专利名称：过滤血浆的装置和方法
技术领域：
本发明提供从全血中分离血浆的系统、装置、试剂盒和方法。特别地，本发明提供以最少的能量输入从全血中分离出一定量(如固定体积)血浆的系统、装置和方法。
背景技术：
在复合生物流体可以被用于分析分析物前，需要许多上游步骤。例如，为进行HIV病毒载量检测，将血浆从血液中分离是第一个上游步骤，因为血红蛋白和血细胞会干扰随后的病毒RNA的扩增和检测。分离血浆对传染性疾病的检测和诊断也是一个关键的上游步骤。例如，用HIV特异性抗体检测成年人中的HIV或使用HIV核心p24蛋白检测婴儿中的HIV,都需要从全血中分离血浆。在实验室条件下，从全血中分离血浆是通过将血液以3000g离心20分钟来实现。这样做时，血液的固体组分在沉积物中下沉，而上清液由血浆组成。该方案通常需要受过训练的实验员手动地将上清液吸出，以进行进一步的分析。虽然大型自动化样品制备系统能够省略手动步骤，但是这些设备是昂贵的仪表，这使得它们不适用于资源有限的检测或即时现场护理检测(point-of-care testing)。已经设计出了一些通过微流体平台(micro-fluidic platform)将离心血液分离与进一步的下游步骤整合的方法(Brenner et al.Special Publication-Royal Societyof Chemistry2004，296:566-568.，Haeberle et al.Lab on a Chip2006，6:776-781.，Kanget al.Special Publication-Royal Society of Chemistry2004,296:614-616.,Madou et al.Biomedical Microdevices2001,3:245-254.,Toner&Irimia.Annual Review of Biomedical Engineering2005，7:77-103.，Luo et al.J ClinMicrobio/2005, 43:1851-1857.,通过援引的方式将以上文献的全部内容纳入本文)。然而，这些方法仅对非常有限体积的全血有效，需要使用产生离心力的设备，容易堵塞和/或仅能达到有限的纯度。使用合成膜将血浆从血液分离避免了由离心分离和微流体系统出现的一些问题；然而由于需要多个过滤层，因此所述设备复杂(Vogel et al.BoehringerMannheim GmbH; 1984., Vogel et al.Boehringer Mannheim GmbH; 1989.,通过援引的方式将其纳入本文)，该设备本身较脆且很难用于所使用的膜材料(如玻璃纤维)，而且含有干扰试验的材料(Baumgardner&Loewen.Ahlstrom Filtration, Inc.; 1993., Loewen&Baumgardner.Tappi Journal 1996，79:183-184.，通过援弓I的方式将其全部纳入本文)，且含有妨碍血液流进入滤器的材料(Suzuki&Ho:A magnetic force driven chaotic micro-mixer,pp.40-43; 2002:40-43. ，通过援弓I的方式将其全部纳入本文)
发明内容
在一些实施方式中，本发明提供一种过滤血浆的方法，所述方法包括:(a)提供:(i )过滤器模块，其中所述过滤器模块包括设置为允许血浆而不允许其他血液组分通过的过滤器；(ii)血浆收集模块，其中所述血浆收集模块包括设置为通过毛细管作用将血浆吸进血浆收集模块的收集膜jP(iii)血样；(b)将血样加到过滤器模块的过滤器中；(c)将血浆收集模块的收集膜放置为直接与过滤器模块的过滤器接触；和((1)通过过滤器将血浆吸入血浆收集模块中。在一些实施方式中，所述吸入是被动的。在一些实施方式中，所述吸入不需要电泳、离心或高于大气压的压力。在一些实施方式中，过滤器模块可容纳固定体积的血样。