专利名称：猪瘟阴、阳性血清标准物质及其制备方法
技术领域：
本发明涉及猪瘟阴性血清阳性血清标准物质及其制备方法，属于标准物质技术和 兽用生物制品技术领域。
背景技术：
猪瘟(ClassicalSwine Fever，CSF)是由猪癌病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一种高度接触性、致死性的猪传染病，在世界上很多国家和地区均有发 生，给畜牧业生产带来了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为法定通报 性疫病，我国将其划为一类动物传染病。因此，猪瘟研究和防制受到了世界范围内的广范 重视，我国也不例外。但由于猪瘟病毒感染细胞后不引起细胞病变，且病毒增殖滴度较低， 因此病毒检测、产品检验、科学研究等难度加大，实验结果易受人员的经验、能力以及实验 设施、环境的影响而存在较大误差，严重制约了猪瘟的防控，因此亟需使用标准物质作为客 观、公正的标尺，用于产品质量控制、科学研究与实验室诊断的参照以及实验室之间的能力 比对。然而，猪瘟阴性血清和阳性血清标准物质的质量要求高，制备方法和检验、标定方法 严格，有关制备程序和标定方法至今未见报道。

发明内容
本发明的目的是建立一种制备猪瘟阴性血清和阳性血清标准物质的方法，并制备 出合格的猪瘟阴性血清和阳性血清标准物质。本发明包括以下技术方案1.本发明所述的猪瘟阴性血清、阳性血清标准物质包括(1)猪瘟阴性血清标准物质；(2)阳性血清标准物质中有包括弱阳性猪瘟血清、中等阳性猪瘟血清和强阳性 猪瘟血清系列标准物质；(3)猪瘟阴性血清、阳性血清标准物质中不含有口蹄疫、伪狂犬病、猪繁殖与呼吸 综合征、猪细小病毒病、牛病毒性腹泻/粘膜病抗体；(4)本发明所涉及的猪瘟阴性血清、阳性血清标准物质是经过不同单位的协作标 定并统计分析定值的。2. 一种猪瘟阴性血清、阳性血清标准物质的制备方法，包括以下技术步骤(1)标准物质候选物(简称候选物)的制备1)猪瘟阴性血清和阳性血清标准物质是用口蹄疫、伪狂犬病、猪瘟、猪繁殖与呼吸 综合征、猪细小病毒病、牛病毒性腹泻/粘膜病的抗原、抗体阴性猪制备的；2)使用CVCC AV1411、CVCC AV03和CVCC AV22猪瘟病毒分别接种猪按常规方法 制备的猪瘟病毒血毒和猪瘟活疫苗作为制备猪瘟阳性血清的免疫原；3)猪瘟阴性血清由阴性猪直接采血按常规法制备；猪瘟弱阳性血清由阴性猪免 疫猪瘟疫苗2周后采血按常规法制备血清；猪瘟中等阳性血清由阴性猪免疫猪瘟活疫苗，2周后注射猪瘟混合血毒，2周后采血按常规法制备血清；猪瘟强阳性血清由阴性猪免疫猪 瘟活疫苗2周后，每隔2周反复注射猪瘟混合血毒3 5次后采血按常规法制备血清；4)将血清用6tlCo-Y射线辐照处理；再将血清先用0.4μπι无菌滤膜加压过滤，最 后用0. 22 μ m无菌滤膜加压过滤；5)候选物的检验对候选物进行无菌检验和效力检验，效力检验采用细胞中和试 验、兔体中和试验和ELISA试验中任何一种方法；6)将血清无菌分装至Iml灭菌长安瓿中，在分装过程中一直用搅拌子低速混勻， 分装精度为士0.01ml ；再冷冻、真空干燥后出箱，立即抽真空，火焰熔封；2.标准物质的检验将血清进行物理性状检验、无菌检验，安全检验，特异性检验，均一性检验，支原体 检验，剩余水分测定和用细胞中和试验、兔体中和试验和ELISA试验测定的效力检验；3.标准物质的协作标定和定值将该血清分发至国内相关机构进行协作标定，最后将各单位标定的数值进行统计 分析、定值。本发明的详细描述一种猪瘟阴性血清和阳性血清标准物质及其制备方法，包括以下技术步骤1.标准物质候选物(简称候选物)的制备(1)动物选择选择口蹄疫、伪狂犬病、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪细小病毒病、牛病毒性腹泻 /粘膜病的病原、抗体阴性(病原用PCR或RT-PCR方法检测，抗体用ELISA方法检测)猪作 为血清制备动物。(2)免疫原制备1)猪瘟活疫苗国内生产的商品疫苗。2)用猪瘟病毒石门株(CVCC AV1411)、03 株(CVCC AV03)和 22 株(CVCC AV22)作 为种子病毒(来自中国兽医药品监察所)，按常规方法分别制取3个毒株的猪瘟血毒(中华 人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二〇〇〇年版.化学工业出版社， 2000，259)，-200C以下冻存，使用时按等量混合成3个毒株的混合血毒(本发明称“猪瘟混
