专利名称：一种基于强度差分的三维超分辨显微方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明属于光学显微领域，特别涉及一种基于强度差分的三维超分辨显微方法和装置。
背景技术：
常规光学显微镜的分辨率由于受到光学衍射极限的影响，一般很难小于200nm,因此无法对纳米量级的样品进行观测，从而限制了其在纳米技术和生物技术中的应用。近年来，为了突破光学衍射极限的限制，研究人员们提出了多种超分辨显微方法，包括受激发射损耗显微术(STED!Stimulated Emission Depletion Microscopy):利用荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系，并通过限制受激辐射衰减的区域，减少突光光斑大小，获得小于衍射极限的发光点来提高系统分辨率，从而突破远场光学显微术的衍射极限分辨力限制来实现无接触三维成像；结构光照明显微术(SIMStructured Illumination Microscopy):将多重相互衍射的光束照射到样品上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息，通过衍射放大作用，得到清晰的超分辨图像；光激活定位显微术(PALMPhotoactivated localization Microscopy):米用光敏蛋白质标记样品，并且用超低光强的激活光使得每次只有极少数的光敏蛋白质被敏化，因此只有极少数的光敏蛋白被激发发射荧光。记录单个荧光分子所发出的光子直至漂白并通过PSF数字化计算出中心位置。反复这一过程逐个获取样品上所有荧光分子的中心位置，最后叠加重构成一幅完整的图像；以及随机光场重建显微术(STORMStochastic Optical ReconstructionMicroscopy):与PALM基本原理类似，利用荧光分子的随机逐个激发发射荧光光子，通过PSF的数字化获得其中心位置。以上几种方法均已被实验证明可以在远场实现超衍射极限的空间分辨率，但是各自都还存在着不足。STED和SM对系统设备的要求很高，系统的造价非常昂贵；ST0RM和PALM的成像速度还比较慢，无法满足实时检测的需求。

发明内容
本发明提供了一种基于强度差分的三维超分辨显微方法和装置，可以在远场实现超衍射极限的横向和轴向分辨率。该种方法和装置具有成像速度快、装置简单、信噪比好等特点，可以很好地应用于荧光及非荧光样品的检测之中。一种基于强度差分的三维超分辨显微方法，包括以下步骤I)控制第一光源处于开启状态,第二光源和第三光源处于关闭状态,所述第一光源发出的第一工作光束准直后转换为第一线偏振光；2)将所述第一线偏振光进行光路偏转，偏转后的第一线偏振光经聚焦和准直后转换为圆偏振光投射到待测样品上，以实现对待测样品的扫描；3)在扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第一信号光强I1U, y，z)，其中X，y，z为扫描点的三维坐标，并生成相应的图像；4)控制第一光源处于关闭状态，第二光源和第三光源处于开启状态，所述第二光源和第三光源发出第二工作光束和第三工作光束分别准直后转换为第二线偏振光和第三线偏振光；5)将所述第二线偏振光和第三线偏振光经位相调制后分别转换为第一调制光束和第二调制光束；6)对所述第一调制光束和第二调制光束进行光路偏转，偏转后的第一调制光束和第二调制光束经聚焦和准直后转换为相应的圆偏振光投射到待测样品上，以实现对步骤3)中的扫描点的二次扫描；；7)在扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第二信号光强I2 (X，y，z)，其中X，y，z为扫描点的三维坐标，并生成相应的图像；8)根据公式 I (X, y, z) = I1 (x, y, z)- y I2 (x, y, z)计算有效信号光强 I (x, y, z),并利用I (x，y，z)得到超分辨图像。当待测样品为荧光样品时，所述信号光为所述照明光斑在样品上激发出的荧光；当待测样品为非荧光样品时，所述信号光为所述照明光斑经样品表面反射的光束。对所述第二线偏振光进行位相调制的调制函数为
权利要求
