专利名称：一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸的制备方法
技术领域：
本发明属于免疫化学检测技术领域，具体涉及一种借助胶体金标记显色的免疫层析反应，用来快速检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的诊断试纸的制备方法。
背景技术：
急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是常见的心血管疾病，有较高的发病率及病死率。最新的AMI诊断建议是以心肌坏死标志物为基础指标，结合病史、心电图、影像学改变、PCI、冠脉造影、心肌生化标志物的新诊断标准。心脏型脂肪酸结合蛋白(heart-typefatty acid binding protein, H-FABP)作为心肌损伤标志物，具有较高的敏感性和特异性，正在逐渐得到临床医生的认可，成为AMI 早期诊断的有效指标。H-FABP是一种可溶性细胞质蛋白，特异地存在于心肌组织中，分子量仅为14 15KD，正常人的血浆和尿中几乎不含有H-FABP。当心肌缺血或受损后，H-FABP被迅速释放入血，并原样从肾脏清除、尿液中排出；H-FABP在血中1.4士0.证达峰值，在尿中3士0. 6h 达峰值，可见尿液H FABP与血浆H FABP对早期急性心肌梗塞(AMI)具有同等的诊断价值。目前临床检测H-FABP的手段，均以血清或血浆为检测样本，采用双抗体夹心 ELISA试剂盒等检测方法，检测时间长，采集血样需进行分离处理，易发生溶血现象，不能满足为确定或排除心梗快速提供结果的要求。

发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于通过对心脏型脂肪酸结合蛋白的检测技术研究，提供了一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的诊断试纸及其制备方法。该诊断试纸不仅特异性强，灵敏度高，不需要任何的辅助仪器，而且所需检测样品为尿液，方便患者自行取样，具有无创性的优点；同时，检测时间仅需5分钟，为确定或排除心肌梗死提供了方便快捷的方法，为早期治疗争取了宝贵的时间。本发明的目的是这样实现的一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸， 其特征在于样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附在底板上，金标结合垫放在样品垫上， 在上层覆盖PE标签保护膜组装而成；其中金标结合垫上包被有胶体金标记的H-FABP小鼠单抗；硝酸纤维素膜上分别包被有H-FABP小鼠单抗构成的检测线T线和包被有H-FABP 二抗构成的质控线C线。本发明的目的还可以这样实现所述的金标结合垫上包被有胶体金标记的 H-FABP小鼠单抗的制备方法如下所述的金标结合垫上包被胶体金标记的H-FABP小鼠单抗的制备方法如下(1)取胶体金溶液，用0. IM碳酸钾溶液调整PH为8. 0-9. 0，搅拌5min ；逐滴加入 H-FABP小鼠单抗，继续搅拌30min，加入5 %的牛血清白蛋白使其终浓度为1 %，搅拌15min， 静止Ih后，4°C保存备用；
(2)将上述(1)步骤制备的金标H-FABP抗体结合物在12000rpm、4°C条件下，离心 30min，弃上清液，沉淀物用含BSA、0. 02% NaN3的PB液，将沉淀重悬为原体积的1/10， 4°C保存，将金标H-FABP抗体结合物喷涂于玻璃纤维膜上，室温干燥。(3)将上述⑵步骤制备的金标H-FABP抗体结合物喷涂于玻璃纤维膜上，室温干燥后，将膜用0. 05mol/L PH8. 0-9. 0的TBS浸洗3次，每次3min，用去离子水冲洗一次，浸入 0. 05mol/L PH3. 0-5. 0的柠檬酸缓冲液平衡5min，浸入37°C银染液中20-30min，将膜取出， 用去离子水冲洗，放入定影液lmin，去离子水冲洗，空气干燥。所述的硝酸纤维素膜上包被有H-FABP小鼠单抗构成的检测线T线是将H-FABP小鼠单抗喷涂于硝酸纤维素膜上，室温干燥后作为检测线T线。所述的硝酸纤维素膜上包被有H-FABP 二抗构成的质控线C线是将H-FABP 二抗喷涂于硝酸纤维素膜上，室温干燥后作为质控线C线。所述的底板是PVC板。本发明一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸的制备方法，其特征在于(一)金标结合垫的制备1)胶体金颗粒的制备取0. 01% HAuCl4水溶液100ml，加入1 %枸橼酸三钠水溶液anl，加热煮沸15min-30min，直至颜色变红；室温冷却后加入0. IMol/L K2CO3O. 5ml，混勻即得直径约15nm的胶体金颗粒，4°C保存；2)胶体金与H-FABP小鼠单抗用量比例的确定a、取IOml胶体金溶液，用0. IM碳酸钾溶液调整PH为8. 