专利名称：一种用于spr双通道法检测前列腺特异性抗原的生物传感芯片、试剂盒，检测方法
一种用于SPR双通道法检测前列腺特异性抗原的生物传感芯片、试剂盒，检测方法技术领域
本发明属于前列腺癌检测试剂领域。具体的，涉及一种用表面等离子共振技术 (Surface Plasmon Resonance, SPR)检测前列腺特异性抗原的方法，以及采用该方法的SPR 生物传感芯片，试剂盒，背景技术
肿瘤标志物检测是肿瘤普查、诊断和预后的主要技术手段之一。PSA是一种主要由前列腺上皮细胞产生的蛋白分解酶，是具有极高的组织器官特异性、高度敏感性的肿瘤标志物。在正常的生理情况下，PSA通过导管分泌到精液中，其在精液中的浓度比在血清中浓度的高出100万倍。前列腺的腺泡和导管腔与血液循环系统之间，存在着组织屏障，当患有前列腺癌时，这一层自然屏障会因为肿瘤细胞的疯狂生长而遭致破坏，PSA就会大量渗入到血液中造成血清PSA浓度的大幅度升高。鉴于PSA有严格的组织器官和细胞特异性，目前临床主要以测定PSA作为筛选前列腺癌和前列腺增生的主要手段。
但是，PSA的肿瘤特异性较差。随着年龄增长、外界因素等都有可能导致PSA浓度升高，特别是良性前列腺增生及前列腺炎都会导致t-PSA(即总PSA)浓度的升高，当t-PSA 浓度处于4-lOng/ml时，前列腺癌与良性前列腺增生都有较高的发病率，习惯上称这一区域为诊断灰区。为了提高灰区的诊断特异性，降低前列腺癌的误诊率，人们提出了多种方法对其进行检测，其中包括PSA密度、PSA增加速度、前列腺移行带密度、年龄或者种族特异性因素等参考。近年来发现检测f-PSA(即游离态PSA)，并且比较f-PSA/t-PSA的比值(f/t) 可以有效的区分前列腺增生和前列腺癌，特别是在诊断灰色区，可以有效地提高诊断真实性，降低误诊率。
目前，传统的检测血清中PSA的方法是基于大型检测机构的大型仪器进行检测， 这些方法虽然能检测到超低浓度，但是有检测方法繁琐、费用昂贵、所用检测试剂多、检测周期长等缺点。鉴于此，开发一种能够快速、准确、费用低的检测手段非常必要。随着免疫传感器的不断发展，使用纳米粒子和纳米结构的材料作为免疫传感器的核心部件，构建PSA 免疫传感器，从而实现了 PSA的临床快速检测成为可能。到现在为止，已报道的检测方法主要包括酶联免疫法(ELISA)，免疫层析法、时间分辨免疫荧光法、化学发光免疫法、SI^R方法、荧光免疫方法、表面增强拉曼光谱法、电化学方法、生物编码的纳米颗粒法、QCM方法、微型悬臂方法等。在上述方法中，免疫层析法费用最低廉、也很方便，但是它最主要的缺点是灵敏度低，只能实现半定量。放射免疫分析法具有较高的灵敏度、准确度和精确度，但试剂存在放射性污染且标记物半衰期短。而化学发光免疫法在我国目前仪器与试剂均需进口， 检测成本较高。
sra技术是一种基于芯片表面折射率变化的光学检测技术，具有快速、灵敏、免标记等优点，可实时在线地跟踪固液界面反应，在蛋白及核酸等生物分子检测方面具有广阔的应用前景。但是，传统的sra检测方法难以检测低分子量、超低浓度的生物分子。f-PSA在人血清中的浓度非常低，直接利用传统的SI^R技术很难检测。而纳米金具有密度大、介电常数大、良好的生物相容性，可以极大的增强sra信号。鉴于此，我们结合两者的优点，设计出基于纳米金放大的SPR技术检测超低浓度f-PSA，结合SPR双通道检测技术，同步得到f/发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于前列腺特异性抗原检测的sra生物芯片及试剂盒；本发明的目的之二是提供一种前列腺特异性抗原的sra双通道检测方法。通过本发明，可以简化样本处理步骤，利用生物芯片技术的高通量、高敏感度、高特异的特性，克服现存检测方法的不足。
—种用于sra双通道法检测前列腺特异性抗原的生物传感芯片，基质为玻璃片， 玻璃片表面镀有金膜，金膜表面有经化学修饰形成的巯基羧酸类单分子层，单分子层上对应于sra双通道中的两个通道的区域分别固定有f-PSA抗体和t-PSA抗体，并用氨基乙酸封闭剩余的单分子的活性位点。
所述的金膜厚度为40-60nm。