1.一种基于强度差分的三维超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤 1)控制第一光源处于开启状态，第二光源和第三光源处于关闭状态，所述第一光源发出的第一工作光束准直后转换为第一线偏振光； 2)将所述第一线偏振光进行光路偏转，偏转后的第一线偏振光经聚焦和准直后转换为圆偏振光投射到待测样品上，以实现对待测样品的扫描； 3)在扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第一信号光强I1U, y，z)，其中X，y，z为扫描点的三维坐标，并生成相应的图像； 4)控制第一光源处于关闭状态，第二光源和第三光源处于开启状态，所述第二光源和第三光源发出第二工作光束和第三工作光束分别准直后转换为第二线偏振光和第三线偏振光; 5)将所述第二线偏振光和第三线偏振光经位相调制后分别转换为第一调制光束和第~■调制光束； 6)对所述第一调制光束和第二调制光束进行光路偏转，偏转后的第一调制光束和第二调制光束经聚焦和准直后转换为相应的圆偏振光投射到待测样品上，以实现对步骤3)中的扫描点的二次扫描； 7)在扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第二信号光强I2 (X，y，z)，其中X，y，z为扫描点的三维坐标，并生成相应的图像；8)根据公式I(X, y, z) = I1 (X, y, z)- Y I2 (x, y, z)计算有效信号光强I (x, y, z),并利用I(x，y，z)得到超分辨图像。
2.如权利要求I所述的基于强度差分的三维超分辨显微方法，其特征在于，对所述第二线偏振光进行位相调制的调制函数为/ι(ρ,φ) = φ, 式中Ρ为光束上某点与光轴的距离，炉为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角。
3.如权利要求I所述的基于强度差分的三维超分辨显微方法，其特征在于，对所述第三线偏振光进行位相调制的调制函数为
4.如权利要求3所述的基于强度差分的三维超分辨显微方法，其特征在于，所述第一光源与第二光源和第三光源之间的切换频率为对所述样品进行点扫描频率的两倍。
5.如权利要求3所述的基于强度差分的三维超分辨显微方法,其特征在于,所述第一光源与第二光源和第三光源之间的切换频率与对所述样品进行帧扫描频率相等。
6.如权利要求I所述的基于强度差分的三维超分辨显微方法，其特征在于，当有效信号光强值I (X，1，Z)为负时，设置I (X，y, z) = O，其中X，y, z为扫描点的三维坐标。
7.一种基于强度差分的三维超分辨显微装置，包括，包括第一光源、第二光源、第三光源、承载待测样品的纳米位移台和将光线投射到所述待测样品的显微物镜，其特征在于，还包括 位于所述第一光源的光路上的第一起偏器； 沿所述第二光源的光路依次布置的第二起偏器和第一位相调制器； 沿所述第三光源的光路依次布置的第三起偏器和第二位相调制器； 用于将所述第一光源、第二光源和第三光源的光路上的光线进行偏转的扫描振镜系统； 依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光线进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜； 用于将准直后的光束转换为圆偏振光的1/4波片，所述圆偏振光通过所述显微物镜投射到所述待测样品上； 并设有控制所述第一光源、第二光源、第二光源、纳米位移台和扫描振镜系统的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。
8.如权利要求7所述的基于强度差分的三维超分辨显微装置，其特征在于，所述第一位相调制器的调制函数为
9.如权利要求7所述的基于强度差分的三维超分辨显微装置，其特征在于，所述第二位相调制器的调制函数为Α(ρ,φ)=\ V， 式中P为光束上某点与光轴的距离，炉为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角，R为入射光束的剖面半径。
10.如权利要求7所述的基于强度差分的三维超分辨显微装置，其特征在于，所述显微物镜的数值孔径NA = I. 4。
全文摘要
本发明公开了一种基于强度差分的三维超分辨显微方法，包括以下步骤1)开启共焦成像模式，将第一光源发出的光束转换为第一线偏振光；2)将第一线偏振光投射到待测样品上；3)收集待测样品发出的信号光，得到第一信号光强I1；4)切换为负共焦成像模式，将第二光源和第三光源发出的光束分别转换为第二线偏振光和第三线偏振光；5)将第二线偏振光和第三线偏振光经位相调制后分别转换为第一调制光束和第二调制光束；6)将第一调制光束和第二调制光束投射到待测样品上；7)收集待测样品发出的信号光，得到第二信号光强I2；8)计算有效信号光强I，并得到超分辨图像。本发明还公开了一种基于强度差分的三维超分辨显微装置。
文档编号G01N21/64GK102798622SQ201210293120
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月17日 优先权日2012年8月17日
发明者匡翠方, 李帅, 郝翔, 顾兆泰, 刘旭 申请人:浙江大学