专利名称：一种艾滋病检测质控血清的配制方法
技术领域：
本发明属于医学检验领域。具体涉及一种艾滋病检测质控血清的配制方法。
背景技术：
艾滋病是严重危害人类健康的超级瘟疫，它是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的。 目前艾滋病的检测使用最广泛的方法是酶联免疫吸附实验(ELISA)。但是，ELISA法在实际 中受很多因素影响，易导致检测结果出现偏差，为了提高每次实验的准确性，在HIV检测 过程中需要设立质控对照，通过对质控血清的检测值的变化进行监测，从而判断每次实验 的可靠性和重复性。因此，质控血清的质量和准确性是保证艾滋病检测可靠性的关键技术 环节。目前HIV检测中使用的质控对照通常为临界值质控血清，这种血清很难从临床直 接获得，因此，一般采用HIV强阳性血清进行稀释配制。配制的方法一般为通过反复稀释， 并进行检测其S/C0值(检测吸光度S与检测限cutoff的比值)，直到其S/C0值达到预定 值左右。由于ELISA方法在S/C0值达到预定值时具有极高的敏感性，因此这种方法的弊端 就是需要反复进行摸索稀释倍数和进行检测，直到其检测值恰巧可以落在想要的范围内。 需要耗费很多的时间、人力和检测费用。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种艾滋病检测质控血清的配制方法。该方法 简单易行，减少步骤和各种损耗，并且减少反复摸索稀释的盲目性和不可控性。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是
通过大量检测实验数据和数学模型分析，本发明人得出了以下结论(1)临床获得的 HIV强阳性血清的检测信号值远远超出了现有常规ELISA定性检测方法和仪器的上限， 需要进行千倍以上的稀释才能进入检测信号有效区间。(2)当取反应OD值(样本检测OD 值-阴性对照OD值)作为反应信号代替S/C0值时，在一定范围内，反应OD值与血清待检靶 物质的浓度具有良好的线性回归关系，其回归曲线是一条截距近似为0的直线，可以统一 表示为“Y=aX”其中Y代表反应OD值，X代表待检物浓度。基于上述论理，本发明提供了一种艾滋病检测质控血清的配制方法该方法包括 以下步骤
(1)选择阳性血清
所选用HIV阳性血清样本需经ELISA检测为强阳性，并经蛋白质印迹(以后简称 Western Blot)确证；
(2)选择和处理阴性血清
选用正常人血清，该血清为HIV抗体阴性、HBsAg阴性、HCV抗体阴性，并且无肉眼可见 的溶血、黄疸、乳糜颗粒、絮状沉淀物； 将上述阴性血清灭活补体，除菌备用；(3)最终稀释倍数的确定
a.第一步稀释
用处理后的阴性血清对HIV阳性血清进行10，100，1000……IOX梯度稀释，并对各稀 释样本进行ELISA检测，测得各样本的OD值，找出样本OD值相对于原阳性血清出现明显下 降的稀释倍数，即该稀释倍数为第一步稀释倍数，该样本作为下步稀释的母液；
b.第二步稀释
对上步获得的母液再进行2，4，8……2X系列稀释，并对各稀释样本进行ELISA检 测，测得各样本的OD值，计算出S/C0值和反应OD值，确定第二步稀释倍数，具体方法为
当2X系列稀释的样本中某一稀释倍数样本获得的S/C0值恰巧为所需配制的数值，直 接采用该稀释倍数为第二步稀释倍数；
当2X系列稀释的样本中没有S/C0值没有出现所需配制的数值，则进行以下计算 (i )选一个OD值在2.0以下，S/C0值最接近所需配制数值的稀释倍数，上下均可； ( )计算所选稀释倍数的反应OD值，所述反应OD值=该稀释倍数对应的样本OD 值-阴性对照OD值；
(iii )计算所需配制S/C0值的质控血清的反应OD值，所述反应OD值=所需配制的S/ CO值X cutoff值-阴性对照OD ；
(iv )根据以下公式计算第二步稀释倍数 X2=X1*Y1/Y2
其中，Χ2:第二步稀释倍数
Xl 步骤(i )中所选的S/C0值最接近所需配制值的稀释倍数 Yl 步骤( )所得的反应OD值 Y2:步骤(iii)所得的反应OD值
c.最终稀释倍数=第一步稀释倍数X第二步稀释倍数；
(4)稀释分装
将选定的阳性血清和阴性血清，按照步骤(3)确定的最终稀释倍数在无菌条件下进行 稀释，稀释后搅拌过夜，充分混勻，分装于冻存管中备用。上述方法中，所述阳性血清优选为Western Blot全条带的样本，并且是将几份 HIV强阳性血清混合物。上述方法中，步骤(2 )中，所述灭活补体是将所述阴性血清在56 °C条件下，处理30 分钟；所述除菌采用0. 45 μ m微孔滤膜过滤。上述方法中，所述步骤(4)中，确认最终稀释倍数后，进行稀释时采用逐步稀释法， 一次稀释倍数不超过10倍。本发明的有益效果本发明提出了 HIV临界值质控血清配制方法与现有方法相 比具有以下显著优势(1)大大简化了配制过程的核心环节，将确定稀释倍数的这一需要 反复摸索的流程简化为只需要两步稀释(先10倍系列稀释，再2倍系列稀释)，然后根据特 定信号值的换算可以直接得出最终稀释倍数，这样节省了该过程所需时间和人力和检测成 本。