在一些实施方式中，所述血浆收集模块可容纳固定体积的血浆。在一些实施方式中，所述血浆收集模块的固定体积小于过滤器模块的固定体积。在一些实施方式中，血浆收集模块的固定体积不依赖于血样的体积。在一些实施方式中，血浆收集模块的固定体积不依赖于血样的血细胞比容。在一些实施方式中，过滤器包括VIVID GF膜。在一些实施方式中，收集膜包括AHLSTR0M142纤维收集垫。在一些实施方式中，收集膜包括PALL A/D纤维收集垫。在一些实施方式中，所述方法进一步包括(e)将血浆存储到血浆收集模块中。在一些实施方式中，本发明提供一种将血浆从全血中分离的装置，所述装置包括:(a)过滤器模块，其中所述过滤器模块包括设置为允许血浆而不允许其他血液组分通过的过滤器；和(10血浆收集模块，其中所述血浆收集模块包括设置为通过毛细管作用将血浆吸进血浆收集模块的收集膜。在一些实施方式中，过滤器模块可容纳固定体积的全血。在一些实施方式中，血浆收集模块可容纳固定体积的血浆。在一些实施方式中，血浆收集模块的固定体积小于过滤器模块的固定体积。在一些实施方式中，过滤器包括VIVID GF或VIVIDGR膜。在一些实施方式中，收集膜包括AHLSTR0M142，PALL ACCUffIK或PALL A/D纤维收集垫。在一些实施方式中，所述设备在收集模块中包括PMPs。在一些实施方式中，所述设备在收集模块中包括分析试剂。本文中还描述了其他的实施方式。


图1显示了膜的侧视图，所述侧视图显示了膜上的血液加样点、膜上的血液前端和血衆前端。图2显示了横向流动结构，所述结构显示了将血细胞从血浆分离的样品垫，收集固定体积血浆的收集垫和收集额外血浆的吸水垫。图3显示了纵向流动设置:细胞分离膜和血浆收集膜被夹在塑料顶板和底板之间。图4显示了多聚阳离子季铵盐(poly-cation-merquat)的化学结构。图5显示了循环阈值(Ct)对1gui的作图(HIV-1病毒RNA的拷贝):方形表示当使用IPF方法纯化含有HIV-1的血浆样品时获得的Ct值；菱形表示用VFl将血浆从含有HIV-1的全血中分离时和用Ahlstroml42收集血浆时获得的Ct值。图6显示了由IOX技术制作的柱芯片的横截面图，该视图显示了高为14μ m且底部尺寸为151μ m的柱子。图7显示了一种示例性的血浆单元设计。该血浆单元有两部分，分别为细胞分离模块和血浆模块。在分离后，将该血浆模块移走并转移到系统分析仪中用于处理的卡盘中。
图8显示了一种示例性的第一代血浆分离和收集模块:(左)与分离模块连接的PALL VIVID GR细胞分离膜；(中间)与收集模块连接的PALL ACCUWIK血浆收集膜；(右)用于将血浆从全血中分离的彼此连接的细胞分离和收集模块。图9显示了一种示例性的第二代血浆分离和收集模块:(从左到右)与带有粘合剂的PALL VIVID膜连接的细胞分离模块，与PALL ACCUffIK连接的抗旋转插入和螺钉定位装置。图10显示了一种用于血浆单元压力研究的定位机械结构。图11显示了将收集的血浆体积(正方形)和每毫升血液中600个hiv-Ι病毒拷贝预计的循环阈值(三角形)对加入到血浆单元中的全血体积的作图。图12显示了以三个不同的VIVID膜尺寸将125 μ L血液加入到血浆单元中的PALLACCUffIK膜(血浆收集模块)上收集的血浆体积的作图。图13显示了将收集的血浆体积(正方形)和对每毫升血液中600个HIV-1病毒拷贝估计的循环阈值( 环)对血液中的血细胞比容水平(％)作图。图14显示了将使用血浆分离和收集模块从125 μ L全血中分离出的血浆体积(μ L)对血液血细胞比容(百分比)的作图。正方形表示从拷贝(duplicates)中测量的不同血浆样品中获得的血浆平均量。实线表示从所有样品中收集的血液平均体积，虚线表示平均值±2的标准差。图15显示了 IPF步骤的示意图(左):捆绑在NA的PMPs借助外部磁铁将其从溶解液中通过液体蜡移动到洗脱液中；(右)模塑卡盘含有裂解缓冲溶解液、洗脱液和着色的液体蜡。图16显示了循环阈值(Ct)对1gltl(每μ L血浆中HIV-1的拷贝)作图。正方形表示使用血浆分离和收集模块分离的样品，椭圆表示使用离心法分离的点。图17显示了来自血浆的HIV-1与保存在ACCUWIK膜中的Ambion PMPs的定量RT-PCR:4种不同RNA浓度的Ct值对HIV-1病毒拷贝数的1gltl作出的标准曲线。实心方块
