专利名称：水绵在测试受污染废水的毒性中的应用及其测试方法
技术领域：
本发明涉及一种新的环境毒理学测试方法，具体涉及利用淡水绿藻水绵(Spirogyrasp.)监测环境污染物质(如含重金属、表面活性剂等的废水)的生物毒性及种类的技术及其应用。
背景技术：
堆肥，就是对固体垃圾中可生物降解的有机物部分进行生物分解，并使之资源化、减量化和无害化。固体垃圾堆肥处理已经成为一种常见的、广泛使用的垃圾处理方法。在欧洲，目前大约有200个垃圾堆肥场在运转，有24％的固体垃圾使用堆肥处理。堆肥产品的合理处置，是堆肥技术推广应用重要的制约因素之一。
堆肥的农田利用已经被越来越多的学者们认为是解决这一问题的最合适的措施之一，既减少废物，降低污染，同时又能增加土壤肥力、持水力和改良土壤结构，尤其是在精耕地区，土壤中有机物含量严重缺乏，堆肥农用显示了较大的经济价值。有机堆肥可显著提高土壤中总有机碳、腐殖酸物质及有效N、P、K含量，可提高柑桔产量。堆肥的农用还可降低土壤中氮素的损失，并被认为是走可持续发展农业道路的良好选择。
但是，堆肥中不仅含有大量的营养盐，同时还含有高浓度的有毒污染物质，如重金属、表面活性剂等。含低浓度Cu、Zn的堆肥施用到农田后，常被报道农作物中Cu、Zn含量随之升高。若含有大量有毒物质的堆肥不经有效处理而施用到农田中，只会导致污染扩散，危害整个农田生态系统，给人们的生命健康带来极大的威胁。因此，堆肥的安全性是制约堆肥农田利用的关键因素。
堆肥产品及堆肥渗滤液的毒理学检测是判断堆肥安全性的有效途径，以便针对性地采取有效措施，降低污染物扩散。目前，用于检测污染物毒性的方法主要有(1)、微核技术通过显微观察蚕豆、紫露草或大蒜根尖、叶尖及花等高等植物细胞中染色体断裂后形成微核的数量，判断环境污染物对生物的遗传毒性。
(2)、电子显微镜技术利用电子显微镜来观察动植物(通常为高等动植物类群)受污染物损伤后细胞结构的变化，来检测环境污染物对生物的毒性作用。
(3)、酶学诊断测定处理前后动、植物(通常为高等动植物类群)组织内SOD(超氧化物歧化酶)、CAT(过氧化氢酶)、POD(过氧化物酶)、脱氢酶、ATP酶等的活性变化来推断污染物对生物的毒性。
(4)、急性毒性试验高浓度的有毒污染物对浮游植物、浮游动物及小型鱼类可能产生急性毒性，通过测定污染物对生物的半致死浓度(LD50)的大小来判定污染物的危害性。
高等动植物在长期进化过程中，都形成了一定的抵抗污染、保护自身代谢活动正常进行的一套完善的机制，要让生物组织产生可见的染色体断裂、细胞结构变化、保护酶活性变化及急性致死现象，一般都需要较高的污染物浓度，而且都是综合污染效应，缺乏针对某一污染物的特异症状。而且常规的对细胞结构伤害症状观察要在电子显微镜下才能进行，其前处理工作相当复杂，且需要昂贵的仪器——电子显微镜才能观察，在一般的光学显微镜下，其伤害症状难以辨认。因此，只能对少量样品进行检测，而对于大量的环境样品，则束手无策。而对于浮游植物、浮游动物，由于个体太小，难以操作。
由此可见，现有的实验材料存在着对污染物的伤害症状特异性差、重复性差，对污染物不敏感，对实验仪器要求高等缺点，操作也十分复杂，难以满足实时快速监测废水及堆肥滲滤液毒性的要求，因此，难以为环境管理提供及时有效的服务，急于研究出新的、快速、实用的毒理学方法。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷，提供一种能准确、快速、灵敏地指示垃圾堆肥渗滤液及废水对生物毒性的实验材料，研究出一种操作简便、经济、实用的环境污染毒理学测试方法，适于野外实时监测，为排放废水及堆肥中有毒污染物对环境可能产生的影响提供及时的预报。