0-9. 0，搅拌5min，分装10 管，每管Iml ；b、将H-FABP小鼠单抗以0. 005Mol/L pH9. 0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5 μ g/ ml-50y g/ml，分别取1ml，加入上述胶体金溶液中，混勻；对照管只加Iml稀释液；c、5min后，在上述各管中加入0. Iml 10% NaCl溶液，混勻后静置浊，观察结果；d、结果观察，对照管和加入H-FABP小鼠单抗的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入H-FABP小鼠单抗量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变；以稳定Iml胶体金溶液红色不变的最低H-FABP小鼠单抗用量，即为H-FABP小鼠单抗的最低用量；3)胶体金标记H-FABP抗体的制备、纯化a、取IOml胶体金溶液，用0. IM碳酸钾溶液调整PH为8. 0-9. 0，搅拌5min ；逐滴加入H-FABP小鼠单抗继续搅拌30min，加入5%的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1%，搅拌15min，静止Ih后，4°C保存备用；b、纯化将上述胶体金H-FABP抗体结合物在12000rpm、4°C条件下，离心30min。 弃上清液，沉淀物用含BSA、0. 02% NaN3的PB液，将沉淀重悬为原体积的1/10，4°C保存 4)银染色的处理将纯化后的金标H-FABP小鼠抗体结合物喷涂于玻璃纤维膜上， 室温干燥后将膜用0. 05mol/L PH7. 0-9. OTBS浸洗3次，每次;3min，用去离子水冲洗一次，浸入0. 05mol/L PH3. 0-5. 0柠檬酸缓冲液平衡5min，浸入37°C的银染液中20-30min，将膜取出，用去离子水冲洗，放入定影液lmin，去离子水冲洗，空气干燥，4°C保存备用；即得金标结合垫⑵；( 二)包被检测线T线和质控线C线的硝酸纤维素膜的制备将H-FABP小鼠单抗和H-FABP 二抗分别喷涂于硝酸纤维素膜上，室温干燥，作为检测线T线和质控线C线，密封，4°C保存备用；(三)试纸的组装底板从一端依次粘贴样品垫、硝酸纤维素膜，吸收垫，金标结合垫放在样品垫上，然后在上层覆盖PE标签保护膜组装而成。与H-FABP的现有检测方法相比，本发明涉及的检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的诊断试纸条具有如下优点和显著的进步(1)检测样品无需处理以尿液为检测样品，尿液H-FABP含量与血浆H-FABP含量对早期急性心梗(AMI)具有同等的诊断价值，病人可自行采集尿液，且样品可直接进行检测，无需前期处理，省略了以血清或血浆为样本需要对采集血样进行处理的过程，避免了样品处理过程中可能出现的溶血现象导致样品不能使用的问题，具有方便和无创性的优点；(2)检测速度快检测时间只需5分钟，能够快速为诊断提供判断依据；(3)检测准确率高、特异性强采用本发明方法所制H-FABP试纸与H-FABP ELISA 试剂盒分别对113例临床尿样的进行平行检测，对比检测结果表明，试纸检测结果的符合率为97. 35%，特异性为96. 3%。检测结果见表1检测结果表1
_金标免疫层析试纸-
ELISA 法阳性_26_2_
阴性18

图1 心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)检测试纸条的结构示意图1-样品垫2-金标结合垫3-硝酸纤维素膜4-吸收垫5-底板6-检测线T 线7-质控线C线图2 心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)检测试纸条结果判定示意图A阴性B阳性C无效
具体实施例方式本发明所依据的原理是人尿液扩散通过附着红色金颗粒包被的抗体的滤膜，与滤膜中的包被抗体结合，在检测线T线区域内，H-FABP抗原-抗体复合物开始与包被在检测线T线区内的抗体接触，如果尿液中H-FABP浓度大于lOng/ml，在检测线T线区内抗原-抗体复合物被H-FABP单抗捕获，并出现一条可见的红色条带。H-FABP浓度越高，检测线T线区出现色带的速度越快，色带越深。红色金颗粒包被的抗体扩散到质控线C线区域被H-FABP 第二抗体捕获形成质控区红色带。本发明涉及的一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的诊断试纸条，由样品垫1、
