专利名称：一种改进的免疫共沉淀技术方法
技术领域：
本发明属于免疫检测领域，具体涉及ー种优化的免疫共沉淀技木。本发明在原有的免疫共沉淀技术上，将免疫共沉淀技术与蛋白交联技术结合起来。即利用蛋白交联剂交联抗原抗体复合物，经特异缓冲液洗脱，免疫印迹检测显著降低了实验中抗体重链和轻链的污染，増加了方法的特异性。本发明提高了免疫共沉淀方法的特异性，具有稳定性和可重复性的特点，提高了实验效率，为深入的进行分子生物学，分子肿瘤学、细胞生物学、生物化学等学科的研究提供了有益的帮助。
背景技术：
随着后基因组时代(post genomie era)的来临，生物医学研究已从ー个基因ー个蛋白的假说演绎到在组学水平分析众多基因或蛋白的功能。由于细胞的各种生命活动现象纷繁复杂，全基因组的序列信息并不能诠释细胞的生物功能。而基因的终极产物蛋白才是细胞构成及功能的最终执行者。每个蛋白并不是独立的在细胞中完成所赋予的功能，在细胞复杂结构和高度有序的通路网络中，通常与其它蛋白质相互作用形成大的复合物，而蛋白质与蛋白质之间的相互作用是蛋白质发挥生物功能的重要途径。当前，科学家利用大规模的蛋白质组学技术发展并绘制了广泛的细胞内蛋白质之间相互作用的网络图谱。迄今已发展了多种研究蛋白质相互作用的技术方法，包括酵母双杂交系统、噬菌体展示技木、GST沉降试验(GST pull-down)技术、免疫共沉淀技术和串联亲和纯化联合质谱分析技术,为蛋白质相互作用及蛋白质组学的研究奠定了坚实的基础。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, IP)是以抗体和抗原之间特异性结合为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典技木。主要利用非变性剂裂解完整细胞，維持了细胞内许多蛋白质间的相互作用，便于检测蛋白质之间的相互作用。利用抗蛋白质A的抗体与A形成免疫复合物并沉淀，而细胞内与A稳定结合的蛋白质B同时被沉淀下来。蛋白质B的沉淀是基干与A的物理性相互作用，这种技术被称为免疫共沉淀。该技术利用抗原抗体形成蛋白复合物沉淀，将蛋白质复合物溶解，再通过对抗体的亲和层析将蛋白复合物分离纯化出来，进而通过ニ维电泳。SDS-PAGE或质谱等技术鉴定分离得到的蛋白。其方法相对稳定、方法简便并广泛的应用于细胞生物学、分子生物学和蛋白质组学的科学研究中，免疫共沉淀技术是确定两种蛋白质在细胞生理条件下相互作用的有效方法。但这种经典的技术在实际的操作过程中存在不足，即SDS-PAGE鉴定分离纯化的蛋白中，含有目的蛋白和抗体。由于加样缓冲液中含有巯基こ醇会导致抗体的重链与轻链之间的ニ硫键破坏，从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此，在免疫印迹显色反应中，除了能检测到目的蛋白外，还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(I μ g)，所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时，重链或者轻链分子的免疫印迹信号常常由于重链或者轻链信号过强而影响目的蛋白的检测結果。为了有效的避免实验中重链和轻链对实验造成的影响，很有必要对免疫共沉淀方法进行改进，来提供免疫共沉淀的特异性。

发明内容
为了实现这种改进，申请人对多种技术进行了比较和研究，最后发现将免疫共沉淀技术与蛋白交联技术结合起来，即利用蛋白交联剂交联抗体与蛋白G(pr0tein G)形成的复合物，经特异缓冲液洗脱，免疫印迹检測，能够显著降低实验中抗体重链和轻链的污染，由此改进了免疫共沉淀的特异性。进而完成了本发明。具体地，为了充分展示本发明的改进IP与传统IP的不同之处，申请人针对本领域公知的蛋白结合，包括体凋亡诱导因子(AIF)与肌动蛋白(actin)受体相互作用蛋白(RIP3)与烯醇化酶(ENOl)进行了平行比较，结果发现本发明改进的IP实验能够显著减轻重链和轻链污染，使免疫共沉淀的效果得到显著改善，克服了以往技术中假阴性或者假阳性的結果。进ー步地，本发明提供了如下的改进的免疫共沉淀方法，其包括如下步骤