本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案。
水绵(Spirogyra sp.)是一种在未受污染的淡水中常见的绿藻。正常情况下，水绵植物体由长筒形细胞连成丝状，不分枝。细胞内有多条含有光合色素(叶绿素)、具有光合作用功能的带状载色体。这些载色体呈多股螺旋，规则地盘绕在细胞的内表面。载色体上还有一列造粉核，细胞核一个，由微丝牵引悬挂于细胞的中央，细胞内的其余空间，被一个中央大液泡所充填。水绵这种独特的规则结构，在自然界已知的生物类群中，是绝无仅有的。
当环境受到不同种类的重金属或表面活性剂污染时，水绵细胞会呈现出各自特异的伤害症状，且重复性好，根据水绵细胞的伤害症状，可以对污染物的种类作出定性判断。
水绵植物体大小适中，易于操作处理。细胞透明，不用切片，就可在普通光学显微镜下直接观察，减少了复杂的前处理工作。处于营养生长阶段的水绵细胞对环境中的污染物非常敏感，由于细胞大而透明，在普通光学显微镜下，其内部结构的变化情况清晰可见；由于载色体的规则螺旋结构，若细胞结构发生微小的改变，在显微镜下都可清晰可辨，其高灵敏度是其它生物材料所不可比的。水绵材料易得，实验室培养也容易，便于随时取材，不受季节的限制。因此，水绵不失为一种较理想的毒理学材料，适于对重金属污染物(Cu2+、Ag+、Cd2+)及表面活性剂(阴离子型、非离子型表面活性剂)污染的环境样品的检测。
下面进一步详述本发明水绵在测试受重金属及表面活性剂污染的废水的毒性中的应用。所述的水绵(Spirogyra sp.)生长在未受污染的水体中或室内培养物。
利用水绵测试受重金属及表面活性剂污染的废水及堆肥滲滤液毒性的方法，其特征在于利用淡水绿藻——水绵Spirogyra sp.的细胞结构形态改变为目标物，监测废水及垃圾堆肥滲滤液中的污染物对生物的毒性，在不同的重金属离子或表面活性剂污染物存在下，水绵细胞的结构发生显著的特异性改变，在显微镜下直接观察细胞结构的变化，判断废水及垃圾堆肥滲滤液对生物的毒性。
其具体步骤为4、实验材料及前处理①、水绵从未受有毒物质污染的水沟或池塘中采集处于营养生长阶段、生长状态良好的水绵，用蒸馏水充分洗净，除去杂质，置于盛有蒸馏水的大烧杯中备用。
②、处理液分别配制含不同种类重金属或表面活性剂的溶液，如重金属Cu2+、Ag+、Cd2+(配制浓度为3mg/L)；非离子型表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚(AE)或阴离子型表面活性剂直链烷基苯磺酸钠(LAS)(配制浓度为10mg/L)的处理液于容量为50mL的小烧杯中，用稀盐酸和稀氢氧化钠调节溶液pH值呈中性。
2、材料的处理分别取少量水绵(1-5g)，置于各盛有重金属或表面活性剂处理液的小烧杯中，处理约15～240分钟，制片、镜检。
3、制片和镜检取一片干净的载玻片，在其中央加一滴蒸馏水。用镊子取经处理的水绵少量，分散于载玻片上的蒸馏水中，盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞结构受损情况，包括①载色体的颜色、形状、空间结构；②造粉核的形状；③细胞表面的颜色、形状等症状。并进行显微摄影。
4、伤害典型症状观察①、正常水绵(Spirogyra sp.)
