专利名称：草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及酶联免疫检测(ELISA)生物技术领域。
背景技术：
肿瘤坏死因子alpha (tumor necrosis factor-alpha, TNF-a )是一种重要的细胞因子。早在30多年前，Carswell等人发现了一种存在于血清中，能抑制和杀伤某些肿瘤细胞，并使体内肿瘤发生出血坏死的蛋白物质，被命名为肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor, TNF)。研究发现,肿瘤坏死因子alpha参与和调控机体的免疫功能和炎症反应,发挥促进细胞生长、分化、凋亡等重要作用。自从牙鲆中克隆出第一个肿瘤坏死因子alpha基因的全长cDNA序列开始，肿瘤坏死因子alpha在鱼类中的研究开始受到重视，研究表明鱼类肿瘤坏死因子alpha表现出极大的功能差异说明其功能具有种属特异性，因此有必要对草鱼肿瘤坏死因子alpha在草鱼中的功能检测和应用进行研究。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，英文名Grass carp，是中国淡水养殖的四大家鱼之一，具有重要的经济价值。但草鱼抗病力和成活率较低，易患出血病、烂鳃病、赤皮病和肠炎病等。加之高密度养殖增加了水产动物之间病原体交叉感染的机会，使病害日益加剧，因此研究草鱼免疫系统的各类免疫反应及其调节机制十分重要。由于肿瘤坏死因子alpha在鱼类炎症反应中具有广泛生物学活性及其在免疫调控中的重要性，因此检测肿瘤坏死因子a在草鱼中的功能对草鱼免疫系统的研究以及鱼类疾病的治疗密切相关。同时，由于鱼类肿瘤坏死因子alpha与哺乳动物和两栖动物的肿瘤坏死因子a分子在结构和功能方面存在较大差距，不能用其他种族的肿瘤坏死因子alpha蛋白和抗体代替鱼类肿瘤坏死因子alpha进行研究，加之鱼类肿瘤坏死因子alpha抗体的缺乏使对肿瘤坏死因子alpha功能地位的研究陷入瓶颈。目前尚没有专门检测草鱼肿瘤坏死因子alpha浓度的酶联免疫反应方法。

发明内容
本发明的目的针对现有检测草鱼肿瘤坏死因子alpha浓度方法的不足，通过重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白制备多克隆抗体，并成功建立草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，为研究肿瘤坏死因子alpha的功能提供了基础方法。本发明的技术方案是草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤步骤1:确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；步骤2 :建立竞争抑制酶联免疫检测方法，具体过程包括如下步骤步骤21 :包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原；步骤22 :封闭去除酶标板上没有包被上草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的部位；步骤23 :制备酶标抗体与抗原混合液；步骤24 :将酶标抗体与抗原混合液混合后与固定于酶标板上的抗原竞争结合；
步骤25 :洗涤酶标板以及对底物显色；步骤26 :对酶标板的孔进行读数得到每个孔的吸光值(0D)，根据读取的吸光值分别计算标准品抗原和待测样品的抑制率从而根据该抑制率计算待测样品的浓度。本发明的有益效果是以重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白作为包被抗原，采用多克隆抗体，建立了草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白检测竞争抑制酶联免疫检测方法，为检测草鱼中肿瘤坏死因子alpha的蛋白表达水平提供了快速高效的检测手段，该法稳定可靠，且成本较低。


图1是草鱼肿瘤坏死因子alpha ELISA检测的标准曲线。图2是采用本发明的方法检测草鱼头肾白细胞中肿瘤坏死因子alpha蛋白的分泌结果。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。一种草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，利用重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白作为免疫原免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体(草鱼肿瘤坏死因子alpha多克隆抗体)，再用辣根过氧化物酶(HRP)标记该多克隆抗体得到HRP标记草鱼肿瘤坏死因子alpha多克隆抗体(以下简称酶标抗体)。最后再次采用重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白作为包被抗原和酶标抗体从而建立草鱼肿瘤坏死因子alpha (TNFa )的竞争抑制酶联免疫(ELISA)检测方法。上述重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的获取过程可以利用本申请人之前递交的中国发明专利申请(申请号=201210240601.0，名称一种草鱼肿瘤坏死因子a基因的重组表达方法)合成，将草鱼肿瘤坏死因子alpha的基因序列克隆到原核表达载体pET30a(+)(一种商业化的克隆载体)上，构建重组表达质粒pET30a (+) -gcTNF a载体，再将构建得到的重组表达质粒pET30a(+)-gcTNF-a载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3)(—种商业化的实验用菌种)中，进行筛选鉴定和测序验证后，将获得的阳性克隆作为工程菌株；将筛选所得的含有工程菌株的菌液，以异丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂进行诱导表达；诱导表达完成后，将菌液经超声裂解并离心得到融合表达的裂解液，用含6XHis单克隆抗体或镍离子的亲和柱进行亲和层析，再以凝胶层析纯化，获得高纯度的重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白。