(I)准备材料(a)提供含有蛋白X-Y结合的双体复合物的待测样品； (b)提供抗蛋白X的抗体；(c)提供固定在微珠上的蛋白G，其中所述固定是共价连接的固定；(d)提供双琥珀酰亚胺辛ニ酸酯(DSS)、甘氨酸和三羟甲基氨基甲烷试剂；(2)将上述(b)的抗体和(C)的蛋白G接触，在合适的条件下使固定在微珠上的蛋白G与抗X抗体的Fe片段物理性結合，得到微珠-蛋白G-抗X抗体的三体复合体，(3)将上述(2)得到的三体复合体与双琥珀酰亚胺辛ニ酸酯(DSS)处理，进行适当的共价交联，形成了微珠-蛋白G-抗X抗体的三体复合体交联物，(4)将上述(3)得到的三体复合体交联物与(a)中的双体复合物在合适的条件下接触，形成微珠-蛋白G-抗X抗体-X-Y五体复合物；通过离心得到该五体复合物，(5)将上述(4)得到五体复合物进行加热变性处理，通过离心，得到含有微珠-蛋白G-抗X抗体的三体复合体交联物的沉淀、含有蛋白X和Y蛋白的上清，(6)将上清进行SDS电泳，进行常规免疫印迹分析(Western blot)。另外一方面，本发明提供的上述改进的免疫共沉淀方法中，步骤⑴的微珠可以是琼脂糖微珠，带有磁性的磁珠，或者是不带有磁性的颗粒；步骤(I)的待测样品可以是细胞裂解液，可以是组织液，体液，血液，蛋白复合物等，可以是含有40-60kD大小，20-30kD大小，55kD或者25kD大小的目的蛋白的组织液，体液，血液，蛋白复合物等。步骤(I)中的固定在微珠上的蛋白G可以是商业购买的，也可以是通过技术手册进行共价固定的。步骤(1)-(6)中任选的加入适当的洗涤步骤，其中洗涤缓冲液可以是PBS和细胞裂解液等本领域常用的缓冲液。步骤(2)中的合适条件是指缓冲液，pH，温度等常规条件，本领域的技术人员完全可以根据公知常识和技术手册进行确定。步骤(3)的共价交联可以使用本领域多种常用的交联剂和交联条件，例如双琥珀酰亚胺辛ニ酸酯(DSS)组成的交联体系，本发明中的交联条件包括DSS交联剂的浓度为5Mm，采用PBS缓冲体系，交联的温度是室温，交联时间可以是30分钟，40分钟，50分钟，60分钟，70分钟，80分钟，90分钟，100分钟，110分钟和120分钟，优选40-120分钟，更优选60-90分钟。以下结合附图对本发明的实施例及效果作进ー步说明。


图I :比较经典与改进的免疫沉淀技术的原理图。图2 :用AIF与actin的相互作用来比较传统IP法和本 发明改进的IP法的印迹结果。图3 :确定最佳抗体和蛋白G最佳交联时间的结果。图4 :利用改进的IP技术发现RIP3蛋白与ENOl的相互作用的印迹結果。为了清楚的阐述本发明，申请人列举了如下的实施例，其中所述例子不用来限制本发明，仅仅用来阐述本发明。实施例I :改进的免疫共沉淀方法与传统IP方法在鉴定AIF与actin的相互作用的比较其步骤如下细胞内总蛋白的提取I. I使用直径IOcm的培养皿培养细胞食管癌细胞系KYSE140细胞(来自日本的一株人食管癌细胞系，由Shimada Y教授，京都大学惠赠)，在含10%胎牛血清的PRM1640培养基中，培养3天，待细胞的融合度达到90%的程度，使用4°C预冷的IXPBS洗细胞，5ml/次X 2次。洗涤后，在细胞培养皿中加入预冷的O. 6ml细胞裂解液，所含成分包括50mM三羟甲基氨基甲烷pH7. 4，150mM氯化钠，1% triton-100 (透膜剂)，O. 1% SDS，并用细胞刮子迅速刮下细胞收集入15ml的离心管中。冰上超声(超声10秒，间隙4秒，共10次)。I. 2将I. I中的超声后的蛋白裂解液分装于两个I. 5ml离心管中，4°C离心，12，000转/分，15分钟。收集上清，Bradford法蛋白定量。I. 3根据I. 2中的定量结果，将蛋白裂解液按照lmg/ml分装到2ml冻存管中，冰上保存。