所述的巯基羧酸类为甲基单位数目为8-16的HS (CH2)nC00H。
玻璃片与金膜之间还喷镀有一层2nm厚的铬。
一种用于sra双通道法检测前列腺特异性抗原的试剂盒，包括所述的生物传感芯片、t-PSA抗原和Au标f-PSA抗原。
所述的Au标f-PSA抗原，是通过纳米金与过量f-PSA抗原溶液混合、冷冻离心、移去上层清液后获得；其中所述的Au纳米粒子直径为15-40nm。
一种前列腺特异性抗原检测的方法，包括以下步骤
(1)将所述的生物传感芯片放置到sra双通道中，芯片上带抗体区域分别对应两检测通道，将Au标标准浓度f-PSA抗原流动注射经过SPR中对应有f-PSA抗体的检测通道； 标准浓度t-PSA抗原流动注射经过sra中对应有t-PSA抗体的检测通道，并记录sra信号制作标准曲线；
(2)将预处理后的待测样品流动注射经过sra两个检测通道，并记录sra信号变化；
(3)继续向对应有f-PSA抗体的通道注射Au标f_PSA抗原，并记录SPR信号变化；
(4)根据标准工作曲线，确定上述不同通道的Sra信号变化分别对应的f-PSA和 t-PSA浓度，得到f/t值；
所述的Au标f-PSA抗原，是通过纳米金与过量f-PSA抗原溶液混合、冷冻离心、移去上层清液后获得；其中所述的Au纳米粒子直径为15-40nm。
各标准浓度抗原，待测样品和金标抗原的流动速度均是5-50 μ 1/min。
制备本发明sra生物传感芯片，参见图1，方法包括以下步骤
(1)将处理干净后的玻璃片放到真空磁控溅喷镀膜机上喷镀一层2nm厚的铬，随后在铬膜上继续喷镀一层40-60nm的金膜。
(2)用甲基单位数目为8-16的HS (CH2)nC00H的酒精溶液浸泡金膜，形成巯基羧酸类单分子层。4
(3)用1- (3- 二甲胺丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羧基硫代琥珀酰亚胺(MB)的混合液活化巯基羧酸类末端的-COOH ；
(4)注射Anti-PSA，使其连接到金膜上；对应于SI3R双通道中的两个通道的区域分别固定有f-PSA抗体和t-PSA抗体；
(5)用氨基乙醇封闭表面剩余活性位点，即制得所述sra生物芯片。
采用双通道检测，仪器工作原理参见图3，即采用双光源、双检测器的方法同步检测两个独立通道的SPR响应。
本技术发明的优点与效果如下
(1)本发明采用Au标PSA抗原，提高了检测的灵敏度，降低了检测的最低浓度；
(2)这种sra双通道检测方法降低了样品的处理要求，简化了操作步骤，缩短了检测时间；
(3)本发明不需要昂贵的检测仪器，降低了芯片的使用成本及实验条件。
总之，该技术的研制成功将真正实现芯片技术的高通量、特异、灵敏、快速的特点。 该技术为前列腺癌的诊断、治疗过程的跟踪和预后提供了技术支持和参考，为前列腺癌的预防和治疗提供了重要的指导作用。


下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明，而不会限制本发明。
图1.为本发明设计的SPR生物传感芯片示意图2.为本发明前列腺特异性抗原STO双通道检测原理图3.为本发明双通道sra检测仪器工作原理图4为在0. 05ng/ml到2. 5ng/ml的范围内，f-PSA的浓度与纳米金放大SI3R信号的线性关系图5为在lng/ml到lOng/ml范围内，t-PSA浓度与SI3R信号的线性关系图。
参见图1，本发明设计的SI3R生物传感芯片由1、2、3、4、5组成；其中，1 玻片，2 金膜，3 巯基羧酸，4 氨基乙醇，5 f-PSA抗体或t-PSA抗体。
参见图2，本发明的前列腺特异性抗原Sra双通道检测法的检测原理图，其中A 为通道1放大图，1 玻片，2 金膜，3 巯基羧酸，4 氨基乙醇，5 :Anti-f-PSA，6 f-PSA抗原，7 :Au-f-PSA抗原；B为通道2放大图，1 玻片，2 金膜，3 巯基羧酸，4 氨基乙醇，5 Anti-t-PSA，8 t-PSA 抗原，9 通道 1,10 通道 2。
参见图3，本发明的双通道Sra检测装置构成包括，2 金膜，9 通道1，10 通道2， 11 激光1 ；，12 激光2 ；13 检测器1 ； 14 检测器2。