水绵属于绿藻门结合藻目，是淡水中常见的不分枝丝状绿藻，隶属水绵科。正常情况下，水绵植物体由长筒行细胞连成丝，载色体呈带状，规则地螺旋盘绕在细胞的内表面，载色体上含有一列造粉核，细胞中央为一大液泡。细胞核一个，位于细胞的中央。细胞壁为两层内层的纤维素层和外层的果胶质层。
②、受Cu2+污染时的伤害症状水绵细胞呈现鲜艳的亮绿色，载色体以细胞核为中心横向聚集，载色体的两端与细胞间横隔相连，因此呈现两端散开的绳状，细胞壁不皱缩。
③、受Ag+污染的伤害症状水绵细胞的颜色发生显著变化，呈深棕红色。载色体上的造粉核膨大，载色体的规则螺旋结构不变，但在载色体的边缘聚集大量的深红褐色Ag+颗粒。细胞间的横隔处，Ag+大量聚集，呈现深褐色，且细胞间的连接处逐渐向内凹陷，最后完全分离。
④、受Cd2+污染的伤害症状水绵细胞的伤害症状为细胞颜色稍微加深，呈深绿色。载色体的螺旋结构基本清晰可见，但将逐渐解体，色素外溢。细胞膨胀呈椭圆状，使细胞间隔处缢缩。载色体与细胞壁间出现很大的空隙区。
⑤、受阴离子型表面活性剂直链烷基苯磺酸钠污染的伤害症状水绵中螺旋状排列的载色体带变成不规则卷曲，螺距减小，载色体的绿色加深变暗。造粉核仍然明显。随着损伤程度的加深，载色体会逐渐、造粉核会慢慢解体，载色体进一步聚集，细胞质膜皱缩，与细胞壁分离，出现较大的质壁空隙。水绵细胞壁的外层果胶质溶解而使细胞壁变薄，细胞壁仅剩内部的纤维层。
⑥、受非离子型表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚污染的症状水绵中螺旋状排列的载色体带变成不规则卷曲，并逐渐解体，色素外溢，呈“溶解”状，整个细胞呈现绿色。造粉核膨胀，也逐渐解体。水绵细胞壁的外层果胶质溶解而使细胞壁变薄，细胞壁仅剩内部的纤维层，细胞膨胀。
5、样品处理用一小烧杯取少量待测样品溶液，加水绵少量(1-5g)于溶液中处理，15～240分钟制片、镜检(方法同3)，在显微镜下观察记录细胞受伤害情况及伤害症状，与典型症状对照，就可判断样品的毒性及污染物种类。
水绵对重金属离子(Cu2+、Ag+、Cd2+)及表面活性剂(阴离子型、阳离子型)敏感，而对农药不敏感，因此，本毒理学测试方法适用于对受重金属(Cu2+、Ag+、Cd2+)及(阴离子型、阳离子型)表面活性剂污染废水及垃圾堆肥滲滤液的毒性测试。不能用于对农药污染废水的毒理学检测。
本发明的特点在于①、操作简便、症状容易判断。水绵植株是由单细胞纵向连接而形成的不分枝丝状体，细胞大而透明，因此，不用切片可直接压片，在普通光学显微镜下观察。由于其载色体具有独特的规则螺旋结构，细胞结构上的微小变化，都能容易地观察出。毒理学测试中常用的高等动植物细胞，结构复杂，不规则，因此，一般需要经过包埋、组织切片、染色等前处理，在电子显微镜下才能观察出其伤害症状，且微小的结构改变不容易被观察出来。操作简便、症状容易判断是本方法的显著特点之一。
②、灵敏度高，还可用于定性分析。水绵对重金属离子(Cu2+、Ag+、Cd2+)及表面活性剂(阴离子型、阳离子型)敏感，其灵敏度比常规的急性毒性试验提高2-10倍。水绵细胞对重金属和表面活性剂的不同种类污染物，能表现出不同的典型症状，因此，可通过水绵的典型症状来定性分析污染物种类。而常规的毒理学分析方法，如急性毒性试验、微核技术、酶学诊断及电子显微镜技术等，都是受试生物对污染物的综合反应，不能定性分析污染物的种类，且灵敏度比本测试方法低。