免疫共沉淀时，取l_2mg总蛋白的细胞裂解液进行实验。I.抗体Ab与蛋白G微珠的结合与交联I. I吸取600 μ I PBS，加入抗AIF的抗体(Santa Cruz公司)混匀。加入蛋白G微珠，蛋白G从商业公司订购(美国GE公司)。4°C旋转孵育2小时；4°C低速离心5分钟，弃去上清，留下沉淀，即得到微珠-蛋白G-抗AIF抗体三体复合物；I. 2向2. I中的沉淀中加入PBS进行洗涤，4°C低速离心5分钟X 2次，弃去上清。分成两份，其中一份为对照，除不进行下述2. 3,2. 4之外，其余操作均相同；I. 3向2. 2中得到的微珠-蛋白G-抗AIF抗体三体复合物中加入100 μ 15mM DSS交联缓冲液，其主要成分包括5mM DSS,O. 02M PBS7PH = 7. 4，室温旋转孵育I小时；然后加Λ 100 μ I O. 5Μ三羟甲基氨基甲烷(PH= 7. 4)，用于终止剩余的DSS交联剂，旋转孵育20分钟，4°C低速离心5分钟，弃上清，留取沉淀，即得到微珠-蛋白G-抗AIF抗体三体复合体交联物；对照不进行该步骤。I. 4向上述2. 3得到的三体复合体交联物中，加入4°C预冷的不含蛋白的细胞裂解液Iml进行洗涤，4°C低速离心5分钟X I次，去上清，加入40 μ I的加入4°C预冷的不含蛋白的细胞裂解液，即得到微珠-蛋白G-抗AIF抗体三体复合体交联物，4°C保存备用。2.免疫沉淀(IP)2. I用4°C预冷的含有KYSE140全细胞裂解的蛋白液1ml，分别取O. 5ml含有全细胞裂解的蛋白液加入上述2. I中的对照管中A，另O. 5ml全细胞裂解的蛋白液加入2. 4中含三体复合体交联物的I. 5ml离心管中B，4°C旋转孵育2小时；4°C低速离心5分钟，弃去上清，留下沉淀，即得到微珠-蛋白G-抗AIF抗体-抗原X-Y的五体复合物；2. 2向上述3. I得到的对照管A和微珠_蛋白G-抗AIF抗体-抗原X-Y五体复合体B管中，分别加入4°C预冷的不含蛋白的细胞裂解液Iml进行洗涤，用以洗涤复合物上未结合的蛋白，4°C低速离心5分钟X 3次，弃去上清，留下沉淀。2. 3向上述3. 2得到的对照管A和微珠_蛋白G-抗AIF抗体-抗原X-Y五体复 合体S管中，分别加入50ul IxSDS上样缓冲液，其成分包括O. 12M三羟甲基氨基甲烷、5%甘油、O. 4% SDSU % β-巯基こ醇和O. 02%溴酚蓝，于100°C沸水中变性10分钟，离心，IOOOOgX 5min，收集上清。2. 4SDS电泳，进行免疫印迹检测。SDS电泳上样品包括，KYSE140全细胞裂解的蛋白液、经典IP实验所获的上清、上样抗体、改进IP实验所获上清、IP实验的洗脱上清，经SDS电泳，采用抗AIF抗体、抗Act in抗体和抗PARP抗体的进行常规的免疫印迹检测。实施例I的结果食管癌细胞系KYSE140细胞总蛋白在经过抗AIF抗体的经典免疫共沉淀作为对照，和改进的经蛋白交联步骤的免疫共沉淀后，如图2显示了检测结果，其中泳道1，2中是经典IP实验的結果，泳道中存在大量抗体重链和轻链的污染，如白色箭头所指；3道为上样抗体(Santa Cruz公司)作为抗体轻链和重链的阳性对照；4和5道是改进的IP实验結果，可以明显地看到，经蛋白交联剂交联后，有效的消除了抗体轻链和重链的污染；6和7道为IP实验的洗脱上清。AIF的免疫印迹结果显示,在分子量为67kDa处显示一条特异条带,说明微珠-蛋白G-抗AIF抗体的三联复合体有效的识别了 AIF抗原，免疫亲和沉淀了 AIF抗原，免疫印迹有效的检测到AIF蛋白分子。Actin的免疫印迹结果显示，Actin可与AIF蛋白相互作用，而交联剂没有影响Actin与AIF的相互作用，与文献有报道的AIF可与Actin蛋白相互作用的结果ー致[LoSter K,等人，Chemical cross-linking leads to two high molecular massaggregates of rat alpha I beta I integrin differing in their conformation butnot in their composition. FEBS Lett. 1995，16 ;373 (3) :234-8.