专利名称：基于荧光法的水体藻类光合作用活性原位检测装置及方法
基于荧光法的水体藻类光合作用活性原位检测装置及方法技术领域
本发明属于环境水体污染荧光检测技术，具体是一种基于荧光法的水体藻类光合作用活性原位检测装置及方法。
背景技术：
蓝藻水华暴发与饮用水安全预警是当今世界各国共同关注的热点问题和环境科学难题，虽然相互独立的单个因子难以指示蓝藻水华的发生与否，但是藻类光合作用活性作为影响蓝藻水华的重要参数，我国目前尚缺乏快速有效的在线监测技术与设备。
藻类的光合作用活性在藻类的不同生长阶段直接表征了藻类的生长状况，然而对于藻类不同生长阶段中，藻类光合作用活性、藻浓度以及藻毒素产生与释放行为关系等尚不清楚，实现藻类光合作用活性的快速、原位监测不仅能为研究藻类生长状况与蓝藻水华发生之间的关系，以及提供蓝藻水华暴发及饮用水安全预警的实时监测数据，而且为研究藻类不同生长时期藻类光合作用活性与藻浓度以及藻毒素的产生与释放行为关系提供快速的藻类状态监测手段。
现有的测量技术主要有光声光谱技术和光学遥感技术。光声光谱技术是一种以光声效应为基础的光谱分析检测技术，通过检测物质在吸收辐射后热激发的声波来获取光谱信息。光声光谱技术主要用于研究高等植被的光合作用情况，无法用于水体藻类光合作用活性的快速、原位测量。光学遥感技术是通过物体对光的吸收、反射及吸光后的再发射特性来实现信息的获取，对于植被、地貌及海面等大面积范围的测量具有较大的优势，但对于水体中藻类的光合作用情况，仅能实现水体表面藻类的观测，即藻类在水面的分布或大面积爆发后才能进行，无法用于监测水下藻类生长过程中水质情况的变化。发明内容
针对我国尚缺乏水体藻类光合作用活性快速有效的在线监测技术与设备情况，发明了一种基于荧光法的水体藻类光合作用活性原位检测方法与装置。即利用荧光方法实现水体藻类在不同激发光源作用下的藻类叶绿素荧光信息提取，并进行藻类光合作用活性状态的表征。该方法具有操作方便、快速自动、对分析样品无损等优点，能够实现水体藻类光合作用活性的快速、原位测量，并应用于不同的水流域(近海水体，湖、库水源地等)及不同深度水体的实时、原位监测。
本发明的技术方案如下
基于荧光法的水体藻类光合作用活性原位检测装置，包括有LED灯阵列、透光的水体样品以及控制电路，其特征在于所述的LED灯阵列的出射光前方光路中依次设有透镜组、可见光滤波片、第一聚焦透镜、所述水体样品、第二聚焦透镜、带通滤波片，带通滤波片后面设有PMT探测器，LED灯阵列发出的激发光源经过透镜组变成平行光，再经过可见光滤波片滤波、经过第一聚焦透镜聚焦成为一个能量集中的光斑，照射到水体样品，水体激发出的荧光经过第二聚焦透镜与带通滤波片后被光电探测器接收输入后续电路进行处理，可见CN 102539394 A光滤波片滤除可见光G00-700nm)以外波长的光，带通滤波片是仅能通过685nm波长的光， 滤除其它波长的光，只进行该波长的荧光测量。
基于荧光法的水体藻类光合作用活性原位检测方法，其特征在于包括以下步骤
①设有待测量的样品水体，水体中藻类活体受光照射后产生荧光，藻类活体荧光几乎全部来源于光系统II (PSII)的叶绿素a，藻细胞吸收光能后，一部分P用于光合作用， 另一部分D以热的形式耗散到环境中，剩余的部分F以荧光的形式发射出来，根据能量守恒可知P+D+F = 1 ；在样品水体前方设置激发光源，经充分暗适应后，激发光源产生很弱的测量光，只激发藻类细胞色素的本底荧光，不能使藻细胞进行光合作用，测量得到初始荧光 F0 ；光系统II (PSII)，是指藻类细胞的光合作用系统，能将吸收后的光能转换为生长所需要的能量；