具体实施方式
下面结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1在玻璃载玻片上镀厚度为40-60nm纳米金膜方法，步骤如下
(1)用水虎鱼( 与浓H2SO4体积比为1 3的混合液)清洗玻片，然后用二次去离子水清洗干净，用N2吹干。
(2)将清洗干燥后的玻片放到真空磁控溅喷镀膜机上进行镀膜
a)先镀一层约2nm厚的铬膜；
b)在铬膜上继续镀一层40-60nm厚的金膜。
实施例2粒径为15-40nm的纳米金溶液的制备方法，步骤如下
(1)将所用仪器用王水浸泡12h，洗净烘干备用。
(2)将质量分数为0. 01 %的氯金酸水溶液IOOml加热到130°C，搅动下迅速加入质量分数为2%的柠檬酸三钠2-16ml，溶液逐渐由无色变成粉红色，再变成酒红色，变成酒红色后继续加热15min，加热过程需搅拌和回流。
(3)撤离热源，继续搅拌冷却至室温，转入锥形瓶中，4°C条件下保存备用。
实施例3sra芯片制备方法，步骤如下
(1)将金膜在4mmol/L巯基羧酸的酒精溶液中避光浸泡12h，形成一层自组装单分子层。
(2)用0. lmol/L NHS和0. 4mol/L EDC混合液活化巯基羧酸末端的-C00H，溶液用 IOmmol/L PBS(PH7. 4)缓冲液配制。
(3)流动注射Anti-PSA，使其连接到金膜上，流动注射的流速为5_50 μ 1/min ；对应于SI^R双通道中的两个通道的区域分别固定有f-PSA抗体和t-PSA抗体；
(4)用lmol/L氨基乙醇溶液封闭已活化但未与前列腺抗体反应的-C00H，即制得所述芯片。
本发明使用的抗原、抗体均购买于上海领潮生物科技有限公司。
实施例4制备Au标f-PSA抗原方法，步骤如下
(1)20(^1^纳米金溶液(浓度为0.63\10^1101/1)中加入0.111101/1 K2CO3 溶液 10口1^，调卩!1至9.0。
(2)向调好pH的纳米金溶液加入比最小标记量(最小标记量为2. 2μ g/ml)多 50%的f-PSA，常温下反应2h。
(3)将溶液在4°C，9000r/min条件下离心lOmin，移去上层清夜，除去多余的未与纳米金结合的f-PSA，加入等体积的lOmmol/L PBS (PH7. 4)缓冲液稀释，离心三次即制得Au 标f-PSA抗原。
实施例5样本处理方法，步骤如下
(1)取空腹静脉血，装入含有EDTA的真空管中，室温下静置lh。
(2)在 4°C，1600r/min 条件下离心 30min。
(3)取上层血清，去除下层血细胞。
(4)将血清于-80°C条件下冷藏，实验时直接注射血清进行检测。
实施例6表面等离子体激元共振双通道法同时检测f-PSA和t-PSA方法，具体的抗原检测方法原理参见图2，包括以下步骤
(1)将所述的生物传感芯片放置到sra双通道中，芯片上带抗体区域分别对应两检测通道，将Au标标准浓度f-PSA抗原(标准浓度f-PSA抗原金标过程为普通标记过程， 对纳米金溶液没有要求，只要抗原溶液中含有纳米金，即可以起到信号放大的作用)流动注射经过SPR中对应有f-PSA抗体的检测通道；标准浓度t-PSA抗原流动注射经过SPR中对应有t-PSA抗体的检测通道，并记录sra信号制作标准曲线；
(2)将预处理后的待测样品流动注射经过sra两个检测通道，并记录sra信号变化；
a)用等体积的lOmmol/L的PBS (PH 7. 4)缓冲液稀释离心后的样品；
b)注射样品溶液的流速为5-50 μ 1/min,反应到基线走平。
(3)继续向对应有f-PSA抗体的通道注射实施例4制备的Au标f_PSA抗原，并记录sra信号变化；
(4)根据标准工作曲线，确定上述不同通道的Sra信号变化分别对应的f-PSA和 t-PSA浓度，得到f/t值；
从图4可以看出，在0. 05ng/ml到2. 5ng/ml的范围内，f-PSA的浓度与纳米金放大SI3R信号成线性关系。从图5中可以看出，在lng/ml到lOng/ml范围内，t_PSA浓度与 SPR信号成线性关系。