付玉荣等，截断型线粒体凋亡诱导因子相互作用蛋白质的筛选与鉴定生物，化学与生物物理学进展2009,36(1)42-48]ο多聚ADP核糖聚合酶(PARP)是ー种定位于细胞核内的蛋白，文献调研结果显示PARP与AIF未见任何相互作用的报道，因此，我们运用上述收集的样品，经SDS电泳，PARP的免疫印迹结果显示，经过经典IP实验(泳道I和2)和改进的IP实验(4和5)，均未见PARP与AIF相互作用的关系。说明上述经过经典IP实验和改进的IP实验均可有效的检测蛋白的相互作用。实施例2 :确定最佳抗体和蛋白G最佳交联时间所有材料和方法与实施例I相同，其中仅仅在交联时间方面进行了改变，分别将实施例I中步骤2. 3的孵育时间变更为50min、60min和90min，其结果于图2的泳道3_5所示。在步骤3. 4中SDS电泳上样品包括，KYSE140全细胞裂解的蛋白液、经典IP实验所获的上清、改进IP实验所获交联50min、60min和90min的上清、IP实验的洗脱上清，经SDS电泳，转膜后，采用抗AIF抗体、抗Actin抗体和抗热休克蛋白60(HSP60)抗体的进行常规的免疫印迹检测。实施例2的结果 食管癌细胞系KYSE140细胞总蛋白在经过抗AIF抗体的经典免疫共沉淀作为对照，和改进蛋白交联步骤的免疫共沉淀，采用30min、60min和90min三个时间点进行交联，如图3所示，TL为细胞总蛋白上样，I道为经典IP实验的結果，泳道中存在大量抗体重链和轻链的污染，如箭头所指；2道为上样抗体作为抗体轻链和重链的阳性对照；3、4和5道是改进的IP实验，经不同时间点50min、60min和90min进行蛋白交联剂交联,有效的消除了抗体轻链和重链的污染；6、7和8道为IP实验的洗脱上清,分别为第一次,第二次和第三次洗脱液。按照上述本发明的改进免疫共沉淀方法，通过改变交联时间，随着交联时间的延长，有效的消除了抗体轻链和重链的污染，确定最佳交联时间点。AIF的免疫印迹结果显示,在分子量为67kDa处显示一条特异条带,说明微珠-蛋白G-抗AIF抗体的三联复合体有效的识别了 AIF抗原，免疫亲和沉淀了 AIF抗原，免疫印迹有效的检测到AIF蛋白分子。Actin的免疫印迹结果显示，Actin可与AIF蛋白相互作用，而交联剂没有影响Actin与AIF的相互作用，与文献有报道的AIF可与Actin蛋白相互作用的结果一致。热休克蛋白60(HSP60)是ー个60kDa，在细胞内高丰度表达的蛋白，占细胞蛋白总量的5% -10%。在胁迫刺激条件下，如热激，热休克蛋白的表达明显升高，可以对细胞起到保护作用。热休克蛋白起“分子伴侶”的作用，可以与其他蛋白结合，协助蛋白的转位、折叠和装配。热休克蛋白在多种疾病中发挥了重要作用[Azem, A等人,Characterization of afunctional GroEL-14(GroES-7)-2chaperonin hetero-oligomer. Science 265:653-656,1994. Schmidt, M 等人，Symmetric complexes of GroE chaperonins as part of thefunctional cycle. Science 265 :656-659,1994.]。文献调研结果显示 HSP60 与 AIF 未见任何相互作用的报道，因此，选用HSP60作为与AIF非特异结合的对照，我们运用上述收集的样品，经SDS电泳，经常规的免疫印迹检测，HSP60的免疫印迹结果显示，经过经典IP实验(泳道I)和改进的IP实验(3、4和5)，均未见HSP60与AIF相互作用的关系。说明上述经过经典IP实验和改进的IP实验均可真实检测了细胞内相互作用的蛋白，避免了非特异结合蛋白。实施例3 :采用改进的免疫共沉淀技术鉴定RIP3蛋白与ENOl的相互作用其步骤如下I.