合血毒”)。抗原检验按照《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国 兽药典二〇〇五年版三部.中国农业出版社，2005，以下称《中国兽药典》)进行检验，应符 合纯粹检验、安全检验规定。(3)免疫1)阴性血清制备阴性猪不免疫，按常规方法直接采血制备血清。2)弱阳性血清标准物质制备用猪瘟活疫苗2头份免疫接种猪，2周后采血按常 规方法制备血清。3)中等阳性血清制备用猪瘟活疫苗2头份免疫接种猪，2周后，肌肉注射猪瘟混 合血毒100ml，2周后采血按常规方法制备血清。4)强阳性血清制备用猪瘟活疫苗2头份免疫接种猪，每隔2周反复注射(3 5 次)猪瘟混合血毒，每次注射200 300ml，最后采血按常规方法制备血清。
(4)血清处理将血清用6tlCo-γ射线辐照处理；再将血清先用0.4 μ m无菌滤膜加压过滤，最后用 0. 22 μ m无菌滤膜加压过滤。(5)候选物的检验对候选物进行无菌检验和效力检验，效力检验采用细胞中和 试验、兔体中和试验和ELISA试验中任何一种方法；(6)分装、冻干、熔封将血清无菌分装至Iml灭菌长安瓿中，在分装过程中一直用搅拌子低速混勻，分 装精度为士0.01ml ；再冷冻、真空干燥后出箱，立即抽真空，火焰熔封。2.标准物质的检验(1)物理性状检验，要求安瓿内容物呈灰白色团块，加去离子水后在10分钟之内 溶解，溶解后为淡黄色澄明液体。(2)无菌检验，按照《中国兽药典》进行检验，应符合规定。(3)安全检验，要求不致死家兔、豚鼠、小鼠。(4)特异性检验，要求ELISA方法检测为口蹄疫、伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、 猪细小病毒病、牛病毒性腹泻/粘膜病抗体阴性。(5)均一性检验，要求瓶内、瓶间无显著差异。(6)支原体检验，按照《中国兽药典》进行检验，应符合规定。(7)剩余水分测定，按照《中国兽药典》进行检验，应符合规定。(8)真空度检验，按照《中国兽药典》进行检验，应符合规定。(9)效力检验，应测定细胞中和效价、兔体中和效价与ELISA效价。3.标准物质的协作标定和定值将血清分发至国内相关机构进行协作标定；最后将各单位标定的数值进行统计分 析，按照统计学原则剔除异常值并计算效价，最终定值。本发明的积极意义本发明涉及一种猪瘟阴性血清阳性血清标准物质及其制备方法。本发明所涉及的 猪瘟阴性血清阳性血清标准物质是通过利用我国驯化和分离鉴定的猪瘟病毒按照不同免 疫程序免疫阴性猪，采血分离血清，再经过辐照、过滤、分装、冻干、熔封、检验等工艺过程， 并且最终通过协作标定、定值制备而成的。本发明制备的猪瘟阴性血清阳性血清标准物质 制备程序科学、严谨、完善，特异性好，适用范围广，定值准确性高。
实施例本发明的实施例为进一步描述本发明的技术方案，但不构成对本发明的限制。实施例11.候选物的制备(1)动物选择选择口蹄疫、伪狂犬病、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪细小病毒 病、牛病毒性腹泻/粘膜病的病原、抗体阴性(病原用PCR或RT-PCR方法检测，抗体用ELISA 方法检测)猪作为实验动物；(2)抗原制备 将猪瘟病毒石门株(CVCC AV1411)、03株(CVCC AV03)和22 株(CVCC AV22)各1ml，分别肌肉注射3头猪，待猪濒死时颈动脉采血，用玻璃珠脱纤抗凝，-20°C以下冻存；抗原检验按照《中国兽药典》进行检验，结果符合纯粹检验、安全检验规定；(3)按照不同免疫程序制备一系列不同效价的血清1)阴性血清制备阴性猪直接颈动脉采血分离血清。2)弱阳性血清制备阴性猪免疫猪瘟兔化弱毒疫苗2头份，2周后经ELISA抗体 检测试剂盒检测，抗体转为阳性，颈动脉采血分离血清。3)中等阳性血清制备阴性猪免疫猪瘟兔化弱毒疫苗2头份2周后，经ELISA抗 体检测试剂盒检测，抗体转为阳性，肌肉注射猪瘟混合血毒100ml，2周后采血分离血清。4)强阳性血清制备阴性猪免疫猪瘟兔化弱毒疫苗2头份2周后，经ELISA抗体 检测试剂盒检测，抗体转为阳性，每隔2周反复注射猪瘟混合血毒，每次注射200 300ml， 注射3 5次，最后采血分离血清。(4)血清处理将血清用6tlCo- γ射线辐照处理；再将血清先用0. 4 μ m无菌滤膜 加压过滤，最后用0. 22 μ m无菌滤膜加压过滤；(5)候选物的检验对候选物进行无菌检验和效力检验，效力检验采用细胞中和 试验、兔体中和试验和ELISA试验中任何一种方法；(6)分装、冻干、熔封将血清无菌分装至Iml灭菌长安瓿中，在分装过程中一直用 搅拌子低速混勻，分装精度为士0.01ml ；再冷冻、真空干燥后出箱，立即抽真空，火焰熔封；2.