③、反应速度快、省时。用水绵测试受重金属离子(Cu2+、Ag+、Cd2+)及表面活性剂(阴离子型、阳离子型)污染的废水，15-30分钟内，就可以反应完全，出现典型症状，整个测试过程可以在40分钟内完成。常规的毒理学测试方法，一般都需要1-7天，甚至更长的时间才能完成。


图1为正常状态下水绵的细胞形状；图2为经Cu2+污染的水样处理后的水绵细胞形态；图3为经Ag+污染的水样处理后的水绵细胞形态；图4为经Cd2+污染的水样处理后的水绵细胞形态；图5为经阴离子型表面活性剂直链烷基苯磺酸钠处理后的水绵细胞形态；图6为经非离子型表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚处理后的水绵细胞形态。
图中代号Ag银颗粒；Cc载色体；CI细胞间横隔；N细胞核；Pb造粉核；W细胞壁
具体实施例方式用水绵测试城市生活垃圾堆肥渗滤液、化工厂、纺织厂废水中重金属及表面活性剂等污染物的生物毒性，预测排放废水对生态平衡的影响。
工作程序
1、实验材料及前处理(1)、指示生物水绵水绵取自长沙市郊区一未受有毒物质污染的沟渠，水绵生长状态良好，处于营养生长期。经蒸馏水清洗后，置于盛有蒸馏水的大烧杯(1000mL)中备用。
(2)、化学试剂硝酸银、醋酸铜、醋酸铬，阴离子型表面活性剂直链烷基苯磺酸钠、非离子型表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚，均为分析纯。为观察到典型症状，将各化学试剂分别用蒸馏水配制成下列浓度的溶液重金属Ag+、Cu2+、Cd2+分别为3mg/L表面活性剂LAS、AE分别为10mg/L用稀盐酸和稀氢氧化钠调节溶液pH值呈中性。
2、材料的处理分别取少量水绵(1-5g)，置于各盛有重金属或表面活性剂溶液的小烧杯中，处理约15～240分钟，制片、镜检。
3、制片和镜检取一片干净的载玻片，在其中央加一滴蒸馏水。用镊子取经处理的水绵少量，分散于载玻片上的蒸馏水中，盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞结构受损情况，包括①载色体的颜色、形状、空间结构；②造粉核的形状；③细胞表面的颜色、形状等症状。并进行显微摄影。
4、伤害典型症状观察①、正常水绵(Spirogyra sp.)水绵属于绿藻门结合藻目，是淡水中常见的不分枝丝状绿藻，隶属水绵科。正常情况下，水绵植物体由长筒行细胞连成丝，载色体呈带状，规则地螺旋盘绕在细胞的内表面，载色体上含有一列造粉核，细胞中央为一大液泡。细胞核一个，位于细胞的中央。细胞壁为两层内层的纤维素层和外层的果胶质层。经显微摄影，照片见图1。
②、受Cu2+污染时的伤害症状水绵细胞呈现鲜艳的亮绿色，载色体以细胞核为中心横向聚集，载色体的两端与细胞间横隔相连，因此呈现两端散开的绳状，细胞壁不皱缩。经显微摄影，照片见图2。
③、受Ag+污染的伤害症状水绵细胞的颜色发生显著变化，呈深棕红色。载色体上的造粉核膨大，载色体的规则螺旋结构不变，但在载色体的边缘聚集大量的深红褐色Ag+颗粒。细胞间的横隔处，Ag+大量聚集，呈现深褐色，且细胞间的连接处逐渐向内凹陷，最后完全分离。经显微摄影，照片见图3。
