专利名称：结核分枝杆菌之超氧化物歧化酶的制作方法
背景技术：
超氧化物歧化酶催化超氧化物自由基(O2-)成为氧分子(O2)及过氧化氢(H2O2)的转变。因为这样的分子会与细胞的基因组DNA作用而诱导突变，所以超氧化物自由基的转变通常对细胞而言是有利的。
超氧化物歧化酶(SOD)基于它们对于活性所需要的无机原子而分类。已定义了三个SOD家族需要锰的超氧化物歧化酶(MnSOD)、需要铁的超氧化物歧化酶(FeSOD)以及需要铜和锌的超氧化物歧化酶(Cu，ZnSOD)。
MnSODs已发现存在于线粒体及原核生物中，而FeSODs已发现存在于原核生物、远古真核生物以及一些植物之中。Cu，ZnSODs起初发现于真核生物，后来在数种细菌之中发现。
巨噬细胞是脊椎动物免疫系统的重要力量。这样的细胞可藉由吞入病菌并以超氧化物自由基攻击而杀死病原体(例如细菌)。因此，分泌的Cu，ZnSOD可能在细菌性病原体，特别是在巨噬细胞中生存及生长的病原体的生存中起作用。
发明概述本发明是以在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中发现分泌的Cu，ZnSOD为基础。已发现特异性地与这个结核分枝杆菌SOD结合的抗体，可用于检测此细菌之存在。也发现结核患者发展出抗结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的抗体。因此，患者所产生之抗结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的抗体，是在该患者中对于结核病的诊断特征。
因此，本发明以一种抗体为特征，例如，一种可特异性地结合由SEQ ID NO2的氨基酸序列所组成之多肽的单克隆抗体，而SEQ ID NO2是结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的氨基酸序列。抗体特异性地结合多肽是指它基本上不会结合样品内的其它成份。Cu，ZnSOD或铜/锌超氧化物歧化酶，是加速超氧化物自由基转变至氧分子及过氧化氢的多肽，并且其超氧化物歧化酶的活性取决于铜及锌原子或离子的存在。
本发明也包括一种检测哺乳动物感染结核分枝杆菌的方法，包括(1)提供一段包括SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽；(2)在足以使抗体结合至此多肽的条件下，使此多肽与收集自哺乳动物的生物学样品接触(例如，人类血清样品)；以及(3)测定结合至此多肽之抗体的存在，其中此抗体的存在表示哺乳动物感染结核分枝杆菌。这个方法任选地包括移除不与此多肽结合的抗体的步骤。
本发明的特征还在于测试一化合物是否抑制多肽之超氧化物歧化酶活性的方法，包括(1)将此化合物与一多肽接触，此多肽是Cu，ZnSOD(也称为铜/锌超氧化物歧化酶)并具有与SEQ ID NO2至少50％相同性(例如，至少60、70、80、90或100％相同性)的氨基酸序列；(2)测量超氧化物歧化酶活性水平；以及(3)比较此化合物存在时与不存在时之超氧化物歧化酶活性水平。当此化合物存在时的超氧化物歧化酶活性水平比此化合物不存在时的超氧化物歧化酶活性水平低时，此化合物称为可抑制多肽的超氧化物歧化酶活性。此多肽可以在细胞(例如细菌)内，例如，在细菌的周质内。
为了加速本方法的检测或测试方法，可将多肽结合至固体的支持物(例如，塑料的支持物，例如微滴板)。此外，也可将多肽共价结合至固体支持珠(例如，琼脂糖)上。在此多肽与支持物之间的共价连结，可藉由本领域中所熟知的方法而达成。例如 ，此多肽可藉由将此多肽与化学活化形式的支持物反应，而共价连结至支持物(例如，CNBr活化的琼脂糖4B或EAH琼脂糖4B，可从Pharmacia获得)。此外，可将等量的多肽沉积在微滴板的每个孔中，藉此产生一种阵列(array)，在这种阵列上可平行地比较多个化合物，或针对结核分枝杆菌的存在分析多个样品。发明详述本发明涉及一种用于检测样品中之结核分枝杆菌的抗体，检测哺乳动物感染结核分枝杆菌的方法，以及测试化合物之抑制超氧化物歧化酶活性的能力之方法。本发明的这些方面通过发现结核分枝杆菌所产生之一种新的Cu，ZnSOD而实现。I.多肽在本发明之方法中，有用的Cu，ZnSOD多肽包括以下所说明的结核分枝杆菌Cu，ZnSOD多肽。在本发明之方法中，有用的Cu，ZnSOD多肽并不限于天然发生的序列。也可使用含有取代、删除或插入的Cu，ZnSOD，只要那些多肽保留至少一种与天然发生之多肽相关的活性，并且至少与天然发生之序列有至少50％的相同性。
