成正比。据此建立了一种测定葡萄糖的电致化学发光分析方法。在+0.2～+1.4V(vs.SCE)电位范围内进行循环伏安扫描，葡萄糖在1×10-5～1.0×10-2mol/L浓度范围内与电致化学发光峰强度ip呈良好的线性关系。本发明克服了现有技术存在过于复杂等诸多缺点，灵敏度高，对于葡萄糖的检测易于自动化。
文档编号G01N21/76GK102495047SQ20111039100
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者李建平, 熊志刚 申请人:桂林理工大学