④、受Cd2+污染的伤害症状水绵细胞的伤害症状为细胞颜色稍微加深，呈深绿色。载色体的螺旋结构基本清晰可见，但将逐渐解体，色素外溢。细胞膨胀呈椭圆状，使细胞间隔处缢缩。载色体与细胞壁间出现很大的空隙区。经显微摄影，照片见图4。
⑤、受阴离子型表面活性剂直链烷基苯磺酸钠污染的伤害症状水绵中螺旋状排列的载色体带变成不规则卷曲，螺距减小，载色体的绿色加深变暗。造粉核仍然明显。随着损伤程度的加深，载色体会逐渐、造粉核会慢慢解体，载色体进一步聚集，细胞质膜皱缩，与细胞壁分离，出现较大的质壁空隙。水绵细胞壁的外层果胶质溶解而使细胞壁变薄，细胞壁仅剩内部的纤维层。经显微摄影，照片见图5。
⑥、受非离子型表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚污染的症状水绵中螺旋状排列的载色体带变成不规则卷曲，并逐渐解体，色素外溢，呈“溶解”状，整个细胞呈现绿色。造粉核膨胀，也逐渐解体。水绵细胞壁的外层果胶质溶解而使细胞壁变薄，细胞壁仅剩内部的纤维层，细胞膨胀。经显微摄影，照片见图6。
5、样品溶液的毒性检测分别取待测废水溶液或堆肥渗滤液10mL，用稀HCl和稀NaOH调节pH值呈中性，加入少量水绵(1-5g)于溶液中处理，15～240分钟制片、镜检，观察、记录细胞伤害症状。结果见表1。
表1水绵经样品处理后的伤害症状及结果判定


以上事实说明，监测的堆肥滲滤液及3种废水对生物有毒性，排放后对生态环境可能造成破坏。同时也说明，水绵可以对重金属或阴离子型、非离子型表面活性剂污染的废水进行毒理学监测，还可对污染物种类进行初步的定性分析。这充分表明了淡水绿藻水绵是一种比较理想的污染指示生物。
权利要求
1.水绵在测试受重金属及表面活性剂污染的废水的毒性中的应用。
2.如权利要求1所述的水绵在测试受重金属及表面活性剂污染的废水的毒性中的应用，其特征是所述的水绵(Spirogyra sp.)生长在未受污染的水体中或室内培养物。
3.一种利用水绵测试受重金属及表面活性剂污染的废水及堆肥渗滤液毒性的方法，其特征在于利用淡水绿藻——水绵(Spirogyra sp.)的细胞结构形态改变为目标物，监测废水及垃圾堆肥渗滤液中的污染物对生物的毒性，在不同的重金属离子或表面活性剂污染物存在下，水绵细胞的结构发生显著的特异性改变，在显微镜下直接观察细胞结构的变化，判断废水及垃圾堆肥渗滤液对生物的毒性。
4.如权利要求3所述的利用水绵测试受重金属及表面活性剂污染的废水及堆肥渗滤液毒性的方法，其特征在于其具体步骤为A、实验材料及前处理①、水绵从未受有毒物质污染的水沟或池塘中采集处于营养生长阶段、生长状态良好的水绵，用蒸馏水充分洗净，除去杂质，置于盛有蒸馏水的大烧杯中备用；②、处理液分别配制含不同种类重金属或表面活性剂的溶液配制浓度为3mg/L的重金属Cu2+、Ag+、Cd2+；配制浓度为10mg/L的非离子型表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚AE或阴离子型表面活性剂直链烷基苯磺酸钠LAS的处理液于容量为50mL的小烧杯中，用稀盐酸和稀氢氧化钠调节溶液pH值呈中性；B、材料的处理分别取少量水绵1-5g，置于各盛有重金属或表面活性剂处理液的小烧杯中，处理约15～240分钟，制片、镜检；C、制片和镜检取一片干净的载玻片，在其中央加一滴蒸馏水；用镊子取经处理的水绵少量，分散于载玻片上的蒸馏水中，盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞结构受损情况，包括①载色体的颜色、形状、空间结构；②造粉核的形状；③细胞表面的颜色、形状症状；并进行显微摄影；D、伤害典型症状观察①、正常水绵(Spirogyra sp.)