为了测定两个序列的相同性百分比，针对理想比较之目的而比对序列(例如，为了与第二个氨基酸序列有理想的比对，可在第一个氨基酸序列之中插入间隙)。接着比对在相对应之氨基酸位置的氨基酸残基。当在第一序列的位置被第二序列中之相对应位置的相同氨基酸残基所占据时，则这些分子在那个位置就是相同的。在这两个序列之间的相同性百分比，是这些序列所共有的相同位置之数目的函数(也就是，相同性％＝相同位置的数目/所有位置的数目×100)。
两个序列之间的同源性及相同性之百分比的测定，可使用数学算法来达成。用于比较两个序列的数学算法之实例是Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268(1990)的算法，修正版是Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877(1993)的算法。这样的算法被纳入Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410(1990)的NBLAST及XBLAST的程序中。BLAST蛋白质搜索可与XBLAST程序一起执行，分数＝50，字长度＝3，以得到同源于在本发明的方法中是有用之蛋白质分子的氨基酸序列。为得到有间隙的比对之比较目的，可使用Gapped BLAST，如Altschul等人，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)所说明。当使用BLAST及Gapped BLAST程序时，可使用个别程序(例如，XBLAST及NBLAST)的预设参数。参见http//www.ncbi.nlm.nih.gov。另一个用于比对序列的数学算法是Myers等人，CABIOS(1989)的算法。这样的算法是并入ALIGN程序(第二版)之中，其为GCG序列比对软件包的部份。当使用此ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120重量残基表、12的间隙长度障碍以及4的间隙障碍。
在两个序列之间的相同性百分比，是使用上述的技术并允许间隙的存在而测定。在计算相同性百分比时，只有完全符合的才计算。
Cu，ZnSOD的实例是Cu，ZnSOD-谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白，这不是天然发生的，但在本发明之方法中是有效用的。这样的蛋白质可在细菌中大量制造，并可藉由谷胱甘肽亲和柱而轻易地分离。在SOD之候选抑制剂的存在或不存在下(即，候选结核分枝杆菌抗微生物剂)，此融合蛋白可用于活体外的SOD分析。II.抗体此处所使用的名词“抗体”，是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子之免疫活性的部份，也就是，包含抗原结合位点的分子，其可特异性地结合至抗原，例如，结核分枝杆菌Cu，ZnSOD。特异性地结合至结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的分子是可结合结核分枝杆菌Cu，ZnSOD，但基本上不与样品，例如，一种天然地包含结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的生物学样品，中的其它分子结合之分子。免疫球蛋白之免疫活性部份的实例包括F(ab)及F(ab’)2片段，这些片段可藉由以酶(例如，胃蛋白酶)处理抗体而产生。本发明提供与结核分枝杆菌Cu，ZnSOD结合的多克隆以及单克隆抗体。此处所使用的名词“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”，是指一群抗体分子，其只包含一种抗原的结合位点，这个位点有能力与结核分枝杆菌Cu，ZnSOD之特定的抗原决定位点引起免疫反应。单克隆抗体组合物因此对于与其免疫反应的结核分枝杆菌Cu，ZnSOD，典型地表现出单一的结合亲和性。