(2)配制过程目标性和可控性更强。由于ELISA方法的S/C0值具有极高的敏感性，现 有的一般方法只有经过反复摸索，才能找到检测值接近于目标的稀释倍数。这样就使配制 过程具有较大的盲目性和随机性。本发明只有按照上述步骤进行稀释，就能准确得出所需特定检测值的质控血清，流程步骤完全可控。这样就更适用于大规模产业化的配制生产。 (3)配制更准确。因为HIV强阳性血清需要上万倍稀释才能达到要求，而人工摸索稀释倍 数在后期阶段一般只能得出整数倍，这样的稀释倍数经过上百、上千倍以上的放大，其误差 范围也往往达到上百上千倍，这样往往造成摸索出来的试验结果和实际配制的结果差别很 大。而我们经过数学模型拟合的反应曲线具有非常好的回归系数，根据已知的测量点进行 换算得出的稀释倍数可以准确到小数点以后三位甚至更多，这样就极大的缩小了预试和实 际配制两者之间的误差。具体实施例方式
实施例1以配制S/C0=2的质控血清为例
1材料HIV阳性血清北京出入境检疫局从出入境人员中检出的HIV阳性。HIV阴性 血清本实验室从日常检测样品中或通过血液中心收集到的正常人血清，收集的血清要求 必须为HIV抗体阴性、HBsAg阴性、HCV抗体阴性。同时要求无肉眼可见的溶血、黄疸、乳糜 颗粒、絮状沉淀物。上述血清经56°C 30分钟灭活补体，并经0.45 μ m微孔滤膜过滤除菌备用。HIV ELISA试剂生物梅里埃公司Vironostika第四代试剂批号A57BA)； 仪器SEAC Alisei全自动酶联免疫检测系统
2方法
第一步稀释首先用阴性血清对HIV阳性血清进行10，100，1000……IOX梯度稀释并 用生物梅里埃第四代ELISA试剂检测。检测结果如下 表1阳性血清IOX系列稀释ELISA检测结果
权利要求
1.一种艾滋病检测质控血清的配制方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)选择阳性血清所选用Hiv阳性血清样本需经ELISA检测为强阳性，并经Wfestern Blot确证；(2)选择和处理阴性血清选用正常人血清，该血清为HIV抗体阴性、HBsAg阴性、HCV抗体阴性，并且无肉眼可见 的溶血、黄疸、乳糜颗粒、絮状沉淀物； 将上述阴性血清灭活补体，除菌备用；(3)最终稀释倍数的确定a.第一步稀释用处理后阴性血清对HIV阳性血清进行10，100，1000……IOX梯度稀释，并对各稀释 样本进行ELISA检测，测得各样本的OD值，找出样本OD值相对于原阳性血清出现明显下降 的稀释倍数，即该稀释倍数为第一步稀释倍数，该样本作为下步稀释的母液；b.第二步稀释对上步获得的母液再进行2，4，8……2X系列稀释，并对各稀释样本进行ELISA检 测，测得各样本的OD值，计算出S/C0值和反应OD值，确定第二步稀释倍数，具体方法为当2X系列稀释的样本中某一稀释倍数样本获得的S/C0值恰巧为所需配制的数值，直 接采用该稀释倍数为第二步稀释倍数；当2X系列稀释的样本中S/C0值没有出现所需配制的数值，则进行以下计算 (i )选一个OD值在2.0以下，S/C0值最接近所需配制数值的稀释倍数，上下均可； ( )计算所选稀释倍数的反应OD值，所述反应OD值=该稀释倍数对应的样本OD 值-阴性对照OD值；(iii )计算所需配制S/C0值的质控血清的反应OD值，所述反应OD值=所需配制的S/ CO值X cutoff值-阴性对照OD ；(iv )根据以下公式计算第二步稀释倍数 X2=X1*Y1/Y2其中，Χ2:第二步稀释倍数Xl 步骤(i )中所选的S/C0值最接近所需配制数值的稀释倍数 Yl 步骤( )所得的反应OD值 Y2:步骤(iii)所得的反应OD值c.最终稀释倍数=第一步稀释倍数X第二步稀释倍数；(4)稀释分装将选定的阳性血清和阴性血清，按照步骤(3)确定的最终稀释倍数在无菌条件下进行 稀释，稀释后搅拌过夜，充分混勻，分装于冻存管中备用。
2.根据权利要求1所述的艾滋病检测质控血清的配制方法，其特征在于，所述阳性血 清为Western Blot全条带的样本，并且是几份HIV强阳性血清的混合物。
3.根据权利要求1所述的艾滋病检测质控血清的配制方法，其特征在于，步骤(2)中， 所述灭活补体是将所述阴性血清在56°C条件下，处理30分钟；所述除菌采用0. 45 μ m微孔 滤膜过滤。
4.根据权利要求1所述的艾滋病检测质控血清的配制方法，其特征在于，所述步骤(4)中，确认最终稀释倍数后，进行稀释时采用逐步稀释法，一次稀释倍数不超过10倍。
全文摘要
本发明公开了一种艾滋病检测质控血清的配制方法，该方法是一种通过两步稀释法确定稀释倍数的临界值质控血清的配制新方法，该方法简单易行，减少步骤和各种损耗，并且减少反复摸索稀释的盲目性和不可控性。
文档编号G01N33/571GK102128927SQ20101061131
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者刘建礼, 张绍福, 朱红 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局