专利名称：大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法
技术领域：
本发明涉及一种用于圈养动物适时人工授精的判断依据，特别是涉及一种大熊猫雌ニ醇真实峰值的判断方法。
背景技术：
大熊猫是我国特有的珍稀濒危野生动物，其自身繁殖能力偏低，雌性大熊猫一年只有一次发情期，而一次发情期中只有I 3天接受自然交配，其排卵时间可能只有一天，并且圈养大熊猫自然交配比例偏低，目前只有50%左右的大熊猫能够自然交配，有一半左右的大熊猫需要通过人工授精完成繁殖，所以，确定大熊猫适时适时配种时机是大熊猫繁育的关键技术。在上世纪90年代中期以前，对大熊猫适时配种时机的判断主要根据大熊猫发情行为定性观察，凭经验确定大熊猫适时配种时机，导致对大熊猫适时人工授精时间把握不清，缺乏量化指标，这也是导致大熊猫繁殖效率低下的重要原因。上世纪90年代中期以后，通过监测大熊猫发情期尿液雌激素变化规律，利用雌激素指标作为大熊猫适时配种的指标逐渐开始应用于大熊猫人工授精中，但是对采用雌激素指标作为大熊猫适时人工授精的指标存在很大的争议，尚无统ー观点。目前所提出的大熊猫适时人工授精观点全部基于雌激素峰值出现时间来提出，由于大熊猫发情期雌激素变化曲线本身为波动性曲线，会出现多个峰值，并且大熊猫排卵还涉及孕激素、发情行为等其他多个因素，对于如何确切判断雌激素峰值是否为真实峰值尚无任何相关报道。

发明内容
本发明要解决的技术问题是ー种为大熊猫进行适时人工授精提供判断标准的大熊猫雌ニ醇真实峰值的判断方法。为解决上述技术问题，本发明ー种大熊猫雌ニ醇真实峰值的判断方法，包括以下步骤(I)春季繁育期间，按时间要求对雌性大熊猫进行尿样收集，同时观察大熊猫发情行为，在尿样上标记后进行冷冻或冷藏保存，然后对尿样采用酶联免疫吸附试验检测雌ニ醇值和孕酮值；所述记录在尿样上的标记主要包括雌性大熊猫呼名、排尿时间等；所述的雌ニ醇值和孕酮值是指雌ニ醇和孕酮在尿样中的浓度值大小；所述雌ニ醇为尿样中主要的一种雌激素，所述孕酮为尿样中主要的一种孕激素；(2)在以大熊猫排尿时间作为横坐标、以雌ニ醇值和孕酮值作为纵坐标的平面坐标上，分别标出排尿时间及其对应的雌ニ醇值和孕酮值所确定的两组坐标点，将两组坐标点分别依次连接起来，绘制出雌ニ醇值变化曲线图和孕酮值变化曲线图，找出雌ニ醇最大峰值及其对应的孕酮值；所述的雌ニ醇最大峰值亦是雌ニ醇的最高值；(3)根据雌ニ醇最大峰值出现时间前的孕酮值计算出发情雌性大熊猫孕酮基础、值，并计算出雌ニ醇最大峰值或其后的雌ニ醇峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值；(4)依据雌ニ醇值变化曲线图和孕酮值变化曲线图，将雌ニ醇最大峰值或其后的雌ニ醇峰值在下降幅 度达到50%以上所用的时间、雌ニ醇从最大峰值或其后的峰值在下降的过程中孕酮值是否呈上升趋势和大熊猫是否出现典型发情高峰行为、雌ニ醇最大峰值或其后的雌ニ醇峰值所对应的的孕酮值与孕酮基础值的比值等情况同时结合起来，共同判断出大熊猫雌ニ醇真实峰值；所述出现大熊猫雌ニ醇真实峰值的时刻为对应的大熊猫排尿时间。所述的ー种大熊猫雌ニ醇真实峰值的判断方法，若雌ニ醇最大峰值在10小吋 20小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌ニ醇连续下降到基础值、雌ニ醇最大峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于2，同时在雌ニ醇从最大峰值下降的过程中雌ニ醇最大峰值对应的孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌ニ醇最大峰值为熊猫雌ニ醇真实峰值。所述的ー种大熊猫雌ニ醇真实峰值的判断方法，若雌ニ醇最大峰值在20小吋 31小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌ニ醇连续下降到基础值、雌ニ醇最大峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于I. 8，同时在雌ニ醇从最大峰值下降的过程中孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌ニ醇最大峰值为大熊猫雌ニ醇真实峰值。所述的ー种大熊猫雌ニ醇真实峰值的判断方法，若雌ニ醇从最大峰值下降50%的时间在20小时以上、雌ニ醇最大峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值小于I. 8，同时雌ニ醇最大峰值之后出现ー个或多个峰值、且雌ニ醇从最大峰值下降的过程中雌ニ醇最大峰值对应的孕酮值未呈上升趋势和大熊猫未出现典型发情高峰行为，则可以确定雌ニ醇最大峰值为假峰值；此时，大熊猫雌ニ醇真实峰值为雌ニ醇最大峰值之后的某一峰值，并且该峰值必须同时具备在10小吋 20小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌ニ醇连续下降到基础值、该峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于2、在雌ニ醇从该峰值下降的过程中该峰值对应的孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为等情況。