抗结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的多克隆抗体，可藉由以结核分枝杆菌Cu，ZnSOD免疫原，免疫适合的个体而制备。被免疫的个体之抗结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的抗体效价，可藉由标准方法随着时间监测，例如，使用固定化的结核分枝杆菌Cu，ZnSOD之酶联免疫吸附分析(ELISA)。如果需要的话，针对抗结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的抗体分子，可从哺乳动物中分离(例如，从血液中)，并进一步藉由熟知的方法而纯化，例如，藉由蛋白质A柱层析分析而得到IgG的部份。在免疫后的适当时间，例如，当抗结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的抗体效价是最高的时候，可从此个体得到制造抗体的细胞，并藉由标准技术而制备单克隆抗体，例如，在以下文献所说明的，Kohler等人，Nature 256495-497，1975；Kozbor等人，Immunol.Today 472，1983；以及Cole等人，单克隆抗体及癌症治疗，Alan R.Liss公司，77-96页，1985。用于生产各种单克隆抗体杂交瘤的技术是熟知的(参见，例如，Coligan等人编辑，免疫学的现今方法，John Wiley&Sons公司，纽约，1994)。简言之，将永生细胞系(典型地是骨髓瘤)与淋巴细胞(典型地是脾细胞)融合，而此淋巴细胞是来自以如上所述结核分枝杆菌Cu，ZnSOD作为免疫原而免疫的哺乳动物，并且筛选所产生之杂交瘤细胞的培养上清液，鉴定产生与结核分枝杆菌Cu，ZnSOD结合之单克隆抗体的杂交瘤。
许多用来融合淋巴球细胞与永生细胞系的熟知方法中的任何一种，皆可应用于产生抗结核分枝杆菌Cu，ZnSOD之抗体的目的(参见，例如，免疫学的现今方法，同上；Galfre等人，Nature 26655052，1977；Kenneth，单克隆抗体生物学分析的新方面，Plenum Publishing公司，纽约，1980；以及Lerner YaleJ.Biol.Med.，54387-402，1981)。此外，本领域技术人员将会体认，在这样的方法中有许多变异也是有用的。典型地，永生细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)是衍生自与淋巴细胞相同的哺乳动物。例如，藉由将来自本发明之免疫原制备物所免疫的小鼠之淋巴细胞，与永生小鼠细胞系，例如，对含有次黄嘌呤、氨基喋呤及胸苷的培养基(“HAT培养基”)敏感的骨髓瘤细胞系，融合而制成小鼠的杂交瘤。许多骨髓瘤细胞系的任何一种细胞系，根据标准技术，皆可用作融合配偶体，例如P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-Ag8或Sp2/O-Ag14骨髓瘤细胞系。这些细胞系可从ATCC获得。典型地，使用聚乙二醇(“PEG”)将对HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。由此融合所导致的杂交瘤细胞，接着用HAT培养基筛选，HAT培养基会杀死未融合的骨髓瘤细胞以及虽融合但无效的骨髓瘤细胞(未融合的骨髓瘤细胞过几天就会死亡，因为它们并没有转化)。使用标准的ELISA分析，针对结合结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的抗体，藉由筛选杂交瘤的培养上清液而检测产生本发明之单克隆抗体的杂交瘤细胞。
另一种制备分泌单克隆抗体之杂交瘤的方法，是藉由以结核分枝杆菌Cu，ZnSOD来筛选重组的组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)，而鉴定并分离抗结合结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的单克隆抗体，藉此分离可结合结核分枝杆菌Cu，ZnSOD之免疫球蛋白文库的成员。用于产生及筛选噬菌体展示文库的试剂盒是商业上可获得的(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录编号27-9400-01；以及Stratagen SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录编号240612)。此外，对于使用在产生及筛选抗体展示文库是特别经得起考验的方法及试剂的实例，可在以下文献中发现，例如，美国专利第5,223,409号；PCT出版编号WO92/18619、WO91/17271、WO92/20791、WO92/15679、WO93/01288、WO92/01047、WO92/09690及WO90/02809；Fuchs等人，Bio/Technology 91370-1372，1991；Hay等人，Hum Antibod Hybridomas 381-85，1992；Huse等人，Science 2461275-1281，1989；以及Griffiths等人，EMBOJ.12725-734，1993。