是(^值。图18显示了 Bland-Altman图，该图比较了裂解缓冲液中和ACCUWIK膜中带有PMPs的样品:实方块显示了两种方法的不同。图19显示了血液分离和血浆收集膜没有显著地结合p24蛋白分析物。图20显示了用本发明所述装置分离的含有分析物峰(analyte-spiked)的全血中收集的血浆中观察到分析物特异性信号没有损失。图21显示了用本发明所述装置分离的含有分析物峰的全血中收集的血浆中观察到分析物特异性信号没有损失。图22显示了用分析特异性洗涤剂干燥的收集垫的输出信号与溶液中有洗涤剂与分析物的反应相当。图23显示了用分析特异性洗涤剂和蛋白分析物干燥的收集垫的输出信号与溶液中洗涤剂与分析物的反应相近。图24显示了过滤器元件的部分的抓斗一次性(单用)塑料组件的原理图。抓斗将分离过滤器结合到其本身和与外部血浆收集元件的接口，所述收集元件包含收集膜。图25显示了(a)抓斗的上半部被折叠和关闭。左侧和右侧的锁定稍锁住并保持抓斗关闭，如(b)中的截面示意图所示。图26显示了(左)抓斗塑料部分的示意图。将分离过滤器对齐并与抓斗结合，该处是使用超声波焊接通过能量导块结合的；和(右)结合的抓斗和分离过滤器的示意图。能量导块塑料融化并流进分离过滤器，形成伪环形障。图27显示了(左)关闭且锁住的抓斗的示意图，所述抓斗有与其结合(例如使用能量导块通过超声波焊接)的分离过滤器；和(右)左示意图的截面视图，该视图显示分离过滤器被结合以便当抓斗关闭时其与抓斗的下部齐平。图28显示了(a)血浆收集元件的俯视示意图，塑料基板测试条带有小片的与双面诊断相容的粘合剂，这可将收集膜结合到基板测试条带上；(b)收集元件的侧视图；(C)侧视图的分解图(红色虚框)显示了结合基板测试条带和收集膜的折痕、穿孔和薄的粘胶层。图29显示了(左)具有各自膜和过滤器的血浆收集元件和过滤器元件的示意图；和(右)通过槽滑进过滤器元件且与后壁匹配的收集元件。图30显示了(左)与过滤器元件结合的收集元件的示意图，在该处抓斗的上部已经被折下并通过锁定稍锁住了 ；(右)这使得分离过滤器和收集膜重叠且压缩到一起，这可促进血液分离。图31显示了(左)展示用于血液分离的组合模块的示意图；和(右)组合模块的透明侧视图，该视图显示了收集元件基板测试条带中与折痕结合的边缘。图32显示了使用抓斗过滤器元件和血浆收集元件的血液分离过程的分步概貌:Ca)将血样分配到分离过滤器中；(b)分离过滤器通过血浆传递至收集膜；(c-d)操作员压紧左侧和右侧的锁定稍下部以打开过滤器元件的上部；和((1)将过滤元件和收集元件彼此分开且可以用于随后的测试过程(如⑶4记数、PCR、免疫测定)。
具体实施例方式定义为了帮助理解本发明，将一些术语和词组定义如下:本文中使用的术语“受试者”是指用本发明所述方法处理的生物体。所述生物体优选包括但不局限于哺乳动物(如鼠科动物、猿类、马科动物、牛科动物、猪、犬科动物、猫科动物、灵长类等)，且最优选人类。在本发明中，术语“受试者”通常是指已经提供样品或被取走样品(如组织样品、流体样品(如血液样品))的生物体。当涉及人类受试者时通常使用术语“患者”。本文中使用的术语“诊断”是指通过体征和症状(如对常规疗法的抵抗)或基因分析、病理学分析、组织学分析等识别疾病。本文中使用的术语“体外”是指人工环境和在人工环境内发生的过程或反应。体外环境包括但不局限于试管。术语“体内”是指自然环境(如动物或细胞)和在自然环境中发生的过程或反应。本文中使用的术语“样品”是指广泛意义上的样品。样品可以包括细胞、组织或液体(如血液、血浆等)、从细胞分离的材料、基因组DNA (溶液中或束缚在固体支持物上例如用于Southern印记分析)、RNA (溶液中或束缚在固体支持物上例如用于Southern印记分析)、cDNA (溶液中或束缚在固体支持物上)等。