6金标结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4、底板5、检测线T线6和质控线C线7组成(参见图1)。本发明涉及的一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的诊断试纸条的制备方法， 包括以下步骤1、胶体金溶液及金标抗体的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，确定胶体金与H-FABP抗体用量的比例，制备金标H-FABP抗体标记物，采用低温超速离心法纯化金标抗体；2、银染色的处理将金标H-FABP抗体喷涂于玻璃纤维膜上，然后用银染液进行染色，定影、干燥；将免疫金用银染色加强后可以使显色信号进一步放大，其灵敏度可与酶联免疫技术相当，从而提高肉眼判断结果的灵敏度和准确性。3、检测线T线和质控线C线的制备H_FABP小鼠单抗和H-FABP 二抗分别喷涂于硝酸纤维素膜上，干燥，作为检测线T线和质控线C线；所述的二抗是指能和抗体结合的抗体，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在。“H-FABP 二抗”可以是兔抗鼠H-FABP单抗，也可以是羊抗鼠H-FABP单抗，本发明采用兔抗鼠H-FABP单抗。4、试纸条的组装将处理好的硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、样品垫、吸收垫等材料按顺序进行粘贴、组装、切条、密封，4°C保存。本发明涉及的一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的诊断试纸的使用方法如下1、将试纸条垂直插入尿液样品杯中，注意不要超过样品垫，至少3秒钟后取出平放于干净的非吸附材料的平面，5分钟观察结果。2、结果判断(参见图2)1)阴性在质控线C线出现一条红色条带，检测线T线未出现红色条带，说明检测样品中无H-FABP存在；2)阳性在检测线T线和质控线C线处，各出现一条红色条带，判定为阳性；3)无效仅在检测线T线显色或在检测线T线和质控线C线均无明显条带出现， 视为试纸条检测无效。质控线C线与检测线T线的色带可因尿中H-FABP含量多少而显现出颜色深浅，当 H-FABP浓度很高时检测线T线很明显，质控线C线可能变得很弱，为正常结果。本发明试纸条特异性试验用本发明试纸条对肌钙蛋白、C反应蛋白标准溶液(浓度均为20ng/ml)、孕妇尿液和H-FABP标准溶液(20ng/ml)进行检测，结果仅H-FABP标准溶液出现明显的检测线和质控线，其余样品检测均为阴性。说明该试纸条具有很好的特异性。本发明试纸条敏感性试验将H-FABP抗原进行1 100倍稀释后，按10倍递减稀释，然后用本发明试纸条对各稀释液分别进行检测，结果显示，最低检出量为1 1000，即lOng/ml。实施例1、胶体金颗粒的制备取0. 01% HAuCl4水溶液100ml，加入1 %枸橼酸三钠水溶液 anl，加热煮沸15min 30min，直至颜色变红。室温冷却后加入0. IMol/L K2CO3O. 5ml，混勻即得直径约15nm的胶体金颗粒，4°C保存。
2、胶体金与H-FABP小鼠单抗用量比例的确定(1)取IOml胶体金溶液，用0. IM碳酸钾溶液调整PH为8. 0-9. 0，搅拌5min，分装 10管，每管1ml。(2)将H-FABP小鼠单抗以0. 005Mol/L pH9. 0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5 μ g/ ml 50μ g/ml，分别取1ml，加入上述胶体金溶液中，混勻。对照管只加Iml稀释液。(3)5min后，在上述各管中加入0. Iml 10% NaCl溶液，混勻后静置2h，观察结果。(4)结果观察，对照管和加入H-FABP抗体的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入H-FABP抗体量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定Iml胶体金溶液红色不变的最低H-FABP抗体用量，即为H-FABP抗体的最低用量，在实际工作中，可适当增加10% 20%。3、胶体金标记H-FABP抗体的制各、纯化①取IOml胶体金溶液，用0. IM碳酸钾溶液调整PH为8. 0-9. 0，搅拌5min ；逐滴加入H-FABP小鼠单抗继续搅拌30min，加入5%的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1%，搅拌15min，静止Ih后，放入4°C冰箱保存备用。②纯化将上述胶体金H-FABP抗体结合物在12000rpm、4°C条件下，离心30min。 弃上清液，沉淀物用含1 % BSA的PB液(含0. 02% NaN3)，PB液即phosphate buffer (磷酸缓冲溶液)，将沉淀重悬为原体积的1/10，4°C保存备用。4、银染色的处理将金标H-FABP抗体喷涂于玻璃纤维膜上，室温干燥后将膜用 0. O5mol/1PH7. 