此外，抗结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的重组抗体，例如，嵌合的及人源化的单克隆抗体，包括人类及非人类两个的部份，可藉由标准的重组DNA技术而达成，也是在本发明的范围内。这样的嵌合及人源化的单克隆抗体，可藉由本领域中所熟知的重组DNA技术而制造，例如，使用下列文献所说明的方法，例如，PCT出版物WO87/02671及WO86/01533；欧洲专利申请第184187、171496、173494及125023号；美国专利第4,816,567及5,225,539号；Better等人，Science 2401041-1043，1988；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443，1987；Lie等人，J.Immunol.1393521-3526，1987；Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-218，1987；Nishimura等人，Canc.Res.47999-1005，1987；Wood等人，Nature 314446-449，1985；Shaw等人，J.Natl.Cancer Inst.801553-1559，1988；Morrison，Science 2291202-1207，1985；Oi等人，Bio/Techniques 4214，1986；Jones等人，Nature 321552-525，1986；Verhoeyan等人，Science 2391534，1988；以及Beidler等人，J.Immunol.1414053-4060，1988。
抗结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的抗体(例如，单克隆抗体)，可藉由标准技术(例如，亲和性柱层析分析或免疫沉淀)而分离结核分枝杆菌Cu，ZnSOD。抗结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的抗体，可加速来自细菌之天然结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的纯化，以及宿主细胞表达之重组产生的结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的纯化。此外，抗结核分枝杆菌Cu，ZnSOD之抗体，可用来检测结核分枝杆菌Cu，ZnSOD(例如，在细胞溶胞物中或在血清样品中)，以评估结核分枝杆菌Cu，ZnSOD蛋白质的丰富度。藉由将抗体与可检测的物质连结在一起而可加速检测。可检测的物质之实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质以及放射性物质。适合的酶之实例包括，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱脂酶。适合的辅基之实例包括，链霉抗生物素/生物素以及抗生物素/生物素。适合的荧光物质之实例包括，伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白。发光材料之实例包括，鲁米诺(Luminol)。生物冷发光材料之实例包括，虫萤光素酶、虫萤光素以及水母发光蛋白(aequorin)。适合的放射性材料之实例包括，125I、131I、35S或3H。III.以Cu，ZnSOD接触一化合物对于活体外的分析，可藉由将Cu，ZnSOD与此化合物在溶液、悬浮液或凝胶中混合，而使Cu，ZnSOD接触化合物。这个溶液、悬浮液或凝胶接着用于SOD分析。
对于细胞分析，任何Cu，ZnSOD多肽可在细胞中表达，如果此细胞并不是已经表达Cu，ZnSOD的，或任何Cu，ZnSOD多肽可在细胞中过度表达，如果此细胞已经表达Cu，ZnSOD的话。在细胞中表达蛋白质的方法是在本领域中所熟知的。
如果Cu，ZnSOD在细胞中，化合物可藉由本领域中所熟知的方法输送至细胞内。如果此化合物是可通透膜的分子，则此化合物可直接与此细胞混合，使得Cu，ZnSOD与此化合物接触。如果此化合物不是可通透膜的分子，例如许多大分子，或者如果此化合物是多肽、核酸或病毒载体，那么此化合物可藉由电穿孔输送至细胞内。
此外，细胞可以是体内的动物细胞。此化合物可藉由任何本领域公知的途径输送至此细胞，包括静脉内注射。另外，如果输送进细胞是需要的，则多肽化合物可藉由核酸或病毒载体而给药。IV.超氧化物歧化酶分析对于超氧化物歧化酶活性的分析可藉由任何本领域所知的标准技术而测定。例如，参见说明于Beauchamp等人，Anal.Biochem.44276-287，1971以及其中之参考文献的分析方法。