本文中使用的术语“提取”或“提取的”是指从至少一个通常与其天然原料相关的组分或污染物中识别和分离的样品。提取的样品以一种与其自然存在的形式不同的形式或环境存在。相反，未提取的样品基于其在自然存在的状态。本文中使用的术语“被纯化”或“纯化”是指是指从样品中除去组分(如污染物、不想要的组分)。本文中使用的术语“实质上被纯化”是指至少60%，优选75%，更优选90%、95%、99%或者更多的分子从通常与它们相关的其他组分中释放出来。本发明的详细描述本发明提供从全血中分离血浆的系统、装置、试剂盒和方法。特别地，本发明提供以最少的能量输入从全血中分离出一定体积(如固定体积)血浆的系统、装置和方法。在一些实施方式中，本发明提供从全血中分离血浆的系统和装置。在一些实施方式中，所述装置将血浆与其他血液组分(如血细胞)分离。在一些实施方式中，所述装置纯化血浆。在一些实施方式中，所述装置提取血浆。在一些实施方式中，所述装置浓缩血浆。在一些实施方式中，所述装置从全血中有效地分离和浓缩固定体积的血浆。在一些实施方式中，本发明从全血中分离、提取、纯化和/或浓缩血浆而没有额外的能量输入(如不需要加热、离心、电等)。在一些实施方式中，本发明提供过滤器兀件和收集兀件。在一些实施方式中，将全血(如未过滤的)加入到过滤器元件中，并将血液通过过滤器元件吸入(如通过毛细管作用、重力等)到收集元件中。在一些实施方式中，本发明提供过滤器兀件。在一些实施方式中，一种或多种血液组分(如细胞组分)比血浆移动通过过滤器元件更慢。在一些实施方式中，除血浆外的血液组分(如细胞组分)比血浆移动通过过滤器元件更慢。在一些实施方式中，一种或多种血液组分(如细胞组分)不能移动通过过滤器元件。在一些实施方式中，除血浆外的血液组分(如细胞组分)不能移动通过过 滤器元件。在一些实施方式中，血浆快速(例如比其他血液组分更快速)前进通过过滤器元件朝向和/或进入收集元件。在一些实施方式中，过滤器元件包括过滤器、膜、基质和/或垫，所述垫可以根据毛细管作用将血浆与其他血液组分分离。虽然本发明并不局限于任一特殊的作用机制，且作用机制的理解不是实践本发明所必需的，但是液体通过毛细管作用移动通过材料是由下述等式控制的:d=(2YCOS0)/(pgr)，其中Y是液态空气表面张力(能量/面积)，Θ是接触角，P是液体的密度(质量/体积)，g是重力加速度(长度/时间2)，和r是通过材料的半径路径(长度)。因此，不同的液体基于液态空气表面张力和液体的密度以不同的速率移动通过材料。在一些实施方式中，血浆比其他血液组分(如细胞组分)更快地移动通过材料(如过滤器元件)。在一些实施方式中，本发明基于通过过滤器材料的毛细管移动速率不同将血浆与其他全血组分分离。在一些实施方式中，过滤器元件包括配置为过滤器和/或膜，以使血浆和其他全血组分以不同的速率通过。在一些实施方式中，过滤器兀件包括血衆分离膜。在一些实施方式中，过滤器兀件包括VIVID血浆分离膜。在一些实施方式中，过滤器元件包括VIVID GF血浆分离膜。在一些实施方式中，配置过滤器兀件以分离确定体积的全血(如15 μ L、25 μ L、50 μ L、75 μ L、100 μ L、125μ L、150y L、200y L、300y L、400y L、500y L、750y L、lmL、2mL、3mL 等)。在一些实施方式中，过滤器元件包括任一合适尺寸的膜。在一些实施方式中，过滤器元件包括任一适合直径(如 5mm、8mm、10mm、12mm、15mm、18mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm 等)的膜。本发明并不局限于过滤器元件中使用的材料，而且本领域人员所了解的任何可以提供合适的过滤性质的材料都可以在本发明中使用。