0-9. Otbs 浸洗 3 次(TBS 是指 Tris 缓冲生理盐水(TrisBuffered，Saline, TBS) Tris是三羟甲基氨基甲烷的英文名)，每次3min，用去离子水冲洗一次，浸入0. 05mol/ 1 PH3. 0-5. 0柠檬酸缓冲液平衡5min，浸入37°C的银染液中20-30min。将膜取出，用去离子水冲洗，放入定影液lmin，去离子水冲洗，空气干燥。将免疫金用银染色加强后可以使显色信号进一步放大，其灵敏度可与酶联免疫技术相当，从而提高肉眼判断结果的灵敏度和准确性。5、检测线T线和质控线C线的制备将H-FABP小鼠单抗和H-FABP 二抗分别喷涂于硝酸纤维素膜上，室温干燥，作为检测线τ线和质控线C线，密封，4°C保存备用。6、试纸条的组装将处理好的硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、样品垫、吸收垫等材料按顺序进行粘贴、组装、切条、密封，4°C保存。参见附图1。样品垫1 置于试纸条的前端，用于进样，控制测试液的流速，以保证测试液以均勻的速度流入金标结合垫，使金标抗体与测试液中的H-FABP特异性地结合。所用材质为玻
璃纤维膜。金标结合垫2 是胶体金标记物的承载体，测试液经样品垫流经金标结合垫时，胶体金结合物从金标结合垫上释放下来并与测试液中的H-FABP特异性地结合形成免疫复合物，然后随测试液一起流向硝酸纤维素膜。选用材质为玻璃纤维膜。硝酸纤维素膜3 (NC膜)是最终结果的显示区域，一般有两条线，检测线T线和质控线C线。吸收垫4 置于试纸条的末端，用于控制测试液的吸收量，增大流入试纸条的测试液的量，以冲洗掉NC膜上游离的胶体金结合物，从而减小背景干扰已提高灵敏度。所用材质为植物纤维纸。
底板5 具有承载样品垫，金标结合垫，NC膜和吸收垫的作用，以形成真正的条状， 便于测试操作。选用材质为PVC板，涂布对生物活性分子具有惰性的压敏胶。检测线T线6 将H-FABP小鼠单抗喷涂在硝酸纤维素膜上做为检测线，用于检测测试液中的H-FABP抗原。质控线C线7 将H-FABP 二抗喷涂在硝酸纤维素膜上做为质控线，用于检测胶体金结合物。底板5上依次粘贴样品垫1、金标结合垫2，硝酸纤维素膜3，吸收垫4，金标结合垫 2上包被了 H-FABP抗体一胶体金标记物，硝酸纤维素膜上喷涂H-FABP小鼠单抗做为检测线T线和H-FABP 二抗做为质控线C线。具体制作方法将金标结合垫放在样品垫上面，样品垫粘在底板上、硝酸纤维素膜3 (NC膜)粘贴在底板5上，吸收垫4也贴在底板5上。从左至右依次相互交错2mm粘贴在底板5上、然后在上层覆盖PE标签保护膜组装而成的。切成2-4mm宽的试条，在4°C保存。
权利要求
1.一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸，其特征在于样品垫(1)、硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)依次粘附在底板( 上，金标结合垫( 放在样品垫(1)上，在上层覆盖PE标签保护膜组装而成；其中金标结合垫( 上包被有胶体金标记的H-FABP小鼠单抗；硝酸纤维素膜⑶上分别包被有H-FABP小鼠单抗构成的检测线T线(6)和包被有 H-FABP 二抗构成的质控线C线(7)。
2.根据权利要求1所述的一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸，其特征在于所述的金标结合垫(2)上包被胶体金标记的H-FABP小鼠单抗的制备方法如下(1)取胶体金溶液，用0.IM碳酸钾溶液调整PH为8. 0-9. 0，搅拌5min ；逐滴加入H-FABP 小鼠单抗，继续搅拌30min，加入5 %的牛血清白蛋白使其终浓度为1 %，搅拌15min，静止Ih 后，4°C保存备用；(2)将上述(1)步骤制备的金标H-FABP抗体结合物在12000rpm、4°C条件下，离心 30min,弃上清液，沉淀物用含1 % BSA、0. 02% NaN3的PB液，将沉淀重悬为原体积的1/10， 4°C保存，将金标H-FABP抗体结合物喷涂于玻璃纤维膜上，室温干燥。
3.根据权利要求2所述的一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸，其特征在于所述的金标结合垫( 上包被胶体金标记的H-FABP小鼠单抗的制备方法还包括以下步骤(3)将上述( 步骤制备的金标H-FABP抗体结合物喷涂于玻璃纤维膜上，室温干燥后，将膜用0. 05mol/L PH8. 0-9. 0的TBS浸洗3次，每次3min，用去离子水冲洗一次，浸入 0. 05mol/L PH3. 0-5. 0的柠檬酸缓冲液平衡5min，浸入37°C银染液中20-30min，将膜取出， 用去离子水冲洗，放入定影液lmin，去离子水冲洗，空气干燥。