许多的这些分析是依靠氮蓝四唑(NBT)的光还原，其为一种由超氧化物自由基的产生所调节的过程。超氧化物歧化酶的活性是反应在NBT之还原的抑制上。NBT曝露适当光源会使之转变成蓝色染剂，可藉由560nm的吸光值而定量。然而在超氧化物歧化酶存在的情况下，NBT之光还原成蓝色染剂的情形会减少或排除。基于此概念的特异程序是本领域中已知的。例如，参见以下所说明的程序。
不需详细阐述，基于以上的揭露及以下的说明，相信本领域技术人员可利用本发明于极致。以下的实施例只是说明本领域技术人员如何实施此发明，并非用以限制本文之其余部份。任何在本文中所引用的出版物，都并入为参考资料。实施例1结核分枝杆菌Cu，ZnSOD的克隆和鉴定分别使用大肠杆菌株XL1 blue(Stratagen)以及BL21(DE3)(Novagen)进行克隆及重组蛋白的过度表达。使用结核分枝杆菌H37Rv作为电子显微镜分析。
根据标准方法执行克隆程序。藉由PCR从结核分枝杆菌的基因组扩增sodC基因的片段，使用寡核苷酸对5’-CATATGTCTACAGTTCCGGGTACCA-3’(SEQ ID NO3)以及5’-GGATCCAAGCTAGCCGGAACCAATGA-3’(SEQ IDNO4)，以用于全长克隆，而5’-CATATGCCAAAGCCCGCCGATCA-3’(SEQ ID NO5)以及5’-GGATCCAAGCTAGCCGGAACCAATGA-3’(SEQ ID NO6)则用于截短形式的克隆(说明如下)。将此PCR产物克隆进T-载体pT7-Blue(Novagen)，并随后亚克隆进表达载体pET15B(Novagen)的NdeI及BamHI位置。根据制造商的操作说明，使用ABIBigDye(PE Applied Biosystems)荧光测序化学及ABI PRISM310基因分析自动测序仪(PE Applied Biosystems)，而测序此克隆之片段的两条链。测序的结果显示sodC基因包含下列开放读框ATGCCAAAGCCCGCCGATCACCGCAATCACGCAGCTGTCAGCACGTCGGTCCTGTCCGCGTTGTTTCTGGGCGCCGGTGCCGCGCTGCTGAGCGCATGCTCGTCGCCGCAGCACGCGTCTACAGTTCCGGGTACCACGCCGTCGATTTGGACCGGATCGCCCGCGCCGTCGGGACTTTCGGGTCACGACGAGGAGTCGCCCGGTGCGCAGAGCCTGACCAGTACCCTGACGGCGCCCGACGGCACGAAGGTAGCGACCGCGAAGTTCGAGTTCGCCAACGGCTATGCCACCGTCACGATCGCGACGACCGGCGTCGGTAAGCTCACGCCCGGCTTCCACGGCCTACACATCCACCAGGTGGGTAAGTGTGAGCCCAACTCGGTTGCCCCCACCGGCGGTGCGCCCGGCAACTTTCTGTCCGCCGGCGGCCACTACCACGTGCCAGGGCATACCGGCACCCCCGCCAGCGGCGACCTGGCCTCGCTGCAGGTACGCGGTGACGGTTCGGCGATGCTGGTGACCACCACCGACGCCTTCACCATGGACGACCTGCTGAGCGGCGCGAAAACCGCGATCATCATTCACGCCGGCGCCGACAACTTTGCCAACATTCCGCCAGAACGCTACGTCCAGGTCAATGGGACTCCGGGTCCCGACGAGACGACGTTGACCACCGGCGACGCCGGCAAGCGGGTGGCGTGCGGTGTCATTGGTTCCGGC(SEQID NO1).
此开放读框结束于一个紧接于上述序列的天然TAG停止密码。此开放读框编码一段240个氨基酸的多肽，其序列如下MPKPADHRNHAAVSTSVLSALFLGAGAALLSACSSPQHASTVPGTTPSIWTGSPAPSGLSGHDEESPGAQSLTSTLTAPDGTKVATAKFEFANGYATVTIATTGVGKLTPGFHGLHIHQVGKCEPNSVAPTGGAPGNFLSAGGHYHAVPGHTGTPASGDLASLQVRGDGSAMLVTTTDAFTMDDLLSGAKTAIIIHAGADNFANIPPERYVQVNGTPGPDETTLTTGDAGKRVACGVIGS (SEQ IDNO2).