所述的10小吋 20小时范围是指大熊猫雌ニ醇从真实峰值下降50%所用时间的主要判断标准，它是通过78例大熊猫发情期雌ニ醇变化规律的统计中总结出的，78例的数据量远远超过了以往的任何报道量，是迄今为止世界上最大的数据量，78例中有80%的大熊猫个体均在这ー范围内，因此，10小吋 20小时范围的判断标准具有非常高的可靠性。所述的大熊猫典型发情高峰行为包括明显的压尾反射(在发情高峰期大熊猫出现特殊的发情行为，即用竹竿刺激大熊猫后躯，大熊猫出现静立、翘尾反应)和待配行为(大熊猫自主出现静立、翘尾、躯干下沉现象)。所述的ー种大熊猫雌ニ醇真实峰值的判断方法，其发情雌性大熊猫孕酮基础值的计算按以下步骤进行①选取大熊猫雌ニ醇最大峰值前的所有孕酮值，找出所选孕酮值中的最大值A，计算出所选孕酮值的算数平均值B、标准差C，然后得出B+2C = D ；②如果A-D为负，此时的算数平均值B即为孕酮基础值；③如果A-D为正，则从选取的孕酮值中找出大于D的所有孕酮值，按①步骤的方式从剩余孕酮值中找出最大值A1，计算出剰余孕酮值的算数平均值B1、标准差C1，然后得出B-C1 = D1 ；④如果A1-D1仍然为正，则重复①步骤的方式，直到An-Dn为负，此时的算数平均值Bn即为孕酮基础值，其中η代表自然数。所述的任何一种大熊猫雌ニ醇真实峰值的判断方法，其按时间要求对雌性大熊猫进行尿样收集的过程如下(I)观察雌性大熊猫外阴部，若外阴部出现红肿后，则每天收集I份雌性大熊猫晨尿；
(2)从雌ニ醇连续上升后的第4天开始，每天间隔8小时左右收集3份尿样；(3)雌性大熊猫发情高峰行为前后，每天间隔5小时左右收集5份尿样；(4) 一旦监测到雌ニ醇值有下降趋势，将尿样收集间隔时间缩短为3小时左右。所述的任何一种大熊猫雌ニ醇真实峰值的判断方法，其每一次大熊猫尿样收集包括以下步骤(I)清洁并晾干兽舍硬化地面；(2)将需收集尿样的大熊猫放入兽舍，工作人员守候，一旦大熊猫排出小便，立即将大熊猫放到其它兽舍；(3)用清洁注射器采集地面新鮮尿样，装入冷冻管，做好标记，然后立即放入冷冻或冷藏装置。现有资料无任何关于如何判断大熊猫雌激素真实峰值的报道以及相关技术与判断标准，本发明将解决如何判断大熊猫雌ニ醇的真实峰值，同时确定判断标准，并将雌ニ醇真实峰值对应的大熊猫排尿时间确定为雌ニ醇真实峰值的出现时间。大熊猫尿样采集间隔时间会直接影响到对峰值的判断，间隔时间过长会漏掉真实的峰值，间隔时间过短一方面会増加工作量以及对动物的干扰，另一方面会降低采样的可行性。现有资料报道的大熊猫尿样采集时间不确定且不统一，有的采集时间间隔长达I天， 会导致对峰值时间的判断误差范围较大；而本发明采用的采样时间间隔方案在发情高峰期间隔时间为3小时左右，使对大熊猫雌ニ醇峰值时间的判断误差范围缩小到I. 5小时左右，大大缩小了对大熊猫雌ニ醇峰值时间的判断误差。现有公开报道对大熊猫雌激素峰值的判断时间均单纯检测尿液雌激素水平，而没有检测发情高峰期孕激素水平与行为学综合判断。判断雌激素是否出现真实峰值的关键是判断雌激素是否出现真实的下降，一旦监测出现雌激素下降，尚不能判断究竟是雌激素波动还是真实的下降。为了解决该问题本发明一方面在监测尿液雌ニ醇的同时监测尿液孕酮水平，同时确定量化雌ニ醇真实下降的标准，采用行为学辅助手段综合判断大熊猫尿液雌ニ醇是否为真实下降。判断雌ニ醇是否出现真实峰值的关键是判断雌ニ醇是否出现真实的下降，本发明将通过统计分析尽可能多的大熊猫发情期雌ニ醇数据，确定大熊猫雌ニ醇峰值的下降速度參考值范围来量化确定大熊猫雌ニ醇是否出现真实下降。一旦监测到大熊猫出现可疑峰值，通过加大采样密度将采样间隔时间缩短到3小时左右连续采样，监测雌ニ醇下降的速度来确定雌ニ醇是否为真实下降。成都大熊猫繁育研究基地多年来对共计78例大熊猫雌ニ醇变化规律进行了统计分析，分析雌ニ醇从真实峰值下降50%以上所需的最短时间分布，绘制出如图I所示的发情期雌性大熊猫雌ニ醇从真实峰值下降50%所用时间分布频率，采用百分位数法确定大熊猫尿雌ニ醇峰值下降50%所用时间參考值范围，结果见表I :表I.雌ニ醇真实峰值下降50%所需时间(h)
权利要求
1.一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，包括以下步骤 (1)春季繁育期间，按时间要求对雌性大熊猫进行尿样收集，同时观察大熊猫发情行为，在尿样上标记后进行冷冻或冷藏保存，然后对尿样采用酶联免疫吸附试验检测雌二醇值和孕酮值； (2)在以大熊猫排尿时间作为横坐标、以雌二醇值和孕酮值作为纵坐标的平面坐标上，分别标出排尿时间及其对应的雌二醇值和孕酮值所确定的两组坐标点，将两组坐标点分别依次连接起来，绘制出雌二醇值变化曲线图和孕酮值变化曲线图，找出雌二醇最大峰值出现时间及其对应的孕酮值； (3)根据雌二醇最大峰值出现时间前的孕酮值计算出发情雌性大熊猫孕酮基础值，并计算出雌二醇最大峰值或其后的雌二醇峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值； (4)依据雌二醇值变化曲线图和孕酮值变化曲线图，将雌二醇最大峰值或其后的雌二醇峰值在下降幅度达到50%以上所用的时间、雌二醇从最大峰值或其后的峰值在下降的过程中孕酮值是否呈上升趋势和大熊猫是否出现典型发情高峰行为、雌二醇最大峰值或其后的雌二醇峰值所对应的的孕酮值与孕酮基础值的比值等情况同时结合起来，共同判断出大熊猫雌二醇真实峰值。
