专利名称：一种钾离子的荧光检测方法
技术领域：
本发明涉及钾离子的检测领域，特别涉及一种钾离子的荧光检测方法。
背景技术：
钾是人体内不可缺少的常量元素，其作用主要是维持神经、肌肉的正常功能。K+可参与诸如神经脉冲传递和细胞活动调节等生物过程，钾离子的含量是人体生理活动的重要指标，在血液和尿液中的存在水平对临床诊断尤为重要[K0FUJI P，NEWMAN E A. Potassium buffering in the central nervous system[J]. Neuroscience, 2004,129 :1045-1056.], 因此钾离子含量的测定具有重要的意义。目前，钾离子检测的方法很多，如火焰光度法、离子选择性电极法、原子吸收光谱法、电位滴定法等[季国亮，孔晓玲.钾电极在土壤中速效性钾的测定中的应用[J].化学传感器，1997，17(1) :53-58.刘东，张嫦，杨世奎.原子吸收法测定硬醋酸钙中微量钠钾离子的方法研究[J].西南民族学院学报自然科学版，2002， 28(2) =234-235.叶奶义.聚醚多元醇中钾离子的快速测定方法[J].福建化工，2005，(5) 51-54.董丽丽.自动电位滴定法快速测定钾盐中的钾含量[J].分析试验室，2004，23(1) 83-84.]，但这些方法大多操作复杂，离子干扰大，影响因素较多，准确性不够好。核酸适体(Aptamer)是一类通过SELEX技术体外筛选出的对靶分子(Target)具有高度亲和力的一类DNA或RNA分子，具有亲和力高(Kd值在nM-pM)、稳定性好、靶分子范围广、易于合成和修饰等优点，能够满足检测过程中对灵敏度、特异性、操作性、成本等方面的要求。近年发展起来的基于核酸适体的检测方法，在生物学、环境、安全等领域显示了良好的应用前景。目前，基于核酸适体构象变化检测钾离子的方法已有文献报道[UEYAMA H， TAKAGI Μ,ΤΑΚΕΝΑΚΑ S. A novel potassium sensing in aqueous media with a synthetic oligonucleotide derivative. Fluorescence resonance energy transfer associated with guanine quartet-potassium ion complex formation[J]. J Am Chem Soc,2002, 124(48) :14286-14287. HO H A, LECLERC M. Optical sensors based on hybrid aptamer/ conjugated polymer complexes [J] · J Am Chem Soc, 2004,126(5) : 1384-1387.]，但尚存在着灵敏度和选择性不高的缺点，有的需进行DNA双标记，检测成本高，限制了其实际应用。最近 Choi 等[CHOI M S, Υ00Ν Μ, BAEG J 0，KIM J. Label-free dual assay of DNA sequences and potassium ions using an aptamer probe and a molecular light switch complex[J], Chem Commun,2009 :7419-7421.]利用钌配合物和核酸适体实现了 DNA序列和钾离子的双重检测，但方法需在70°C条件下反应且需要在冰水浴中冷却，操作繁琐。

发明内容
本发明的目的是要解决现有技术的缺陷，提供一种高灵敏度和特异性，操作简单的钾离子荧光检测方法。为实现上述目的，本发明的技术方案如下(1)在比色皿中加入缓冲溶液，将钾离子特异性DNA、噻唑橙和待测金属阳离子混合反应，(2)测定荧光强度。本发明所用的缓冲溶液为10-50mM Tris-HCl (pH 7. 0-7. 5)，优选为50mM Tris-HCKpH 7.。4)。本发明中所说的钾离子特异性DNA序列为5，-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3，。当体系中存在钾离子时，能够形成G四面体结构。其浓度为150nM。本发明中所说的待测金属阳离子为钾离子，锂离子，钙离子，镁离子，铵根离子，钠
1 子。本发明中所说的待测金属阳离子浓度为0-10mM。本发明所说的噻唑橙浓度为ΙΟΟηΜ。本发明中所说的钾离子特异性DNA，噻唑橙和待测金属阳离子在25°C _30°C混合反应4分钟。本发明的积极进步效果在于1、本发明只需两步即可完成，大大简化了操作步骤。一般工作者只需通过简单训练即可完成，无需专业工作人员进行操作。2、本发明5分钟之内即可完成检测。大大节约了检测时间。3、本发明无需对DNA进行标记，节约了检测成本。4、本发明具有高度的灵敏度，检测限可达到0. 22 μ M。