标准物质的检验1)物理性状检验随机抽取5支样品，结果所有安瓿内容物呈灰白色团块，加去 离子水后在10分钟之内溶解，溶解后为淡黄色澄明液体；2)无菌检验按照《中国兽药典》进行检验，结果无菌生长；3)安全检验取IOml注射家兔、5ml注射豚鼠、Iml注射小鼠，连续观察10日，均 健活；4)特异性检验用ELISA方法检测，结果为口蹄疫、伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合 征、猪细小病毒病、牛病毒性腹泻/粘膜病抗体阴性；5)均一性检验抽取10支样品，每瓶内取样用ELISA方法检测3次，结果经统计 分析，瓶内、瓶间无显著差异；6)支原体检验按照《中国兽药典》进行检验，结果无支原体生长；7)剩余水分测定按照《中国兽药典》进行检验，结果抽取的4支样品剩余水分均 小于4% ；8)真空度检验按照《中国兽药典》进行检验，所有安瓿均呈现蓝紫色辉光；9)效力检验细胞中和效价分别为0、1:16、1:200、1:3200，兔体中和效价分别为 0、1 8、1 200、1 1600，ELISA 效价分别为 0、1 2、1 100、1 800。3.协作标定和定值(1)协作标定将血清分发至国内相关机构进行协作标定，结果见表1。表1猪瘟阴性血清和阳性血清标准物质协作标定效价 (2)定值将各单位标定的数值进行统计分析，按照统计学原则剔除异常值并计算 效价，最终定值见表2。表2猪瘟阴性血清和阳性血清标准物质定值效价
权利要求
一种猪瘟阴性血清、阳性血清标准物质，其特征在于包括(1)猪瘟阴性血清标准物质；(2)阳性血清标准物质又包括弱阳性猪瘟血清、中等阳性猪瘟血清和强阳性猪瘟血清系列标准物质；(3)猪瘟阴性血清、阳性血清标准物质中不含有口蹄疫、伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪细小病毒病、牛病毒性腹泻/粘膜病抗体；(4)本发明所涉及的猪瘟阴性血清、阳性血清标准物质是经过不同单位的协作标定并统计分析定值的。
2.一种猪瘟阴性血清、阳性血清标准物质的制备方法，其特征在于包括以下技术步骤(1)标准物质候选物的制备1)猪瘟阴性血清和阳性血清标准物质是用口蹄疫、伪狂犬病、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合 征、猪细小病毒病、牛病毒性腹泻/粘膜病的抗原、抗体阴性猪制备的；2)使用CVCCAV1411、CVCC AV03和CVCC AV22猪瘟病毒分别接种猪按常规方法制备 的猪瘟病毒血毒和猪瘟活疫苗作为制备猪瘟阳性血清的免疫原；3)猪瘟阴性血清由阴性猪直接采血按常规法制备；猪瘟弱阳性血清由阴性猪免疫猪 瘟疫苗2周后采血按常规法制备血清；猪瘟中等阳性血清由阴性猪免疫猪瘟活疫苗，2周后 注射猪瘟混合血毒，2周后采血按常规法制备血清；猪瘟强阳性血清由阴性猪免疫猪瘟活 疫苗2周后，每隔2周反复注射猪瘟混合血毒3 5次后采血按常规法制备血清；4)将血清用6tlCo-Y射线辐照处理；再将血清先用0.4μπι无菌滤膜加压过滤，最后用 0. 22 μ m无菌滤膜加压过滤；5)对进行无菌检验和效力检验；6)将检验合格的候选物无菌分装至Iml灭菌长安瓿中，在分装过程中一直用搅拌子低 速混勻，分装精度为士0.01ml ；再冷冻、真空干燥后出箱，立即抽真空，火焰熔封。(2)标准物质的检验对冷冻真空干燥后的将标准物质进行物理性状检验、无菌检验，安 全检验，特异性检验，均一性检验，支原体检验，剩余水分测定和用细胞中和试验、兔体中和 试验和ELISA试验测定的效力检验；(3)标准物质的协作标定和定值将该血清分发至国内相关机构进行协作标定，最后将 各单位标定的数值进行统计分析、定值。
全文摘要
本发明涉及一种猪瘟阴性血清和阳性血清标准物质及其制备方法。本发明所涉及的猪瘟阴性血清和阳性血清标准物质是通过利用我国驯化和分离鉴定的猪瘟病毒按照不同免疫程序免疫阴性猪，采血分离血清，再经过辐照、过滤、分装、冻干、熔封、检验等工艺过程，并且最终通过协作标定、定值制备而成的。本发明制备的猪瘟阴性血清阳性血清标准物质制备程序科学、严谨、完善，特异性好，适用范围广，定值准确性高。
文档编号G01N33/96GK101915850SQ201010237919
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者关孚时, 戴志红, 李翠, 王在时, 蒋卉 申请人:中国兽医药品监察所