专利名称：链霉素elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及动物性食品安全和畜牧业生产中药物残留量的检测试剂盒，特别是检测动物性食品和饲料生产中链霉素残留量的试剂盒。
背景技术：
链霉素是氨基糖甙类抗生素，是美国瓦克斯曼研究所1945年研制成功的，临床中主要用于对结核菌感染性疾病的治疗，它的问世结束了结核病无药可医的历史。以后随着新药(如对氨水杨酸、异烟肼、乙胺丁醇、氨硫脲、利福平、吡嗪酰胺、卡那霉素等)的发明和链霉素对人体听力损害的发现，其在治疗结核病上的地位逐渐被取代。但因链霉素对鸡、羊、牛、猪的各类炎症(如鸡传染性鼻炎、猪急性支气管炎、猪白痢、奶牛子宫内膜炎等)有很好的疗效，所以现在经常被添加到动物的饲料中应用于动物疾病的预防和治疗。但凡使用过链霉素的动物，在一定时期内其产品都有残留，因其具有神经毒性和肾脏毒性，所以在动物食品中残留会对人类健康造成威胁和影响，欧美国家及我国均要求对其限量使用。目前，我国对食品中链霉素残留的测定方法有高效液相色谱法(HPLC)、微生物法、酶联免疫吸附法(ELISA)等。采用HPLC法虽然是一种较理想的药物残留分析方法，但链霉素分子中没有紫外发光团和荧光团，在化学分析中需将它转变为具有紫外发光团或荧光团的衍生物才能进行分析，这给检测工作带来了极大困难，而且测定仪器昂贵、操作要求和技术含量高。而微生物检测法是我国近年来才开始的研究，该方法的可靠检测限可达0.1μg/ml，低于国家规定残留量的最高限量0.2μg/ml(链霉素在牛奶中残留检测.郭文欣，王国忠，李朝华等.中国兽药杂志2001，3524～26)。虽然该方法灵敏度高、操作简便、检测结果准确，但其涉及微生物培养，还需培训专门技术人才和建立专用实验室，技术含量仍然很高，一般检测单位很难做到。ELISA法是食品检验的常用方法，但国内用于检测药物残留的研究很少，用于检测链霉素的ELISA试剂盒更是一项空白。
(三)实验新型内容本实用新型目的是提供一种小巧轻便的链霉素残留检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，可进行一次连续多个样品中链霉素含量的测定。
本实验新型的技术方案是采用96孔聚苯乙烯试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被链霉素偶联抗原制成检测板，将40ml浓缩洗涤液、11ml过氧化物酶标记物、6ml链霉素抗体、6ml显色液A剂、6ml显色剂B液、6ml终止液和6瓶500μl不同浓度的标准液，试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与试剂板、盖板膜一同封装在盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96个测定(包括标准分析孔)，即可进行一次连续多个样品的检测。检测时，样本中的残留物(链霉素)将和微孔条上预包被的偶联链霉素抗原竞争抗链霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物(链霉素)的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物(链霉素)的含量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度最低检测限为0.5ppb，回收率牛奶为95％±15％、鸡肉组织为70％±10％、蜂蜜为75％±15％，同双氢链霉素和硫酸链酶素的交叉反映率分别为105％和98％。相对于其他链霉素残留检测，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、匀质器、振荡机和微量加样器，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。
本实验新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于肉类食品和饲料中链霉素残留的检测。


图1为本实验新型酶联板的侧面纵剖面图(长为12.8cm)；图2为本实验新型酶联板的俯视图；图3为本实验新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8.55cm)；图4为本实验新型盖板膜平面图；图5为本实验新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实验新型固定泡沫模具的俯视图。
参见附图酶标反应微孔条(2)预包被链霉素偶联抗原(3)固定于酶联板的外框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶联板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)；白色帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液，白色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装6ml显色液A剂，红色帽(6)的黑色塑料试剂瓶(7)用于封装6ml显色剂B液，链霉素抗体用绿色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装6ml链霉素抗体，黄色帽的白色塑料试剂瓶(8)用于封装6ml终止液，黑色帽的透明玻璃试剂瓶(9)用于封装500μl/瓶的标准液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(11)，6ml显色液A剂瓶位(12)，6ml显色剂B液瓶位(13)，6ml链霉素抗体瓶位(14)，6ml终止液瓶位(15)，6种500μl/瓶各种浓度的标准液瓶位(17)。
本实验新型的实施例1.牛奶中链霉素含量的测定1)样本前处理取牛奶2ml，将其置5000rpm离心10min，去除上层脂肪；取下层1ml，用PH＝7.2，0.02M的PBS-0.1％Tween缓冲液稀释40倍；取50μl进行分析。