②激发光源产生光强足够大的光饱和脉冲光，此时藻细胞的光合作用被完全抑制，荧光迅速上升至最大，测得最大荧光强度Fm ；在打开饱和脉冲光的短暂时间内D/F的比值保持不变即DcZFtl = Dm/Fm，则可由下式计算出PSII的最大光合作用量子产量，P = I-F0-D0 =I-F0-F0 · (I-Fffl)/Fffl = (Fffl-F0)/Fffl, P反映了藻类细胞的潜在最大光合能力；
③激发光源产生光化光，使藻类细胞能够进行正常的光合作用，在光化光打开瞬间，叶绿素荧光迅速上升至一最大值Fp，随后因光合作用与热耗散的影响，荧光逐渐下降， 经一段时间荧光达到一稳定值，测量稳定荧光产量Fs，此时的藻细胞吸收的光能在光合作用、发射荧光、热耗散能间达到动态平衡，这种状态称为光适应状态；
④接着，激发光源产生饱和脉冲光，荧光迅速上升到最大F' m(t)，在光化光和饱和脉冲光共同作用一段时间后，F' m(t)达到一个稳定值F' m，这就是要测量的光适应状态下最大荧光产量；据此可求得PSII的实际量子产量ΦΡΜΙ= (F' ffl-Fs)/F' ffl；
因此，通过测量计算P和ΦΡΜΙ来表征藻类的最大光合作用活性能力和正常光合作用情况下的光合作用活性。
LED灯阵列通过控制电路按照时序控制不同数量的LED产生需要的光强。
D不需要直接测量，主要是根据产生荧光的状态来分析(D与荧光产量有一基本固定的关系)；通过改变不同的光强，测量只能产生本底荧光，产生最大荧光抑制光合作用， 还是能进行光合作用情况下的荧光测量来进行分析。
测量光光强约为0. Ιμπιο ^nT2s-1,只能激发藻细胞色素的本底荧光，不足以引起藻细胞产生光合作用；(比如夜间，光线太弱，不能进行光合作用)
饱和脉冲光光强大于10000 μ mol · πΓ2^1，藻细胞产生光合作用的电子门被完全关闭，藻细胞的光合作用被完全抑制；
光化光光强约6000 μ mol ^nT2iT1,藻细胞能够进行正常的光合作用。(比如白天， 能够进行正常的光合作用)
可见光滤光片是滤除可见光G00-700nm)以外波长的光，作用是减小这个范围以外的光对藻类细胞激发时带来的影响；带通滤波片是仅能通过685nm波长的光，作用是滤除其它波长的光，只进行该波长的荧光测量。
本发明通过测量藻类在不同激发光源作用下发出的荧光信息实现对藻类光合作用活性状态的表征，本发明适用于水体藻类的在线原位分析、实验取样分析，也可以用于高等植物叶片的光合作用活性测量。
与现有技术相比，本发明的特点简述如下
1、以荧光光谱的高选择性和高灵敏度，实现水体藻类光合作用活性的快速、原位测量，测量结果准确、可靠；
2、以高亮LED作为激发光源，使得测量装置结构简单、价格低廉、易于操作；
3、能够用于水下原位测量，实时给出水体中藻类的光合作用活性状况信息，对藻类生长过程能够进行实时、原位的在线监测，为蓝藻水华爆发提供了实时监测数据。
本发明以高亮LED为激发光源，通过接收不同激发光强作用下藻类的荧光信号实现对藻类光合作用活性状态的表征，为水体藻类光合作用活性的快速、原位测量提供了一种有效的监测手段，装置中采用调制技术解决了荧光信号受外界环境光干扰的问题，以恒流驱动消除了光源强度波动对荧光激发稳定性的影响。具有操作方便、快速自动、对分析样品无损等优点，适用于不同的水流域(近海水体，湖、库水源地等)及不同深度水体的实时、 原位监测，可用作我国环境监测部门对水体藻类生长状况评价的快速监测工具，也可用于科学研究人员实现藻类光合作用活性检测的快速分析仪器，有着非常广阔的应用前景。


图1为本发明水体中藻类光合作用活性测量过程图。
图2本发明装置结构原理框图。
图3本发明装置光路示意图。
图4为水体藻类荧光诱导曲线。
具体实施方式