由于本步骤的具体过程已经在专利申请201210240601. 0中陈述，因此该步骤不再详细介绍，并且本步骤的目的是获取重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白，本领域的普通技术人员应该意识到，采用其他的能够获取重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的现有方法也是可行的。上述利用重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白作为免疫原免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体的过程是一个公知的现有过程，因此不再详细介绍；本领域的普通技术人员应该意识到，采用其他种类的兔子也是可行的。上述利用辣根过氧化物酶(HRP)标记草鱼肿瘤坏死因子alpha抗体得到HRP标记多克隆抗体的方法具体采用马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶试剂盒标记草鱼肿瘤坏死因子alpha多克隆抗体(马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶试剂盒购自ThermoScientific公司)。该方法是一个公知的现有技术，因此不再详细介绍。在具备上述前提材料后，本发明的具体步骤如下步骤1:确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；本实施例中，该步骤经过棋盘滴定法确定竞争抑制酶联免疫检测时酶标抗体的最适稀释倍数为1:2000，包被抗原浓度为g/ml，每孔滴加IOOii L。步骤2 :建立竞争抑制酶联免疫检测方法，具体过程又包括如下步骤步骤21 :包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原(即肿瘤坏死因子alpha蛋白)。本实施例中，该步骤的具体操作过程为用抗原稀释液(pH为9. 6的0. 05M(mol/L)碳酸盐缓冲液)稀释草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白(2 ii g/ml/孔)成为包被液,用包被液包被96孔酶标板，每孔加入包被液体积为100 yl。4°C条件下包被过夜后甩干，用洗涤液(pH为7. 4的0.1M磷酸盐缓冲液中含0. 05%Tween-20，PBST)洗涤三次(每次300 U I/孔)，每次3分钟。步骤22 :封闭去除酶标板上没有包被上草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的部位。本实施例中，用封闭液(pH为7. 4的0.1M PBS稀释5%脱脂奶粉、0. 3%牛血清白蛋白溶液)室温封闭2小时,每孔加封闭液300 ii I。步骤23 :制备酶标抗体与抗原混合液。本实施例中，用抗原/抗体稀释液(PBST)将重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白稀释到如下浓度0ng/ml、0. 5ng/ml、lng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml 以及 20ng/ml作为不同浓度标准品，取不同浓度标准品50iU与50iU酶标抗体(PBST溶液中按1:2000比例稀释)混匀后室温孵育2小时。对待测样品的检测取待测样品50 Ul与50 Ul 1:2000稀释的酶标抗体混合，同样室温孵育2小时。步骤24 :将酶标抗体与抗原混合液混合后与固定于酶标板上的抗原竞争结合。本实施例中，酶标板中抗原完成封闭后，甩干封闭液，并用300iil PBST洗涤三次，每次至少3分钟，然后加入步骤23中制备完成的酶标抗体与抗原混合液，每孔中加入酶标抗体与抗原混合液100 V-1,室温孵育至少2小时。步骤25 :洗涤酶标板以及对底物显色。本实施例中，步骤24结束后，甩干孔内液体，用300 ill PBST洗涤五次，每次3分钟，然后每孔加入IOOy I TMB底物(酶联反应底物，一种商业化试剂)，37°C反应20分钟后加入50 u I 2M硫酸(H2SO4)终止反应。步骤26 :对酶标板的孔进行读数得到每个孔的吸光值(0D)，根据读取的吸光值分别计算标准品抗原和待测样品的抑制率从而根据该抑制率计算待测样品的浓度。本实施例中，采用酶标仪在吸光度450nm下读取每孔的吸光值(OD)值，根据所得OD值计算标准品抑制率％ =(阴性样品吸光值-标准品吸光值)/阴性样品吸光值X 100% ；同时计算待测样品抑制率％ =(阴性样品吸光值-待测样品吸光值)/阴性样品吸光值X 100%，其中，阴性样品是指不加标准品时的吸光值，标准品吸光值为不同浓度标准品对应的吸光值以及待测样品吸光值为待测样品的吸光值。如图1所示，以标准品抑制率为纵坐标，其对应标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，通过曲线拟合计算可以获得标准曲线对应的趋势线函数，从图中可以看出，本方法能准确检测浓度为0-20ng/ml的草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白。根据待测样品抑制率带入该标准曲线趋势线函数中，可以推导出待测样品中草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白浓度。为了证明本检测方法的可应用性，我们用该竞争抑制酶联免疫检测方法成功检测了草鱼头肾白细胞中，脂多糖(LPS)对草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白分泌的调控。分离得到草鱼头肾淋巴细胞(HKL)，按6X IO5/孔接种到24孔板中，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液于27°C，5%C02浓度下培养过夜。草鱼HKL过夜培养后，每孔中加LPS，其终浓度为30 u g/ml，同时不加药组为对照组。