水绵属于绿藻门结合藻目，是淡水中常见的不分枝丝状绿藻，隶属水绵科；正常情况下，水绵植物体由长筒行细胞连成丝，载色体呈带状，规则地螺旋盘绕在细胞的内表面，载色体上含有一列造粉核，细胞中央为一大液泡；细胞核一个，位于细胞的中央；细胞壁为两层内层的纤维素层和外层的果胶质层；②、受Cu2+污染时的伤害症状水绵细胞呈现鲜艳的亮绿色，载色体以细胞核为中心横向聚集，载色体的两端与细胞间横隔相连，因此呈现两端散开的绳状，细胞壁不皱缩；③、受Ag+污染的伤害症状水绵细胞的颜色发生显著变化，呈深棕红色；载色体上的造粉核膨大，载色体的规则螺旋结构不变，但在载色体的边缘聚集大量的深红褐色Ag+颗粒；细胞间的横隔处，Ag+大量聚集，呈现深褐色，且细胞间的连接处逐渐向内凹陷，最后完全分离；④、受Cd2+污染的伤害症状水绵细胞的伤害症状为细胞颜色稍微加深，呈深绿色；载色体的螺旋结构基本清晰可见，但将逐渐解体，色素外溢；细胞膨胀呈椭圆状，使细胞间隔处缢缩；载色体与细胞壁间出现很大的空隙区；⑤、受阴离子型表面活性剂直链烷基苯磺酸钠污染的伤害症状水绵中螺旋状排列的载色体带变成不规则卷曲，螺距减小，载色体的绿色加深变暗，造粉核仍然明显；随着损伤程度的加深，载色体会逐渐、造粉核会慢慢解体，载色体进一步聚集，细胞质膜皱缩，与细胞壁分离，出现较大的质壁空隙；水绵细胞壁的外层果胶质溶解而使细胞壁变薄，细胞壁仅剩内部的纤维层；⑥、受非离子型表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚污染的症状水绵中螺旋状排列的载色体带变成不规则卷曲，并逐渐解体，色素外溢，呈“溶解”状，整个细胞呈现绿色；造粉核膨胀，也逐渐解体；水绵细胞壁的外层果胶质溶解而使细胞壁变薄，细胞壁仅剩内部的纤维层，细胞膨胀；E、样品处理用一小烧杯取少量待测样品溶液，加少量水绵1-5g于溶液中处理，15～240分钟制片、镜检，方法同C，在显微镜下观察记录细胞受伤害情况及伤害症状，与典型症状对照，就可判断样品的毒性及污染物种类。
全文摘要
一种利用淡水绿藻－水绵(Spirogyra sp.)作为环境污染指示生物，测试受重金属及表面活性剂污染的废水和垃圾堆肥滲滤液的生物毒性。正常水绵细胞的载色体具有独特的规则多股螺旋结构。当待测样品中含一定浓度重金属或表面活性剂时，水绵细胞的颜色、形状及细胞内的载色体结构会呈特异的伤害症状。由于水绵细胞透明，利用普通光学显微镜就可清晰观察到细胞内部结构变化。利用水绵细胞对重金属和表面活性剂敏感的特性，可监测废水对生物的毒性。同时水绵对不同污染物的特异性伤害症状，可定性分析重金属或表面活性剂污染物种类。本发明具有操作简便、症状易判断、灵敏度高、还可用于定性分析、反应速度快、省时等特点，为环境管理提供及时有效的服务。
文档编号G01N33/00GK1664579SQ20041004713
公开日2005年9月7日 申请日期2004年12月31日 优先权日2004年12月31日
发明者刘红玉, 曾光明, 鲁双庆, 刘云国, 牛秋雅, 陈耀宁, 黄瑾辉 申请人:湖南大学