使用PSORT程序分析(http//psort.nibb.ac.jp/)，在这个多肽的氨基端发现一个推定的信号肽(下划线者)。
使用编码上述SOD版本的pET15B表达载体转化BL21(DE3)细胞。L-sodC质粒包括SEQ ID NO1。S-sodC质粒包括SEQ ID NO1的核苷酸118-720，也就是不包括编码信号肽的序列。M-sodC质粒包括核苷酸118-720，但在天然终止密码子由一T至A的突变，因此变成编码赖氨酸。接着在编码该新的赖氨酸之密码子的下游加入额外的序列(CCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGGCTGCTAA；SEQ ID NO7)，藉此编码额外的氨基酸序列PNNSSTLAAVTSGSGC(SEQ ID NO8)。藉由将此携带重组sodC质粒的BL21(DE3)细菌在包含0.5mM IPTG的LB培养液，以37℃培养100分钟而诱导此重组蛋白的表达。离心回收细菌，并经由在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)及10mM咪唑中超声处理而使细胞溶解。变性在包涵体(inclusionbodies)中的重组蛋白，并溶解于20mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、8M尿素及50mM咪唑中。接着根据制造商操作说明，将蛋白质在组氨酸捕获螯合柱上(Pharmacia)纯化。藉由在4℃对50mM Tris-HCl，pH7.8，1mM CuSO4以及1mMZnSO4的透析，而将纯化的重组蛋白复性，其中透析液更换数次。将纯化的蛋白质储存于添加20％甘油的透析液中。溶解于不含细胞之提取液中的重组蛋白，则是使用相同的柱在天然条件下而纯化(也就是，以不含CuSO4的透析液)。
在IPTG诱导时，大部分过度表达的蛋白质存在于不可溶的包涵体内。将这些在包涵体之中的蛋白质变性，以尿素溶解，并纯化以接近均质，如同以考马斯(Coomassie)亮蓝R-250染色之SDS-PAGE所显示的。小部份的这些蛋白质也以溶解的形式而从细胞溶胞物纯化。此SDS-PAGE还显示L-sodC表现大约28-32kDa的分子量，M-sodC表现大约26kDa的分子量，而S-sodC表现大约24-25kDa的分子量。
藉由把在考马斯亮蓝R-250染色之SDS-PAGE上的亲和性纯化的M-sodC分级分离，而制备用于抗体制备的M-sodC。将含有此M-sodC的凝胶切片与完全弗氏(Freund’s)佐剂混合，并用此混合物免疫三月龄新西兰白兔。在起初的免疫之后，接着以混合于不完全Freund’s佐剂的蛋白质加强免疫三次。在最后一次加强后以十天之间隔，收集抗血清。
将欲分析的蛋白质样品在SDS-PAGE中分级分离，电转移至Immobilon TM-P膜上(Millipore)，以兔抗血清，接着以辣根过氧化物酶缀合的驴抗兔IgG抗体(Amersion)检测。以增强的化学发光试剂盒(ECL，Amersion)检测目标条带，并以Hyperfilm-MP底片记录。
抗此纯化之重组M-sodC蛋白质的兔多克隆抗血清识别所有三种形式的SOD蛋白质，并且不与大肠杆菌之sodC基因产物交叉反应。更重要的是，此抗血清在结核分枝杆菌溶胞物中识别一个大小约26kDa的单一多肽，证明此sodC序列表达蛋白质。这个发现亦暗示结核分枝杆菌SOD是加工变为成熟的形式并分泌，如同以上所预测。
为了评估此重组白质之SOD酶活性，将此细菌表达的蛋白质重新悬浮于50mM磷酸盐缓冲液(pH7.8)及0.1mM EDTA之中，经由超声处理并且离心以得到细菌提取物。藉由非变性聚丙烯酰胺凝胶分离此提取物，以NBT染色，并如Beauchamp所述(文献同上)曝露于光线下，从而评估SOD的活性。已知1mM KCN会选择性地抑制Cu，ZnSOD活性，因此将之加入对照组样品中以确认SOD活性是来自于Cu，ZnSOD酶。