在一些实施方式中，过滤器元件是一次性的。在一些实施方式中，过滤器元件是可重复使用的。在一些实施方式中，过滤器包括模塑抓斗(clam shelI)(如一次性的模塑抓斗)(参见图24-25)。在一些实施方式中，过滤器兀件包括斗体(shell)(如单用(single-use)斗体)和分离过滤器(参见图26_27)。在一些实施方式中，抓斗组分是注射模塑(如来自塑模塑料树脂)。在一些实施方式中，过滤器元件包括与分离过滤器结合的抓斗元件。本发明并不局限于过滤器元件中使用的材料或结构，而且本领域技术人员所了解的任何可以提供合适的过滤性质的材料都可以在本发明中使用。在一些实施方式中，本发明提供收集元件。在一些实施方式中，收集元件包括基底、垫、基质、材料和/或过滤器。在一些实施方式中，设置收集元件以从全血样品(例如10yL>20yL>30yL>40yL>50yL>60yL>70yL>80yL>90uL>100y L、200 μ L、300 μ L、400 μ L、500 μ L、ImL等)中收集固定体积的血浆。在一些实施方式中，收集元件包括血浆分离膜、收集垫、收集基质等。在一些实施方式中，收集元件包括一个或多个玻璃纤维、聚酯、硝化纤维和/或纤维素。在一些实施方式中，收集元件包括一种或多种材料，所述材料选自 WHATMAN Fusion5 (Whatman Diagnostic Catalogue2010, page8;通过援引的方式将其全部纳入本文)，PALL ACCUffICK, PALL A/D, AHLSTR0M111 (Ahlstrom Laboratory ProductsCatalog (2009), pagel5;通过援引的方式将其全部纳入本文)，AHLSTR0M151 (AhlstromLaboratory Products Catalog (2009)，pagel5;通过援引的方式将其全部纳入本文)，和/ 或 AHLSTR0M142 (Ahlstrom Laboratory Products Catalog (2009)，pagel5;通过援引的方式将其全部纳入本文)膜、和/或本领域技术人员知道的任何其他合适的膜、垫或基质材料。在一些实施方式中，收集元件包括AHLSTR0M142收集膜。在一些实施方式中，过滤器元件包括任一合适直径(如2臟、4臟、6臟、8臟、10mm、12臟、15臟、2Ctam、3Ctam、4Ctam、5Ctam等)的膜。在一些实施方式中，收集元件包括基底测试条带、诊断双面粘合剂和收集膜。在一些实施方式中，收集元件包括收集膜。在一些实施方式中，收集元件包括诊断双面粘合剂。在一些实施方式中，收集元件包括基底测试条带。在一些实施方式中，收集元件包括基底测试条带、诊断双面粘合剂和收集膜。本发明并不局限于收集元件中使用的材料或其结构，而且本领域技术人员所了解的任何可以提供合适的过滤性质的任一材料或结构都可以在本发明中使用。在一些实施方 式中，过滤器元件和收集元件包括单个单元。在一些实施方式中，过滤器元件和收集元件包括分离收集和过滤器模块。在一些实施方式中，分离模块和过滤器模块可由操作衔接和/或可衔接。在一些实施方式中，过滤器模块包括过滤元件。在一些实施方式中，过滤器模块中的过滤器元件(如膜)是可更换的且过滤器模块可使用一个新的过滤器元件(如膜)而重复使用。在一些实施方式中，收集模块包括收集元件。在一些实施方式中，收集模块中的收集元件(如膜)是可更换的且收集模块可使用一个新的收集元件(如膜)而重复使用。在一些实施方式中，本发明提供收集模块中用于收集血液(如来自指刺、血管等)的基质。在一些实施方式中，本发明提供从指刺收集血液的基质。在一些实施方式中，当加入全血时，本发明将血浆与细胞分离。在一些实施方式中，通过血浆分离效率的最大化使得需要的血液数量最少。在一些实施方式中，本发明的装置提供全血组分(如血细胞)与血浆的分离。在一些实施方式中，分离的血浆和细胞组分可以各自用于随后的应用中(如测试)。