参见图3，基于荧光法的水体藻类光合作用活性原位检测装置，包括有LED灯阵列、透光的水体样品池以及控制电路，LED灯阵列的出射光前方光路中依次设有透镜组、可见光滤波片、聚焦透镜I、水体样品池、聚焦透镜II、带通滤波片，带通滤波片后面设有PMT 光电检测器，LED灯阵列发出的激发光经过透镜组变成平行光，再经过可见光滤波片滤波、 经过第一聚焦透镜聚焦成为一个能量集中的圆光斑，照射到水体样品池，水体激发出的荧光90度方向经过第二聚焦透镜与带通滤波片后被PMT光电检测器接收。通过配置不同数量的LED阵列作为激发光源获得不同的光强。经过滤波和聚焦透镜后得到足以激发样品水体产生荧光的光强，荧光信号被光电检测器检测，经过后面的微弱信号检测电路后，输入到单片机进行处理。整个过程都是在单片机的控制下进行。
采用上述装置应用于下述水体藻类光合作用活性原位检测
荧光法藻类光合作用活性检测以叶绿素荧光测量技术和荧光诱导动力学特性为基础，荧光的产生是叶绿素分子受光源激发的结果，同时伴随着热量的散失。藻类活体荧光几乎全部来源于光系统II (PSII)的叶绿素a，藻细胞吸收光能后，一部分P用于光合作用， 另一部分D以热的形式耗散到环境中，剩余的部分F以荧光的形式发射出来，根据能量守恒可知P+D+F=丨。因此，可以通过不同激发光源作用下，藻类发出的荧光信息计算藻类PSII 的最大光合作用量子产量和实际量子产量，由此来表征藻类的光合作用活性。
利用上述装置进行藻类光合作用活性测量过程如图1所示。
①在样品池内装入藻类样品水体，经充分暗适应后，LED灯阵列产生很弱的测量光，只激发藻类细胞色素的本底荧光，不能使藻细胞进行光合作用，测量得到初始荧光Ftj ；
②LED灯阵列产生光强足够大的光饱和脉冲光，此时藻细胞的光合作用被完全抑制，荧光迅速上升至最大，测得最大荧光强度Fm。在打开饱和脉冲光的短暂时间内D/F的比值保持不变即DcZFtl = Dm/Fm，则可由下式计算出PSII的最大光合作用量子产量，
P = I-F0-D0 = I-F0-F0 · (l_Fm) /Fm = (Fm-F0) /Fm, P 反映了藻类细胞的潜在最大光合能力；
③LED灯阵列产生光化光，使藻类细胞能够进行正常的光合作用，在光化光打开瞬间，叶绿素荧光迅速上升至一最大值Fp，随后因光合作用与热耗散的影响，荧光逐渐下降，经一段时间荧光达到一稳定值，测量稳定荧光产量Fs，此时的藻细胞吸收的光能在光合作用、发射荧光、热耗散能间达到动态平衡，这种状态称为光适应状态；
④接着，LED灯阵列产生饱和脉冲光，荧光迅速上升到最大F' m(t)，在光化光和饱和脉冲光共同作用一段时间后，F' m(t)达到一个稳定值F' m，这就是要测量的光适应状态下最大荧光产量。据此可求得PSII的实际量子产量ΦΡΜΙ= (F' ffl-Fs)/F' ffl；
因此，通过测量计算P和ΦΡΜΙ来表征藻类的最大光合作用活性能力和正常光合作用情况下的光合作用活性。
利用本发明的水体藻类光合作用活性原位检测方法与装置实际测量了不同浓度、 温度和光照条件下藻类的光合作用活性，获得了不同时序条件下的荧光诱导曲线以及对应的最大和实际的量子效率，如图4所示。
根据图4 中(a)、(b)分别计算得到 P = 0. 85，ΦΡ5Π = 0. 625，以及 P = 0. 95，ΦΡ5Π =0. 574 ；实现了水体藻类光合作用活性的在线原位测量。
测量光光强约为0. Ιμπιο ^nT2s-1,只能激发藻细胞色素的本底荧光，不足以引起藻细胞产生光合作用；(比如夜间，光线太弱，不能进行光合作用)
饱和脉冲光光强大于10000 μ mol · JiT2iT1,藻细胞产生光合作用的电子门被完全关闭，藻细胞的光合作用被完全抑制；
光化光光强约6000 μ mol ^nT2iT1,藻细胞能够进行正常的光合作用。(比如白天， 能够进行正常的光合作用)
可见光滤光片是滤除可见光G00-700nm)以外波长的光，作用是减小这个范围以外的光对藻类细胞激发时带来的影响；带通滤波片是仅能通过685nm波长的光，作用是滤除其它波长的光，只进行该波长的荧光测量。权利要求
