专利名称：甘氨酸诊断/测定试剂盒及甘氨酸的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种甘氨酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定甘氨酸 浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
背景技术：
甘氨酸是一种重要的精细化工中间体，广泛应用于农药、医药、食品、 化肥、饲料等行业。根据甘氨酸的制备工艺和产品的纯度可分为食品级、医 药级、饲料级和工业级四种规格产品。
在20多种氨基酸中，甘氨酸是最简单的一种，它是组成蛋白质的一种成 分，为非人体必需氨基酸。《食品添加剂使用卫生标准》规定，甘氨酸允许 使用的范围为调味料和豆奶，最大使用量是lg/kg。国家质检总局日前进行 的一项专项监督检査结果表明，国内部分乳饮料企业为提高产品中蛋白质含 量，在生产加工中违规使用价格低得多的甘氨酸代替奶粉，个别企业问题严 重。据业内人士介绍，使用甘氨酸替代奶粉，可以使产品成本至少减少一半。 人体若摄入甘氨酸的量过多，不仅不能被人体吸收利用，而且会打破人体对 氨基酸的吸收平衡而影响其它氨基酸的吸收，导致营养失衡而影响健康。
目前各地方的检测标准均采用氨基氮测定法测定甘氨酸含量。较新的方 法，采用HPLC法(高效液相色谱柱后衍生法)测定其中的甘氨酸。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶双倍扩增法(Enzymatic Doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶联法 (Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定甘氨酸浓度的方法，同时，本发明 还将给出用以实现该方法的甘氨酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在 紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行甘氨酸浓度测定，而且测 定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明甘氨酸浓度测定方法原理如下
甘氨酸+2-酮戊二酸甘氨酸转氨酶乙醛酸十L-谷氨酸 L-谷氨酸+水+辅酶谷氨酸脱氢酶氨离子+2-酮戊二酸
+还原型辅酶
肌苷单磷酸+氨+辅酶鸟苷单磷酸还原酶鸟苷单磷酸+
还原性辅酶
这种方法应用甘氨酸转氨酶(glycine transaminase; EC2.6丄4)偶联谷氨 酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase; EC 1.4.1.2; EC 1.4.1.3)、鸟苷单磷酸 还原酶(Guanosine 5'-phosphate reductase; EC 1.7.1.7)酶f足反应速率比色f去 /终点法。甘氨酸转氨酶酶解甘氨酸反应产生谷氨酸，再通过偶联谷氨酸脱氢 酶、鸟苷单磷酸还原酶的作用，最终二次将辅酶(在340nm处没有吸收峰) 还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，灵敏度增加二倍；从而得以 测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸 光度上升的程度/速度，可以测算甘氨酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明甘氨酸诊断/测定试剂盒 较为理想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L甘氨酸转氨酶 10000 U/L
谷氨酸脱氢酶 12000 U/L
鸟苷单磷酸还原酶 12000 U/L
2-酮戊二酸 12mmol/L 鸟苷单磷酸 12mmol/L 本发明的甘氨酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、甘氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸 还原酶、2-酮戊二酸、鸟苷单磷酸。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、2-酮戊二酸、鸟苷单磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、甘氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还 原酶。
辅酶、甘氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶、2-酮戊二酸、 鸟苷单磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、辅酶、2-酮戊二酸、鸟苷单磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶。试剂3
缓冲液、稳定剂、甘氨酸转氨酶。
辅酶、甘氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶、2-酮戊二酸、 鸟苷单磷酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干 粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定甘氨酸浓度的方法，其辅酶可 以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的甘氨酸诊断/测定试剂为单试剂， 三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 辅酶
甘氨酸转氨酶
包括
100 mmol/L 500 mmol/L 3 mmol/L 10000U/L 12000U/L
鸟苷单磷酸还原酶 12000 U/L
2-酮戊二酸 12 mmol/L
鸟苷单磷酸 12mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟，起始吸光度 《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂的 体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓 度大小。 实施例二
本实施例的甘氨酸诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂l
三(羧甲基)氨基甲垸—盐酸缓冲液 稳定剂 辅酶
2-酮戊二酸 鸟苷单磷酸 试齐U 2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂
甘氨酸转氨酶
谷氨酸脱氢酶 鸟苷单磷酸还原酶
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度 《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂1、 试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大 约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 12 mmol/L 12 mmol/L
100 mmol/L 50 mmol/L 10000U/L 12000 U/L 12000 U/L仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓
度大小。
实施例三
本实施例的甘氨酸诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂l
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂 辅酶
2-酮戊二酸
鸟苷单磷酸 试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂
谷氨酸脱氢酶 鸟苷单磷酸还原酶 试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
甘氨酸转氨酶
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三；
测定甘氨酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37t:,反应时间 IO分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测 甘氨酸样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正 反应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 12 mmol/L 12 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 12000 U/L 12000U/L
100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L
:试剂，可以直接使用加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析
仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓 度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的测定方法均能达到本 发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0021;吸 光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(RX).99)线形 范围可达10.98 mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±6%; 试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2.5%;试剂的灵敏度可 达0.0897土 0.0510 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围 宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种酶双倍扩增法、酶比色法及酶联法的甘氨酸的浓度测定方法，其方法原理如下甘氨酸+2-酮戊二酸 <u>甘氨酸转氨酶</u> 乙醛酸+L-谷氨酸L-谷氨酸+水+辅酶 <u>谷氨酸脱氢酶</u> 氨+2-酮戊二酸 +还原型辅酶肌苷单磷酸+氨+辅酶 <u>鸟苷单磷酸还原酶</u> 鸟苷单磷酸+ 还原性辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出甘氨酸的浓度大小测定结果。
2. —种甘氨酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括-缓冲液20———500 mmol/L稳定剂1——4000 mmol/L辅酶1——6 mmol/L甘氨酸转氨酶1000-——80000 U/L谷氨酸脱氢酶iooo-——80000 U/L鸟苷单磷酸还原酶iooo-——謹00 U/L2-酮戊二酸1——50 mmol/L鸟苷单磷酸1——50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、甘氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶、2-酮戊二酸、鸟苷单磷酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、甘氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶、2-酮戊二酸、鸟苷单磷酸组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳 定剂、辅酶、2-酮戊二酸、鸟苷单磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、 甘氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶组成。辅酶、甘氨酸 转氨酶、谷氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶、2-酮戊二酸、鸟苷单磷酸 在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，'其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、甘氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸 还原酶、2-酮戊二酸、鸟苷单磷酸组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳 定剂、辅酶、2-酮戊二酸、鸟苷单磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、 谷氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、甘 氨酸转氨酶组成。辅酶、甘氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还 原酶、2-酮戊二酸、鸟苷单磷酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以 不限。
6. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定 齐U mmol/L或0.1°/。-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶双倍扩增法、酶比色法及酶联法技术的甘氨酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定甘氨酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、2-酮戊二酸、鸟苷单磷酸、甘氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464280SQ20071019143
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司