例如，将细胞血液组分与血浆分离以监控CD4数，并将血浆组分用于测量病毒载量。通过利用细胞和血浆组分，本发明的装置提供了用于多种不同分析的样品(参见图7)。在一些实施方式中，系统、装置和方法提供全血中血浆组分与细胞组分的定时分离。在一些实施方式中，血浆与其他血液组分的分离在I小时内(如45分钟、30分钟、20分钟、15分钟、10分钟、8分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、I分钟、30秒)完成。在一些实施方式中，系统、装置和方法收集固定量的血浆。在一些实施方式中，系统、装置和方法在膜、过滤器和/或垫(如ALLST0M142)上收集固定量的血浆。在一些实施方式中，本发明收集固定体积的血浆，并因此提供测量装置。在一些实施方式中，本发明的装置收集固定体积的血浆，而不依赖于加入的血液的体积。在一些实施方式中，本发明的装置收集固定体积的血浆，而不依赖于加入的血液的血细胞比容。在一些实施方式中，本发明的系统、装置和方法从全血样品(如 ομ L、20y L、30y L、40y L、50y L、60y L、70y L、80y L、90μ L、100y L、200y L、300y L、400y L、500y L、lmL等)中收集固定体积的血浆。在一些实施方式中，本发明的系统、装置和方法收集约50 μ L的血浆。在一些实施方式中，本发明的装置提供收集选择体积的血浆，以提供想要的样品中的病毒载量(如体积为50 μ L提供每毫升血液600HIV拷贝的分析灵敏度，用于通过RT-PCR进行HIV病毒载量检测)。在一些实施方式中，本发明的装置、系统和方法被动的操作，而不需要任何主动的泵、离心、电泳和/或电来操作。在一些实施方式中，被动分离可以通过毛细管作用和/或重力来实现。在一些实施方式中，本发明的装置、系统和方法提供非实验室、外部场所(如在实地)和/或即时现场护理位置的血浆分离。在一些实施方式中，收集元件(如膜)小于分离元件(如膜)。在一些实施方式中，收集元件(如膜)小于分离元件(如膜)的装置和/或系统用来将血浆浓缩到小体积。在一些实施方式中，将血浆浓缩到小收集元件中有助于下游的需要提高灵敏度的分析步骤(例如免疫分析，或用于增加捕获到顺磁颗粒上的核酸)。在一些实施方式中，本发明的装置、收集元件和/或收集模块提供或作为血浆储存元件。在一些实施方式中，本发明提供血浆储存元件。在一些实施方式中，血浆存储在收集元件中(如收集基质)。在一些实施方式中，当收集元件中含有血浆时血浆被运输。在一些实施方式中，在储存和/或运输血浆之前，含有被过滤的血液组分的过滤器元件被废弃。在一些实施方式中，本发明的装置、收集元件和/收集模块与下游过程相结合(如用于HIV病毒RNA提取、纯化和扩增的的卡盘或其它装置；用于HIV抗体或ρ24蛋白等检测的横向流系统)。在一些实施方式中，本发明的装置或系统包括用于分析或进一步处理分离过的血浆的下游模块。在一些实施方式中，收集元件允许收集的血浆直接提取到用于进一步分析和/或处理的缓冲液中。对于病毒载量的应用，血浆收集膜允许将血浆中存在的病毒RNA直接提取到缓冲液(如Ambion裂解/结合缓冲液(Applied Biosystem))中,用于进一步下游处理。在一些实施方式中，从收集元件中直接提取省略了与其他方案有关的处理步骤，所述其他方案能够导致样品的丢失、污染或毁坏。对于横向流应用，血浆收集膜使得可以提取蛋白(如HIV特异性抗体、p24核心蛋白等)，以用于进一步下游处理。在一些实施方式中，分析试剂可以储存(干燥的或冻干的)在血浆收集模块中。在一些实施方式中，收集元件提供储存(如长期储存 )顺磁性颗粒(PMPs)的基质。在一些实施方式中，PMPs用于捕获核酸(如病毒RNA)和后续的处理。在一些实施方式中，收集元件允许使用磁力(由永久磁铁或电磁铁产生的)将PMPs提取到膜外面，省略对溶液搅拌和离心，以及通常与用于PCR应用的收集在过滤膜中的样品相关的步骤。