大部分在大肠杆菌表达的结核分枝杆菌Cu，ZnSOD发现于不溶的包涵体之中，并且不具有任何酶活性。为了重建此酶活性，将来自包涵体所制备之纯化的重组蛋白质以尿素变性，并藉由在Cu2+及Zn2+之溶液中透析而复性。从包涵体纯化出来之还原的重组M-sodC蛋白质在蓝色NBT-染色的凝胶上形成多重白色条带。这些条带可能代表活性的重组蛋白质之多样构象。
从可溶的细胞质部份纯化出来的重组Cu，ZnSOD(S-sodC)，在蓝色NBT-染色的凝胶上表达出单一的白色条带。当凝胶在1mM KCN的存在下染色时，代表结核分枝杆菌Cu，ZnSOD(S-sodC)、酵母菌Cu，ZnSOD以及结核分枝杆菌Cu，ZnSOD(M-sodC)之还原形式的白色条带都消失。这个结果证明由结核分枝杆菌sodC基因所编码的蛋白质，是编码一种以Cu，Zn为辅因子的真实超氧化物歧化酶。
为了测定Cu，ZnSOD在细胞区室中的定位，将L-sodC酶在大肠杆菌中表达，然后依下面方法将此细菌进行免疫金标记电子显微镜分析。制备15nm的胶态金-IgG复合物并如同Lin等人，J.Ultrastruct.Res.8416-23，1983；以及Chang等人，J.Gen.Virol.781175-1179，1997所说明的方法执行免疫金标记。简言之，将一些结核分枝杆菌的菌落从琼脂斜面上刮下，并以4℃在1％的福尔马林及0.1M的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH7.2)中，固定过夜。将此固定的样品于0℃，在0.1M的氯化铵及0.1M的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH7.2)中，中和30分钟。中和之后，接着透过一系列的甲醇清洗而脱水，第一次是在0℃用50％甲醇清洗15分钟，接着以75％及90％的甲醇重复，接着以100％的甲醇在-20℃清洗两次，每次1小时。以等级系列包埋剂LR Gold渗透此脱水的样品。首先藉由浸在25％的LR Gold、10％PVP-6000中，-20℃，1小时而渗透此样品。接着将此样品浸在50％的LR Gold、10％PVP-6000中，-20℃，2小时，然后是75％LR Gold，-20℃，4小时。最后，以100％的LR Gold，-20℃，2小时，将此样品完全渗透。在-20℃，以长波紫外光辐射达24小时而激活包埋剂的聚合作用，并且此样品在室温中24小时而变硬。将LR Gold包埋的样品之超薄切片(100nm)固定在200目镍网(其以碳支撑的胶棉薄膜覆盖)。将网上的切片以3％正常山羊血清(溶于PBS)封阻10分钟，与抗Cu，ZnSOD的兔抗血清(参见上述)保温15分钟，以1％正常山羊血清(溶于PBS)清洗，并且与胶态金-IgG复合物保温10分钟。在以醋酸铀和柠檬酸铅对照之前，以三重玻璃蒸馏水广泛地清洗网。此切片以Zeiss EM109电子显微镜(Zeiss，德国)检验。
因为格兰氏阳性的结核分枝杆菌中不存在周质空间，因此可检验出Cu，ZnSOD分泌至细菌的周围。使用免疫金标记以及电子显微镜，显示Cu，ZnSOD主要位于结核分枝杆菌的周围。这个发现与上述的发现一致，即(1)Cu，ZnSOD具有一推定的信号肽序列，以及(2)成熟之天然发生的Cu，ZnSOD表现出类似于SDS-PAGE凝胶上之截短S-sodC蛋白质的大小。这些信息暗示结核分枝杆菌Cu，ZnSOD或者分泌或者附着在细菌的外表面上。