药物刺激0、3、6、12小时后，收培养液，离心，取上清，用竞争抑制酶联免疫检测方法检测上清中草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白含量。经过步骤2所有步骤，采用酶标仪在吸光度450nm下读取标准品和待测物品的吸光值。按步骤26获得标准样品标准曲线及其对应的趋势线函数。由待测样品的吸光值，计算待测样品抑制率，然后以标准曲线所对应的趋势线函数，可获得测样品中草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的浓度，如图2所示。图2中表示横坐标表示不同时间点LPS处理组和对照组(Ctrl)，纵坐标草鱼肿瘤坏死因子浓度。空白方框和黑框分别表示对照组和LPS处理组对应的草鱼肿瘤坏死因子alpha浓度。利用本发明我们不仅证明了在草鱼头肾白细胞中LPS能够上调草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的分泌水平，而且精确地检测出草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的含量(见附图2)。本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。
权利要求
1.草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤步骤1:确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；步骤2 :建立竞争抑制酶联免疫检测方法，具体过程包括如下步骤步骤21 :包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原；步骤22 :封闭去除酶标板上没有包被上草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的部位；步骤23 :制备酶标抗体与抗原混合液；步骤24 :将酶标抗体与抗原混合液混合后与固定于酶标板上的抗原竞争结合；步骤25 :洗涤酶标板以及对底物显色；步骤26 :对酶标板的孔进行读数得到每个孔的吸光值(0D)，根据读取的吸光值分别计算标准品抗原和待测样品的抑制率从而根据该抑制率计算待测样品的浓度。
2.根据权利要求1所述的草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤I中经过棋盘滴定法确定竞争抑制酶联免疫检测时酶标抗体的最适稀释倍数为1:2000,包被抗原浓度为2 μ g/ml,每孔滴加100 μ L。
3.根据权利要求1所述的草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤21中，具体操作过程为用抗原稀释液(pH为9. 6的O. 05M(mol/L)碳酸盐缓冲液)稀释草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白(2 μ g/ml/孔)成为包被液,用包被液包被96孔酶标板，每孔加入包被液体积为100 μ I ;4°C条件下包被过夜后甩干，用洗涤液(pH为7.4的O.1M磷酸盐缓冲液中含O. 05%Tween-20, PBST)洗涤三次(每次300 μ I/孔)，每次3分钟。
4.根据权利要求1所述的草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤22中，用封闭液(pH为7. 4的O.1M PBS稀释5%脱脂奶粉、O. 3%牛血清白蛋白溶液)室温封闭2小时,每孔加封闭液300 μ I。
5.根据权利要求1所述的草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤23中，用抗原/抗体稀释液(PBST)将重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白稀释到如下浓度:0ng/ml、0. 5ng/ml、lng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml 以及 20ng/ml 作为不同浓度标准品，取不同浓度标准品50μ I与50μ I酶标抗体(PBST溶液中按1:2000 比例稀释)混匀后室温孵育2小时。对待测样品的检测取待测样品50 μ I与50 μ I 1:2000 稀释的酶标抗体混合，同样室温孵育2小时。
6.根据权利要求1所述的草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤24中，酶标板中抗原完成封闭后，甩干封闭液，并用300 μ I PBST洗涤三次， 每次至少3分钟，然后加入步骤23中制备完成的酶标抗体与抗原混合液，每孔中加入酶标抗体与抗原混合液100 μ I,室温孵育至少2小时。
7.根据权利要求1所述的草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤25中，待步骤24结束后，甩干孔内液体，用300 μ IPBST洗涤五次，每次3分钟，然后每孔加入1001 TMB底物，37°C反应20分钟后加入50 μ 12M硫酸(H2SO4)终止反应。
全文摘要
本发明涉及草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，包括如下步骤步骤1确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；步骤2建立竞争抑制酶联免疫检测方法，包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原；将酶标抗体与抗原混合液混合后与固定于酶标板上的抗原竞争结合；洗涤酶标板以及对底物显色；对酶标板的孔进行读数得到每个孔的吸光值，根据读取的吸光值分别计算标准品抗原和待测样品的抑制率从而根据该抑制率计算待测样品的浓度。本发明的有益效果是为检测草鱼中肿瘤坏死因子alpha的蛋白表达水平提供了快速高效的检测手段，该法稳定可靠，且成本较低。
文档编号G01N33/68GK102998457SQ20121031275
公开日2013年3月27日 申请日期2012年8月29日 优先权日2012年7月12日
发明者周红, 陈丹燕, 张安英 申请人:电子科技大学