细胞内总蛋白的提取I. I使用直径IOcm的两个培养皿培养细胞食管癌细胞系KYSE140细胞，来自日本的一株人食管癌细胞系，在含10%胎牛血清的PRM1640培养基中，培养I天，待细胞的融合度达到80%的程度。一盘细胞中加入IOuM抗癌药物顺钼处理24小时(B)，另ー盘不做处理作为对照(A)。使用4°C预冷的IXPBS洗细胞，5ml/次X2次。洗涤后，在细胞培养皿中加入预冷的O. 6ml细胞裂解液，所含成分包括50mM三羟甲基氨基甲烷pH7. 4，150mM氯化钠，1% triton-100 (透膜剂)，O. 1% SDS，并用细胞刮子迅速刮下细胞收集入I. 5ml的离心管中，冰上超声(超声10秒，间隙4秒，共10次)。I. 2将I. I中的超声后的蛋白裂解液分装于两个1.5ml离心管中，4°C离心，12，000转/分，15分钟。收集上清，Bradford法蛋白定量。I. 3根据I. 2中的定量结果，将蛋白裂解液按照lmg/ml分装到2ml冻存管中，冰上保存。免疫共沉淀时，取l_2mg总蛋白的细胞裂解液进行实验。
2.抗体Ab与蛋白G微珠的结合与交联2. I吸取600 μ I PBS,加入抗RIP3的抗体(ABCAM公司产品)混匀。加入蛋白G微珠，蛋白G从商业公司订购(美国GE公司)。4°C旋转孵育2小时；4°C低速离心5分钟，弃去上清，留下沉淀，即得到微珠-蛋白G-抗RIP3抗体三体复合物；2. 2向2. I中的沉淀中加入PBS进行洗涤，4°C低速离心5分钟X 2次，弃去上清；2. 3向2. 2中得到的微珠-蛋白G-抗RIP3抗体三体复合物中加入100 μ I 5mMDSS交联缓冲液，其主要成分包括5mM DSS,O. 02M PBS, PH = 7. 4，室温旋转孵育I小时；然后加入100 μ I O. 5Μ三羟甲基氨基甲烷(PH =7. 4)，用于终止剰余的DSS交联剂，旋转孵育20分钟，4°C低速离心5分钟，弃上清，留取沉淀，即得到微珠-蛋白G-抗RIP3抗体三体复合体交联物；对照不进行该步骤。2. 4向上述2. 3得到的三体复合体交联物中，加入4°C预冷的不含蛋白的细胞裂解液Iml进行洗涤，4°C低速离心5分钟X I次，去上清，加入40 μ I的加入4°C预冷的不含蛋白的细胞裂解液，即得到微珠-蛋白G-抗RIP3抗体三体复合体交联物，4°C保存备用。3.免疫沉淀(IP)3. I用4 °C预冷的含有KYSE140全细胞裂解的蛋白液Iml (A)和顺钼处理的KYSE140全细胞裂解的蛋白液(B)，分别取O. 5ml含有全细胞裂解的蛋白液加入2. 4中含三体复合体交联物的I. 5ml离心管中，4°C旋转孵育2小时；4°C低速离心5分钟，弃去上清，留下沉淀，即得到微珠-蛋白G-抗RIP3抗体-抗原X-Y的五体复合物；3. 2向上述3. I得到的微珠-蛋白G-抗RIP3抗体-抗原X-Y五体复合体管中，分别加入4°C预冷的不含蛋白的细胞裂解液Iml进行洗涤，用以洗涤复合物上未结合的蛋白，4°C低速离心5分钟X 3次，弃去上清，留下沉淀。3. 3向上述3. 2得到的微珠-蛋白G-抗RIP3抗体-抗原X-Y五体复合体B管中，分别加入50ul IxSDS上样缓冲液，其成分包括O. 12M三羟甲基氨基甲烷、5%甘油、O. 4%SDSU % β-巯基こ醇和O. 02%溴酚蓝，于100°C沸水中变性10分钟，离心，IOOOOgX 5min，
收集上清。3. 4SDS电泳，进行免疫印迹检测。SDS电泳上样品包括，包含A和B的全细胞裂解的蛋白液、改进IP实验所获得分别包括A和B的上清，经SDS电泳，采用抗RIP3抗体、抗烯醇化酶(ENOl)抗体的进行常规免疫印迹检测。