在另一实验中，在大肠杆菌表达结核分枝杆菌Cu，ZnSOD。接着使用上述之免疫金标记电子显微镜测定所表达之蛋白质的位置。染色的结果显示Cu，ZnSOD主要位于细菌的周质空间。因此，这个蛋白质可在适合大量产生此蛋白质的细胞中重组地产生并分泌。实施例2用于检测结核分枝杆菌的酶联免疫吸附分析(ELISA)因为结核分枝杆菌Cu，ZnSOD曝露于细胞的外面，所以藉由使用特异于Cu，ZnSOD的抗体而发展ELISA的检测分析。以1.22、4.88、19.5、78.1、312或1250ng/ml的S-sodC溶液，藉由在4℃保温过夜而包被孔。接着移除蛋白质，并以10％的胎牛血清(溶于PBST)在37℃封阻孔2小时。以PBST清洗孔三次，并加入稀释1∶4000的兔抗血清(在上述实施例1所得到的)。将兔抗血清在孔中于4℃过夜保温。之后，以PBST清洗孔三次，并加入稀释1∶1000的辣根过氧化物酶缀合的驴抗兔IgG抗体(Amersion，目录编号NA943)。将驴抗体在37℃下，于孔中保温6小时。再以PBST清洗孔三次，然后藉由加入TMB(KPL公司)并在室温下保温不超过30分钟而显色。加入1M H3PO4而终止反应。
450nm的吸收值读数表明在10ng及1000ng之间有一动态的或可计量的检测范围。含有超过1000ng的样品，读数不再是动力学的。这个结果显示藉由使用特异于Cu，ZnSOD的抗体可发展用于检测结核分枝杆菌之有用的ELISA方法。实施例3检测结核分枝杆菌的感染因为结核分枝杆菌Cu，ZnSOD曝露于细胞外的环境，所以可检验结核病人产生抗Cu，ZnSOD之抗体的能力。使用病人血清，以Western印迹法检测上述的结核分枝杆菌Cu，ZnSOD。结果显示110个病人有12个产生抗Cu，ZnSOD的抗体，证实在个体中抗这个蛋白质的抗体之存在可用作结核病替代标记。其它实施方案应了解的是，虽然本发明已连同其详述而说明，但前面的说明是用以举例而非限制本发明的范围，本发明的范围是藉由后附的权利要求书而定义。其它方面、优点、以及修饰是在本
权利要求
1.一种特异地结合由SEQ ID NO2之氨基酸序列所组成的多肽之抗体。
2.如权利要求1所述之抗体，其中该抗体是单克隆抗体。
3.一种在哺乳动物中检测结核分枝杆菌感染的方法，该方法包括提供一段包括SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽；在足以使抗体结合该多肽的条件下，将该多肽与收集自哺乳动物的生物学样品接触；以及测定结合至该多肽之抗体的存在，其中该抗体的存在表示该哺乳动物感染结核分枝杆菌。
4.如权利要求3所述之方法，进一步包括移除不与该多肽结合的抗体。
5.如权利要求3所述之方法，其中该多肽结合至一固体支持物。
6.如权利要求5所述之方法，其中该固体支持物是塑料。
7.如权利要求5所述之方法，其中该多肽共价结合至该固体支持物。
8.如权利要求3所述之方法，其中该哺乳动物是人类，并且该生物学样品是人类血清样品。
9.一种测试化合物是否抑制多肽之超氧化物歧化酶活性的方法，该方法包括将此化合物与一多肽接触，此多肽是铜/锌超氧化物歧化酶，并具有与SEQ ID NO2至少50％相同性的氨基酸序列；测量该多肽所表现之超氧化物歧化酶活性水平；以及比较该化合物存在时与不存在时之超氧化物歧化酶活性水平；其中，当该化合物存在时的超氧化物歧化酶活性水平比该化合物不存在时的超氧化物歧化酶活性水平低的时候，该化合物抑制该多肽的超氧化物歧化酶活性。
10.如权利要求9所述之方法，其中该多肽结合至固体支持物。
11.如权利要求10所述之方法，其中该固体支持物是塑料。
12.如权利要求10所述之方法，其中该固体支持物是一阵列，而且该多肽结合至该阵列的每个组件上。
13.如权利要求9所述之方法，其中该多肽是在细胞内。
14.如权利要求13所述之方法，其中该细胞是细菌细胞。
15.如权利要求9所述之方法，其中该氨基酸序列与SEQID NO2至少有70％的相同性。
16.如权利要求15所述之方法，其中该氨基酸序列与SEQID NO2至少有90％的相同性。
17.如权利要求16所述之方法，其中该氨基酸序列是SEQID NO2。
全文摘要
本发明涉及结核分枝杆菌超氧化物歧化酶的抗体,使用它们以用于检测结核分枝杆菌的方法,测试结核分枝杆菌超氧化物歧化酶之抑制剂的方法,以及检测结核感染的方法。
文档编号G01N33/566GK1333692SQ99815528
公开日2002年1月30日 申请日期1999年11月9日 优先权日1998年11月13日
发明者李芳仁, 吴忠勳 申请人:永信药品工业股份有限公司