2.根据权利要求I所述的一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，其特征在于若雌二醇最大峰值在10小时 20小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌二醇连续下降到基础值、雌二醇最大峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于2，同时在雌二醇从最大峰值下降的过程中孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌二醇最大峰值为大熊猫雌二醇真实峰值。
3.根据权利要求I所述的一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，其特征在于若雌二醇最大峰值在20小时 31小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌二醇连续下降到基础值、雌二醇最大峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于I. 8，同时在雌二醇从最大峰值下降的过程中孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌二醇最大峰值为大熊猫雌二醇真实峰值。
4.根据权利要求I所述的一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，其特征在于若雌二醇从最大峰值下降50%的时间在20小时以上、雌二醇最大峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值小于I. 8，同时雌二醇最大峰值之后出现一个或多个峰值、且雌二醇从最大峰值下降的过程中孕酮值未呈上升趋势和大熊猫未出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌二醇最大峰值为假峰值；此时，大熊猫雌二醇真实峰值为雌二醇最大峰值之后的某一峰值，并且该峰值必须同时具备在10小时 20小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌二醇连续下降到基础值、该峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于2、在雌二醇从该峰值下降的过程中该峰值对应的孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为等情况。
5.根据权利要求I 4所述的任何一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，其按时间要求对雌性大熊猫进行尿样收集的过程如下 (1)观察雌性大熊猫外阴部，若外阴部出现红肿后，则每天收集I份雌性大熊猫晨尿； (2)从雌二醇连续上升后的第4天开始，每天间隔8小时左右收集3份尿样； (3)雌性大熊猫发情高峰行为前后，每天间隔5小时左右收集5份尿样； (4)一旦监测到雌二醇值有下降趋势，将尿样收集间隔时间缩短为3小时左右。
6.根据权利要求5所述的一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，其每一次大熊猫尿样收集包括以下步骤 (1)清洁并晾干兽舍硬化地面； (2)将需收集尿样的大熊猫放入兽舍，工作人员守候，一旦大熊猫排出小便，立即将大熊猫放到其它兽舍； (3)用清洁注射器采集地面新鲜尿样，装入冷冻管，做好标记，然后立即冷冻或冷藏保存。
全文摘要
本发明公开了一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，其通过收集和化验分析春季繁育期间雌性大熊猫尿样，将雌二醇最大峰值或其后的雌二醇峰值在下降幅度达到50％以上所用的时间、雌二醇从最大峰值或其后的峰值在下降的过程中孕酮值是否呈上升趋势和大熊猫是否出现典型发情高峰行为、雌二醇最大峰值或其后的雌二醇峰值所对应的的孕酮值与孕酮基础值的比值等情况同时结合起来，共同判断出大熊猫雌二醇真实峰值；由于本发明是从目前最大数据量的78例发情期大熊猫雌二醇变化规律统计分析中总结出的，因此具有非常高的可靠性，不仅填补了大熊猫研究领域的空白，还为提高圈养大熊猫人工授精受孕率提供了科学依据。
文档编号G01N33/74GK102735852SQ20121019176
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者侯蓉, 兰景超, 张志和, 王成东, 罗娌, 黄河, 黄祥明 申请人:成都大熊猫繁育研究基地