实施例3的试验结果食管癌细胞系KYSE140细胞总蛋白(A)和经化疗药物顺钼处理的KYSE140全细胞裂解的蛋白液(B)，在经过抗RIP3抗体改进蛋白交联步骤的免疫共沉淀后，常规免疫印迹检测，如图4所示，TL为细胞总蛋白上样，I道为A即食管癌细胞系KYSE140细胞总蛋白；2道为B即经化疗药物顺钼处理的KYSE140全细胞裂解的蛋白液；3道是A经改进的IP实验结果；4道是B经改进的IP实验结果，有效的消除了抗体轻链和重链的污染。按照上述本发明的改进免疫共沉淀方法，有效的消除了抗体轻链和重链的污染，増加了实验的特异性。RIP3的免疫印迹结果显示，在分子量为57kDa处显示一条特异条带，说明微珠-蛋白G-抗RIP3抗体的三联复合体有效的识别了 RIP3抗原，免疫亲和沉淀了 RIP3抗原，免疫印迹有效的检测到AIF蛋白分子。抗烯醇化酶ENOl的免疫印迹结果显示，经过抗RIP3抗体改进蛋白交联步骤的免疫共沉淀后，在分子量为47kDa处显示一条特异条带，为ENOl蛋白分子条带。提示ENOl可 与RIP3蛋白相互作用，而交联剂没有影响ENOl与RIP2的相互作用。利用此改进的IP实验技术，发现了 ENOl可与RIP3蛋白的相互作用。总之通过上述多个实施例证明，本发明的改进的IP方法，能够显著降低重轻链对免疫分析的影响，使用于多种蛋白的免疫分析检测。同时所述的交联步骤非常简便，效果非常明显。
权利要求
1.一种改进的免疫共沉淀方法，其包括如下步骤 (1)准备材料 (a)提供含有蛋白X-Y结合的双体复合物的待测样品； (b)提供抗蛋白X的抗体； (c)提供固定在微珠上的蛋白G，其中所述固定是共价连接的固定； (2)将上述(b)的抗体和(c)的蛋白G接触，在合适的条件下使固定在微珠上的蛋白G与抗X抗体的Fe片段物理性結合，得到微珠-蛋白G-抗X抗体的三体复合体， (3)将上述(2)得到的三体复合体进行适当的共价交联处理，提供微珠-蛋白G-抗X 抗体的三体复合体交联物， (4)将上述(3)得到的三体复合体交联物与(a)中的双体复合物在合适的条件下接触，形成微珠-蛋白G-抗X抗体-X-Y五体复合物；通过离心得到该五体复合物， (5)将上述(4)得到五体复合物进行加热变性处理，通过离心，得到含有微珠-蛋白G-抗X抗体的三体复合体交联物的沉淀、含有蛋白X和Y蛋白的上清， (6)将上清进行SDS电泳,进行常规免疫共沉淀的免疫分析。
2.权利要求I的改进的免疫共沉淀方法，其中，步骤(I)的微珠是琼脂糖微珠、带有磁性的磁珠，或者是不带有磁性的颗粒。
3.权利要求I的改进的免疫共沉淀方法，其中，步骤(I)的待测样品是含有40-60kD大小，20-30kD大小，55kD或25kD大小目的蛋白的待测样品。
4.权利要求I的改进的免疫共沉淀方法，其中，步骤(I)的待测样品是细胞裂解液，选自细胞裂解液，组织液，体液，血液和蛋白复合物。
5.权利要求I的改进的免疫共沉淀方法，其中，步骤(3)的共价交联可以使用本领域多种常用的交联剂和交联条件。
6.权利要求I的改进的免疫共沉淀方法，其中，步骤(3)的交联剂是双琥珀酰亚胺辛ニ酸酷。
7.权利要求I的改进的免疫共沉淀方法，其中，步骤(3)的交联的温度是室温。
8.权利要求I的改进的免疫共沉淀方法，其中，步骤(3)的交联时间选自40-120分钟，50-100分钟和60-90分钟。
全文摘要
本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种优化的免疫共沉淀技术。本发明在原有的免疫共沉淀技术上，将免疫共沉淀技术与蛋白交联技术结合起来。即利用蛋白交联剂交联抗原抗体复合物，经特异缓冲液洗脱，免疫印迹检测显著降低了实验中抗体重链和轻链的污染，增加了方法的特异性。本发明提高了免疫共沉淀方法的特异性，具有稳定性和可重复性的特点，提高了实验效率，为深入的进行分子生物学，分子肿瘤学、细胞生物学、生物化学等学科的研究提供了有益的帮助。
文档编号G01N33/68GK102692505SQ20111006705
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月21日 优先权日2011年3月21日
发明者乔媛媛, 刘芳, 许杨, 赵晓航, 马首智 申请人:中国人民解放军海军总医院, 中国医学科学院肿瘤研究所