实验过程中，对实际样品进行了检测，选择3个健康男性作为控制对照组，5个PCa 患者作为实验组，分别对他们进行检测，用本发明SI^R双通道法可同时检测f-PSA和t-PSA。 从下表的实验数据可以看出，与健康人相比PCa患者血清中f. t明显降低。以f/t来诊断 PCa，可以提高诊断的准确率，我们检测的实际样品的结果与医院的诊断结果一致。
血淸中的f-PSA，t-PSA及仇值f-PSA _t-PSA __组另 Ij η &g/ml) χ士 s(pg/ml) χ士 sf/t χ士 s0.431.120.38正常对照组 3 0.76 0.59±0.17 1.49 124±0.20 0.51 0.44±0.07 0.581.310.441.6610.360.161.214.790.25PCa 组 5 0.531.22±0.94 28.0313.27± 11.00 0.02 0.18±0.120.672.100.322.8221.070.1权利要求
1. 一种用于sra双通道法检测前列腺特异性抗原的生物传感芯片，其特征在于，该芯片基质为玻璃片，玻璃片表面镀有金膜，金膜表面有经化学修饰形成的巯基羧酸类单分子层，单分子层上对应于sra双通道中的两个通道的区域分别固定有f-PSA抗体和t-PSA抗体，并用氨基乙酸封闭剩余的单分子的活性位点。
2.根据权利要求1所述的生物传感芯片，其特征在于，所述的金膜厚度为40-60nm。
3.根据权利要求1所述的生物传感芯片，其特征在于，所述的巯基羧酸类为甲基单位数目为 8-16 的 HS(CH2)nCOOH15
4.根据权利要求1所述的生物传感芯片，其特征在于，玻璃片与金膜之间还喷镀有一层2nm厚的铬。
5.一种用于sra双通道法检测前列腺特异性抗原的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任意一项所述的生物传感芯片、t-PSA抗原和Au标f-PSA抗原。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的Au标f-PSA抗原，是通过纳米金与过量f-PSA抗原溶液混合、冷冻离心、移去上层清液后获得；其中所述的Au纳米粒子直径为 15-40nm。
7.一种前列腺特异性抗原检测的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将权利要求1-4任意一项所述的生物传感芯片放置到SI^R双通道中，芯片上带抗体区域分别对应两检测通道，将Au标标准浓度f-PSA抗原流动注射经过SPR中对应有f-PSA 抗体的检测通道；标准浓度t-PSA抗原流动注射经过SPR中对应有t-PSA抗体的检测通道， 并记录SH 信号制作标准曲线；(2)将预处理后的待测样品流动注射经过SPR两个检测通道，并记录SPR信号变化；(3)继续向对应有f-PSA抗体的通道注射Au标f-PSA抗原，并记录SI3R信号变化；(4)根据标准工作曲线，确定上述不同通道的Sra信号变化分别对应的f-PSA和t-PSA 浓度，得到f/t值；所述的Au标f-PSA抗原，是通过纳米金与过量f-PSA抗原溶液混合、冷冻离心、移去上层清液后获得；其中所述的Au纳米粒子直径为15-40nm。
8.根据权利要求7所述的检测法，其特征在于，各标准浓度抗原，待测样品和金标抗原的流动速度均是5-50 μ 1/min。
全文摘要
本发明公开了一种用于SPR双通道法检测前列腺特异性抗原的生物传感芯片、试剂盒，检测方法。应用本发明的方法和生物传感芯片可以同步定量检测样品中的f-PSA和t-PSA，检测限达到50pg/ml，可有效提高在f/t值的准确率，从而作为区分前列腺癌和前列腺增生的参考。本发明芯片、试剂盒及检测方法具有选择性高、检测限低、重现性好等优点，应用前景广阔。
文档编号G01N33/551GK102520161SQ20121000196
公开日2012年6月27日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者向娟, 彭贞, 陈晓青, 陈胜华 申请人:中南大学