在一些实施方式中，提供的试剂盒包括一个或多个或所有需要、充足且对制作或使用本文中描述的任一设备有用的组件。在一些实施方式中，试剂盒包括对照试剂、说明(如软件)、数据分析装置或任何其他想要的组件。实施例实施例1制备方法横向流分离。在横向流结构中测试用于血浆分离的三种不同的横向流膜，即PallCytosepl662, Watman Fusion5, Whatman MF1(参见图1)。膜的选择基于:制造商的推荐，所述膜有从100-200 μ L的全血中分离血浆而不产生堵塞的能力、孔径大小和过滤容量。当血液流过膜时，血浆前端比血液前端移动的更快(参见图1)。血液截面可以通过切除膜的红色截面来消除。收集的血浆体积是通过称量收集前后过滤纸和假设血浆的密度为1025Kg/m3确定的(Benson K:MCAT review.Emory Universityl999:141-199.,通过援引的方式整体纳入本文)。使用通过静脉穿刺收集的血细胞比容为50%的血样，用Cytosep膜观察到的最高的血浆回收率为75%。虽然加入更高毛细管数的收集垫可以进一步提高这些血浆的回收率(参见图2)，但是这些方法表现出下述局限:(1)流速慢使得该过程消耗时间，(2)血液前端的位置与血细胞比容、加入的血液体积和血液的其他流变性质有关，这需要使用者手工地给血液前端定位并切割膜以将血浆从全血中分离(3)收集固定体积的血浆也将需要切除固定长度的含有血浆的膜，这取决于膜的容量。对切除步骤的需求可通过使用另一种结构而被省略(参见图2)，血液收集在阻止血细胞流入收集垫的样品垫上。收集垫有收集固定体积血浆的尺寸。额外的血浆流入吸水垫，吸水垫像是蓄水池一样发挥作用。然而，在本发明的实施方式研发过程中进行的实验表明血红细胞前端并没有完全停止，而且上述的膜都没有完全阻止细胞泄露到收集垫中。为了消除这个问题，将样品垫做的足够大以适应与指刺收集有关的血液体积的变化。然而，这会降低血浆收集的效率。解决该问题的另一方法是在样品垫上加入精确量的血液。这可已通过首先将血液收集到带有血液体积指示的毛细管中，然后将其加入到样品垫中来实现。然而，这种方法给该过程增加了额外的步骤。纵向流分离。血浆分离在纵向流结构中实现(参照图3)。因为膜的孔径小，所以红细胞和白细胞通过分离膜被捕获然而血液的血浆组分可流过到达收集膜。血浆流速Q与血流的横截面积呈正比，且与流过的长度成反比。与横向流相比，由于纵向流的横截面积大且长度短，在纵向流中从细胞中分离血浆比横向流中快。实施例2膜膜是根据许多标准选择的，如从全血中提取血浆的效率，和简化从含有乙醇和硫氰酸胍(GuSCN)的裂解/ 结合缓冲液(Applied Biosystem>Carlsbad CA)的膜中提取RNA。在本发明实施方式的研发过程中进行了试验以确定挑选的膜从全血中分离血浆和样品收集的效率(参见图3)。测试了 PALLCytos印1662、Whatman VFl和PALL VIVID GR的血浆分离和 Ahlstromlll、Ahlstroml42、Whatman MFl 和 PALL ACCUWIK Ultra 的样品收集。血浆分离。使用制造商的推荐分离膜设置为有用于100 μ L血液的尺寸。使用制造商推荐的膜容量，收集膜有用于50 μ L血浆的尺寸。使用含有抗凝剂的新鲜血液样品。通过将已知量的血浆和血液选取到微量离心管中将血液样品的血细胞比容调整为50%。将血浆和细胞放到摇床上20分钟就可很好的混合。称量过滤膜，然后设置以用于测试(参照图3)。通过调整螺栓来施加压力以提供膜间的接触。将100 μ L血液加入到分离膜中，使其静置10分钟。随后再次称量收集垫。通过过滤前和过滤后的重量差除以血浆的密度可以计算收集的血楽■体积。血楽.的密度估计为1025kg/m3(Benson K:MCAT review.EmoryUniverSityl999:141-199.，以援引的方式全部纳入本文)，这是大约的平均值。然后用收集的血浆体积除以原始样品中血浆的总体积来计算血浆回收率。将分离膜和收集膜在生物毒性容器中处理掉。用70%的乙醇清洗该装备，干燥，然后用于进一步的研究。在本发明实施方式的研究过程中进行的实验结果表明VFl和VIVID GR对血浆分离表现出最佳的特性，而且111、142和ACCUWIK Ultra表现出血浆收集中有用的特性。(参见表I)。