4.根据权利要求1所述的一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸，其特征在于所述的硝酸纤维素膜(3)上包被有H-FABP小鼠单抗构成的检测线T线(6)是将H-FABP 小鼠单抗喷涂于硝酸纤维素膜上，室温干燥后作为检测线T线(6)。
5.根据权利要求1所述的一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸，其特征在于所述的硝酸纤维素膜(3)上包被有H-FABP 二抗构成的质控线C线(7)是将H-FABP 二抗喷涂于硝酸纤维素膜上，室温干燥后作为质控线C线(7)。
6.根据权利要求1-5任一所述的一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸，其特征在于所述的底板(5)是PVC板。
7.—种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸的制备方法，其特征在于(一)金标结合垫O)的制备1)胶体金颗粒的制备取0.01%HAuCl4水溶液100ml，加入枸橼酸三钠水溶液 anl，加热煮沸15min-30min，直至颜色变红；室温冷却后加入0. IMol/L K2CO3O. 5ml，混勻即得直径约15nm的胶体金颗粒，4°C保存；2)胶体金与H-FABP小鼠单抗用量比例的确定a、取IOml胶体金溶液，用0.IM碳酸钾溶液调整PH为8. 0-9. 0，搅拌5min，分装10管， 每管Iml ；b、将H-FABP小鼠单抗以0.005Mol/L pH9. 0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5 μ g/ ml-50y g/ml，分别取1ml，加入上述胶体金溶液中，混勻；对照管只加Iml稀释液；c、5min后，在上述各管中加入0.Iml 10% NaCl溶液，混勻后静置池，观察结果；d、结果观察，对照管和加入H-FABP小鼠单抗的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入H-FABP小鼠单抗量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变；以稳定Iml胶体金溶液红色不变的最低H-FABP小鼠单抗用量，即为H-FABP小鼠单抗的最低用量；3)胶体金标记H-FABP抗体的制备、纯化a、取IOml胶体金溶液，用0.IM碳酸钾溶液调整PH为8. 0-9. 0，搅拌5min ；逐滴加入 H-FABP小鼠单抗继续搅拌30min，加入5%的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1%，搅拌 15min，静止Ih后，4°C保存备用；b、纯化将上述胶体金H-FABP抗体结合物在12000rpm、4°C条件下，离心30min。弃上清液，沉淀物用含BSA、0. 02% NaN3的PB液，将沉淀重悬为原体积的1/10，4°C保存备用；4)银染色的处理将纯化后的金标H-FABP抗体结合物喷涂于玻璃纤维膜上，室温干燥后将膜用0. 05mol/L PH7. 0-9. OTBS浸洗3次，每次3min，用去离子水冲洗一次，浸入 0. 05mol/L PH3. 0-5. 0柠檬酸缓冲液平衡5min，浸入37°C的银染液中20-30min，将膜取出， 用去离子水冲洗，放入定影液lmin，去离子水冲洗，空气干燥，4°C保存备用；即得金标结合垫⑵；(二)包被检测线T线(6)和质控线C线(7)的硝酸纤维素膜(3)的制备将H-FABP小鼠单抗和H-FABP 二抗分别喷涂于硝酸纤维素膜(3)上，室温干燥，作为检测线T线(6)和质控线C线(7)，密封，4C保存备用；(三)试纸的组装底板( 从一端依次粘贴样品垫(1)、硝酸纤维素膜(3)，吸收垫 G)，金标结合垫(2)放在样品垫(1)上，然后在上层覆盖PE标签保护膜组装而成。
全文摘要
一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸，其特征在于样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附在底板上，金标结合垫放在样品垫上，在上层覆盖PE标签保护膜组装而成；其中金标结合垫上包被有胶体金标记的H-FABP小鼠单抗；硝酸纤维素膜上分别包被有H-FABP小鼠单抗构成的检测线T线和包被有H-FABP二抗构成的质控线C线。本发明的诊断试纸不仅特异性强，灵敏度高，不需要任何的辅助仪器，而且所需检测样品为尿液，方便患者自行取样，具有无创性的优点；同时，检测时间仅需5分钟，为确定或排除心肌梗死提供了方便快捷的方法，为早期治疗争取了宝贵的时间。
文档编号G01N33/544GK102226811SQ20111008309
公开日2011年10月26日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者王丽丽, 郭超 申请人:吉林雅强医疗器械有限公司