2)使用试剂盒的操作步骤①将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒中取出，置室温(20～24℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；②配液将40ml浓缩洗涤液(20倍浓缩)用蒸馏水或去离子水稀释至800ml备用(按需量稀释)；③取出需要数量的已包被抗原的微孔板及框架，将不用的微孔板重新密封，保存于2～8℃不要冷冻；④编号将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔⑤加标准品/样本50μl/孔，然后加一抗工作液50μl/孔，用盖板膜封板，37℃水浴或恒温箱反应30min，取出，每孔加300μl洗涤液，洗板5次，拍干；⑥加酶标二抗每孔加入100μl，用盖板膜盖板后置37℃水浴或恒温箱反应30min。取出，每孔加300μl洗涤液，洗板5次，拍干；⑦显色每孔加入显色剂A液50μl，再加B液50μl，轻轻振荡混匀，37℃水浴或恒温箱避光显色15min；⑧测定每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测)，测定每孔OD值。
3)结果判定有两种方法，定性判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含链霉素量成负相关。
①用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样品1的吸光度值为0.6，样品2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是0ng/ml为1.500；0.5ng/ml为1.380；1.5ng/ml为1.200；4.5ng/ml为0.900；13.5ng/ml为0.700；40.5ng/ml为0.400。则样品1的浓度范围是13.5ng/ml-40.5ng/ml；样品2的浓度范围是1.5ng/ml-4.5ng/ml；②所获得的标准值和样品吸光度值的平均值除以第一个标准(0标准)的吸光度值再乘以100，因此0标准等于100％并以百分比的形式给出吸光度值。计算的标准值绘成为一个对应链霉素浓度(ng/ml)的半对数坐标系统曲线图，相对应每一个样品的浓度(ng/g)可以从校正曲线上读出。
4)测定前的注意事项①使用之前将所有试剂回升至室温20-24℃；②使用之后立即将所有试剂放回2-8℃；③在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点；④在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。
2.鸡肉等组织中链霉素含量的测定1)样本前处理取2g去除脂肪的粉碎样品与8mlPBS-0.1％Tween缓冲液混合5min.加入正己烷5ml充分上下混合10min。静置1h。室温离心15min 10000rpm。用移液器取中间层1ml，加入1ml正己烷，充分振荡5min，离心15min 4000rpm。去除上层，取下层以1∶10倍稀释(50μl上清+450μlPBS-0.1％Tween缓冲液)。组织样品稀释倍数40倍。
2)、3)、4)步骤同实施例1。
3.肝脏样品中链霉素含量的测定1)样本前处理5.0g去除脂肪的粉碎样品与20ml PBS-0.1％Tween缓冲液混合30min。室温离心10min10000rpm。2ml上清与3ml正己烷混合振荡5min。室温离心10min 4000rpm。去除上层脂肪层，用PBS-0.1％Tween缓冲液以1∶10稀释(100μl上清+900μlPBS-0.1％Tween缓冲液)。取50μl水相进行分析。
2)、3)、4)步骤同实施例1。
权利要求1.本实用新型涉及对动物性食品和饲料生产中的链霉素残留的检测试剂盒。包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、12瓶试剂和放试剂的下凹瓶位。其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被链霉素偶联抗原制成的检测板，12瓶试剂分别为标准液、过氧化物酶标记物、链霉素抗体、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求1所述涉及对动物性食品和饲料生产中的链霉素残留的检测试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯板，放于真空铝铂袋内；盖板膜是透明塑料硬膜，放于铝铂袋内；标准液均用黑色帽的透明玻璃瓶，过氧化物酶标记物用红色帽的白色塑料瓶，链霉素抗体用绿色帽的白色塑料瓶，显色剂A液用白色帽的白色塑料瓶，显色剂B液用红色帽的黑色塑料瓶，终止液用黄色帽的白色塑料瓶，浓缩洗涤液用白色帽的半透明塑料瓶；下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述涉及对动物性食品和饲料生产中的链霉素残留的检测试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有12个反应孔，每个反应孔预包被链霉素偶联抗原；盖板膜大小与酶标板一致；标准液6瓶均为(0ng/ml，0.5ng/ml，1.5ng/ml，4.5ng/ml，13.5ng/ml，40.5ng/ml)500μl/瓶，过氧化物酶标记物11ml，链霉素抗体6ml，显色液A液6ml，显色液B液6ml，终止液6ml，浓缩洗涤液40ml。
专利摘要本实用新型是一种涉及动物性食品安全和畜牧业生产中药物残留的检测试剂盒，特别是对动物性食品和饲料生产中链霉素残留的检测试剂盒。由96孔聚苯乙烯酶联板、40ml浓缩洗涤液、11ml过氧化物酶标记物、6ml链霉素抗体、6ml显色液A液、6ml显色液B液、6ml终止液、6瓶不同浓度的标准液和盖板膜构成。采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物链霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗链霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物链霉素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物链霉素的含量。与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点。
文档编号G01N33/53GK2694277SQ0320617
公开日2005年4月20日 申请日期2003年7月25日 优先权日2003年7月25日
发明者何方洋, 冯才伟, 万宇平, 王兆芹 申请人:北京望尔生物技术有限公司