权利要求
1.一种过滤血浆的方法，该方法包括 a)提供: i)过滤器模块，其中所述过滤器模块包括过滤器，所述过滤器设置为允许血浆而不允许其他的血液组分通过； ii)血浆收集模块，其中所述血浆收集模块包括收集膜，所述收集膜设置为通过毛细管作用将血浆吸入到血浆收集模块中；和 iii)血样； b)将所述血样加到所述过滤器模块的所述过滤器中； c)将所述血浆收集模块的收集膜放置为与所述过滤器模块的所述过滤器直接接触；和 d)将所述血浆通过所述过滤器吸入到所述血浆收集模块中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述吸入是被动的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述吸入不需要电泳、离心或高于大气压的压力。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述过滤器模块容纳固定体积的所述血样。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述血浆收集模块容纳固定体积的所述血浆。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述血浆收集模块的所述固定体积小于所述过滤器模块的所述固定体积。
7.根据利要求5所述的方法，其中所述血浆收集模块的所述固定体积不依赖于所述血样的体积。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述血浆收集模块的所述固定体积不依赖于所述血样的血细胞比容。
9.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括: e)将所述血浆储存在所述血浆收集模块中。
10.一种从全血中分离血浆的装置，该装置包括: a)过滤器模块，其中所述过滤器模块包括过滤器，所述过滤器设置为允许血浆而不允许其他血液组分通过；和 b)血浆收集模块，其中所述血浆收集模块包括收集膜，所述收集膜设置为通过毛细管作用将血浆吸到血浆收集模块中。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述过滤器模块容纳固定体积的全血。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述血浆收集模块容纳固定体积的所述血浆。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述固定血浆收集模块的所述固定体积小于所述过滤器模块的所述固定体积。
14.根据权利要求10所述的装置，其中所述过滤器包括VIVIDGF膜。
15.根据权利要求10所述的装置，其中所述收集膜包括AHLSTROM142或PALLA/D纤维收集垫。
16.根据权利要求10所述的装置，所述收集模块中包括PMPs。
17.根据权利要求10所述的装置，所述收集模块中包括分析试剂。
全文摘要
本发明提供从全血中分离血浆的系统、装置、试剂盒和方法。特别地，本发明提供以最少的能量输入从全血中分离出固定体积血浆的系统、装置和方法。
文档编号G01N33/49GK103229053SQ201180046347
公开日2013年7月31日 申请日期2011年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者D·M·凯尔索, K·苏尔, A·纳巴蒂扬, A·M·扬奇克博贾诺, S·J·皮克瑞尔, S·詹佳姆, S·古普塔 申请人:西北大学