图1为根据本发明的方法测定的各种金属阳离子的荧光光谱。其中[噻唑橙]= IOOnM,[钾离子特异性DNA] = 150ηΜ,[钾离子]=[锂离子]=[钙离子]=[镁离子] =[铵根离子]=[钠离子]=ImM。图2为根据本发明的方法测定的不同钾离子浓度的荧光光谱(图2a)和线性动力学范围(图2b，c)。其中[噻唑橙]=IOOnM,[钾离子特异性DNA] = 150nM。图加中钾离子浓度从上到下依次为:0，1，10，30，50，100，300，500，700,900 μ M，2，5，IOmM0 图 2b 和 c 为钾离子的两个线性动力学范围。
具体实施例方式下面根据附图，给出本发明优选的实施例，并予以详细的描述，使能更好地理解本发明的功能、特点。实验仪器所用仪器为荧光分光光度计(LS-55，美国Perkins Elmer仪器有限公司)，仪器测定条件为脉冲式氙灯激发，激发波长为488nm，荧光光谱的扫描范围500-650nm，激发和发射狭缝宽度均为5nm，用宽度IOmm石英比色皿进行测量，样品体积2mL ；室温。作为本发明实施例中试验用材料钾离子特异性DNA序列如下，由Takara公司合成并经HPLC纯化。5’ -GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’分析纯的氯化铵，氯化镁，氯化钙，氯化钠，氯化钾，氯化锂购自国药化学试剂有限
4公司。噻唑橙(Thiazole orange，TO)，结构式如下，购自Sigma-Aldrich公司，使用时用
甲亚砜(DMSO)稀释到所需浓度；所有溶液均用三次蒸馏水配制。
实施例1向比色皿中加入 2mL buffer (50mM Tris_HCl，pH 7. 40)，加入 5μ L 4 Χ1(Γ5Μ 噻唑橙，5 μ L 6 X 10- 钾离子特异性DNA和5μ L 0. 4Μ氯化钾混合均勻在25°C反应4分钟，进行荧光测试。此时各物质最终浓度为[噻唑橙]=ΙΟΟηΜ，[钾离子特异性DNA] = 150nM, [钾离子]=ImM。钾离子加入前后的荧光光谱图如图1所示，钾离子加入前，最大发射波长处的荧光强度为353. 06，钾离子加入后最大发射波长处的荧光强度为151. 42，因此本发明能够定量检测钾离子。实施例2将钾离子换成其它金属阳离子如钙离子，镁离子，锂离子，铵离子，钠离子重复实施例1步骤，结果如图1所示。钙离子，镁离子，锂离子，铵离子，钠离子也能使荧光强度发生降低，但与钾离子相比，降低幅度很小。说明本发明受其它金属阳离子的干扰较小，具有比较好的选择性。实施例3将钾离子浓度换成不同浓度的钾离子重复实施例1步骤，结果如图2所示。说明本发明能够定量检测不同浓度的钾离子。当[噻唑橙]=IOOnM,[钾离子特异性DNA]= 150nM时，钾离子的浓度在1 60 μ M和400 900 μ M范围内与荧光强度呈正比。
[email protected] CH权利要求
1.一种钾离子的荧光检测方法，其包括下列步骤(1)在比色皿中加入缓冲溶液，将钾离子特异性DNA、噻唑橙和噻唑橙和待测金属阳离子混合反应，(2)测定荧光强度。
2.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于缓冲溶液为10-50mMTris-HCl (pH 7. 0-7. 5)。
3.如权利要求1或2所述的荧光检测方法，其特征在于缓冲溶液优选为50mM Tris-HCl (pH7. 4)。
4.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于钾离子特异性DNA序列为 5’ -GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’。
5.如权利要求1或4所述的荧光检测方法，其特征在于钾离子特异性DNA浓度为 150nMo
6.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于待测金属阳离子为钾离子，锂离子， 钙离子，镁离子，铵根离子，钠离子。
7.如权利要求1或6所述的荧光检测方法，其特征在于待测金属阳离子浓度为 O-IOmM0
8.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于噻唑橙浓度为ΙΟΟηΜ。
9.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于钾离子特异性DNA，噻唑橙和待测金属阳离子在25°C -30°C混合反应。
10.如权利要求9所述的荧光检测方法，其特征在于钾离子特异性DNA，噻唑橙和待测金属阳离子在25°C -30°C混合反应4分钟。
全文摘要
本发明公开了一种钾离子的荧光检测方法。钾离子特异性DNA(5’-GGGTTAGGGTTAGGG TTAGGG-3’)在没有钾离子存在时呈无规卷曲状态，荧光染料噻唑橙与富G序列作用产生很强的荧光，加入钾离子后，钾离子特异性DNA形成G四面体结构，荧光下降。本发明不仅具有高度的灵敏度，较好的特异性，而且简单，快速，整个过程能在5分钟内完成。
文档编号G01N21/64GK102183496SQ20111003476
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者徐慧, 柳全文, 陈建农, 高淑丽 申请人:鲁东大学