1.基于荧光法的水体藻类光合作用活性原位检测装置，包括有LED灯阵列、透光的水体样品以及控制电路，其特征在于所述的LED灯阵列的出射光前方光路中依次设有透镜组、可见光滤波片、第一聚焦透镜、所述水体样品、第二聚焦透镜、带通滤波片，带通滤波片后面设有PMT探测器，LED灯阵列发出的激发光源经过透镜组变成平行光，再经过可见光滤波片滤波、经过第一聚焦透镜聚焦成为一个能量集中的光斑，照射到水体样品，水体激发出的荧光经过第二聚焦透镜与带通滤波片后被光电探测器接收输入后续电路进行处理，可见光滤波片滤除可见光G00-700nm)以外波长的光，带通滤波片是仅能通过685nm波长的光， 滤除其它波长的光，只进行该波长的荧光测量。
2.基于荧光法的水体藻类光合作用活性原位检测方法，其特征在于包括以下步骤①设有待测量的样品水体，水体中藻类活体受光照射后产生荧光，藻类活体荧光几乎全部来源于光系统II (PSII)的叶绿素a，藻细胞吸收光能后，一部分P用于光合作用，另一部分D以热的形式耗散到环境中，剩余的部分F以荧光的形式发射出来，根据能量守恒可知p+D+F= 1 ；在样品水体前方设置激发光源，经充分暗适应后，激发光源产生很弱的测量光，只激发藻类细胞色素的本底荧光，不能使藻细胞进行光合作用，测量得到初始荧光Ftj ； 光系统II (PSII)，是指藻类细胞的光合作用系统，能将吸收后的光能转换为生长所需要的能量；②激发光源产生光强足够大的光饱和脉冲光，此时藻细胞的光合作用被完全抑制，荧光迅速上升至最大，测得最大荧光强度Fm ；在打开饱和脉冲光的短暂时间内D/F的比值保持不变即DcZFtl = Dm/Fm，则可由下式计算出PSII的最大光合作用量子产量，P = I-F0-D0 = I-F0-F0 · (I-Fffl)/Fffl = (Fffl-F0)/Fffl, P反映了藻类细胞的潜在最大光合能力；③激发光源产生光化光，使藻类细胞能够进行正常的光合作用，在光化光打开瞬间，叶绿素荧光迅速上升至一最大值Fp，随后因光合作用与热耗散的影响，荧光逐渐下降，经一段时间荧光达到一稳定值，测量稳定荧光产量Fs，此时的藻细胞吸收的光能在光合作用、发射荧光、热耗散能间达到动态平衡，这种状态称为光适应状态；④接着，激发光源产生饱和脉冲光，荧光迅速上升到最大F'm(t)，在光化光和饱和脉冲光共同作用一段时间后，F' m(t)达到一个稳定值F' m，这就是要测量的光适应状态下最大荧光产量；据此可求得PSII的实际量子产量Φ PSii = (F' m_Fs)/F' ffl；因此，通过测量计算P和ΦΡΜΙ来表征藻类的最大光合作用活性能力和正常光合作用情况下的光合作用活性。
全文摘要
本发明公开一种基于荧光法的水体藻类光合作用活性原位检测装置及方法。以高亮LED为激发光源，通过接收不同激发光强作用下藻类的荧光信号实现对藻类光合作用活性状态的表征，为水体藻类光合作用活性的快速、原位测量提供了一种有效的监测手段，装置中采用调制技术解决了荧光信号受外界环境光干扰的问题，以恒流驱动消除了光源强度波动对荧光激发稳定性的影响。具有操作方便、快速自动、对分析样品无损等优点，适用于不同的水流域(近海水体，湖、库水源地等)及不同深度水体的实时、原位监测，可用作我国环境监测部门对水体藻类生长状况评价的快速监测工具，也可用于科学研究人员实现藻类光合作用活性检测的快速分析仪器，有着非常广阔的应用前景。
文档编号G01N21/64GK102539394SQ20111027179
公开日2012年7月4日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者刘建国, 刘文清, 刘晶, 张玉钧, 殷高方, 赵南京, 钟留勇, 马明俊 申请人:中国科学院安徽光学精密机械研究所