专利名称：同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，涉及定量测定制剂中L 一谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B2含量的方法，具体地说是一种同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法。
背景技术：
国内研究用HPLC法测定药品、保健品、食品等中维生素的含量的较多，但对多维氨基酸咀嚼片中氨基酸(L 一谷氨酰胺，盐酸半胱氨酸)和维生素(VB2)在同一个体系中，一起测定含量的液相方法研究较少。目前，国内文献没有这方面的报道。传统检测制剂中氨基酸的含量用专门的氨基酸柱和特制的试剂配制流动相，比较复杂，成本可观。

发明内容
本发明要解决的技术问题，针对多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B2的含量测定，由于现在文献没有这方面的记载，国家也没有现成的标准可参考， 因此制定并验证了此方法，该方法属于HPLC法，本方法具有简便、准确、重复性好、专属性强等特点。本发明以常用的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子，用离子对试剂做为流动相的一部分，就能在同一个系统中把氨基酸和维生素B2同时检测出，方法简单，专属性强， 精密度和重复性良好。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是
一种同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，它是利用HPLC法同时测定多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB2含量，该方法的色谱条件为
(1)色谱柱岛津VP-ODS (250mm X 4. 6mm，5 μ m);
(2)流动相为混合比例为1090的乙腈和离子对试剂的水溶液；
(3)紫外检测器的检测波长为215nm。作为本发明的一种限定，所述的离子对试剂的水溶液为庚烷磺酸钠的的水溶液或辛烷磺酸钠的水溶液。作为上述限定的进一步限定，所述的离子对试剂的水溶液为辛烷磺酸钠的水溶液。作为上述限定的再次限定，所述的辛烷磺酸钠的水溶液浓度为O. 0865%。作为上述限定的最后限定，所述的辛烷磺酸钠的水溶液用85%的磷酸调节pH值至 2. 5。作为本发明的另一种限定，该方法的色谱条件为所用流动相的流速为1.2mL/ min，进样体积为20 μ L，柱温为35°C。通过本方法测定多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B2的含量，分析结果真实、准确。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于采用HPLC法检测多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B2的含量，操作简单，提高了检测的灵敏度和准确度，并可以适用于有颜色干扰的样品。本发明适于多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B2的含量测定。


图I为本发明实施例溶剂干扰性试验的HPLC图2为本发明实施例空白辅料干扰性试验的HPLC图3为本发明实施例对照品L-谷氨酰胺的HPLC图4为本发明实施例对照品盐酸半胱氨酸的HPLC图5为本发明实施例对照品维生素B2的HPLC图6为本发明实施例L-谷氨酰胺，盐酸半胱氨酸和维生素B2对照品混合物的HPLC图； 图7为本发明实施例样品的HPLC图8为本发明实施例对照品进样量为5 μ L线性测定的HPLC图9为本发明实施例对照品进样量为10 μ L线性测定的HPLC图10为本发明实施例对照品进样量为20 μ L线性测定的HPLC11为本发明实施例对照品进样量为30 μ L线性测定的HPLC12为本发明实施例对照品进样量为40 μ L线性测定的HPLC13为本发明实施例对照品进样量为50 μ L线性测定的HPLC14为本发明实施例耐用性考察所使用的型号为Agilent (250*4. 6mm，5 μ m)色谱柱的HPLC图15为本发明实施例耐用性考察所使用的型号为Diamonsil C18(2) (150*4. 6mm, 5 μ m)色谱柱的HPLC图16为本发明实施例耐用性考察所使用的型号为月旭W elchorm C18 (250*4. 6mm,
5μ m)色谱柱的HPLC图17-图22分别为本发明实施例对照品精密度试验测定的HPLC图23为本发明实施例样品稳定性试验标准品Oh测定的HPLC图24为本发明实施例样品稳定性试验标准品4. 5h测定的HPLC图25为本发明实施例样品稳定性试验标准品6h测定的HPLC图26为本发明实施例样品稳定性试验标准品7h测定的HPLC图27为本发明实施例样品稳定性试验标准品8. 5h测定的HPLC图28为本发明实施例对照品稳定性试验标准品Oh测定的HPLC图29为本发明实施例对照品稳定性试验标准品4. 5h测定的HPLC图30为本发明实施例对照品稳定性试验标准品6h测定的HPLC图31为本发明实施例对照品稳定性试验标准品7h测定的HPLC图32为本发明实施例对照品稳定性试验标准品8. 5h测定的HPLC图。本发明下面将结合说明书附图和具体实施例作进一步详细说明。
具体实施例方式以下实施例只用于说明本发明，并不限定本发明。实施例一种同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法
本测量方法是利用HPLC法同时测定多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB2含量。该方法的色谱条件为
(1)色谱柱岛津VP-ODS (250mm X 4. 6mm，5 μ m);
(2)流动相是混合比例(体积比)为1090的乙腈和离子对试剂的水溶液；流动相的流速为I. 2mL/min,进样体积为20 μ L，柱温为35°C。其中
离子对试剂的水溶液为按照O. 865g辛烷磺酸钠加IOOOmL 二次去离子水的比例溶解制得的O. 0865%的辛烷磺酸钠的水溶液(也可以用庚烷磺酸钠的水溶液替代)，用85%的磷酸调节pH值至2.5。(3)紫外检测器的检测波长为215nm。一、本发明方法的建立过程
1、仪器与试剂
仪器岛津LC-2010A高效液相色谱仪(LC-2010型号检测器，LC-2010型号泵，LC-2010 柱温箱，LC-2010自动进样器)，LCsolution色谱工作站。试剂乙腈(色谱级)、水(二次去离子水)、辛烷磺酸钠(优级纯，离子对试剂)、 本申请人生产提供的多维氨基酸咀嚼片(样品)、L-谷氨酰胺对照品(SIGMA公司，批号 0001410840含量99. 5%)、盐酸半胱氨酸一水物对照品(日本东京任成工业株式会社，批号V4XRL，含量以盐酸半胱氨酸计为91. 0%)、VB2对照品(中国药品生物制品检定所，批号 100369-200502，含量 98. 7%)。2、含量测定方法的建立
2.I、波长的选择
根据L 一谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB2紫外光吸收具有的特性，测定了它的水溶液在紫外光下的吸收图谱，在波长为215nm处三种物质均有良好的吸收，因此确定检测波长为 215nm。2. 2、溶液的配制
维生素B2对照品贮备溶液的配制精密称取VB2对照品15mg，置于IOOmL棕色容量瓶中，加入大约20mL的二次去离子水和O. 5mL冰乙酸，100°C水浴溶解，放冷后用二次去离子水定容，摇匀，即得。对照品溶液的配制精密称取L-谷氨酰胺对照品50mg和盐酸半胱氨酸一水物对照品16. 25mg，置于同一 IOOmL的棕色容量瓶中，精密量取VB2对照品贮备液20mL，置于上述棕色容量瓶中，用二次去离子水溶解并稀释置刻度，摇匀，即得对照品溶液M。样品溶液的配制取样品10片精密称定，研细，精密称取细粉I. 25g (大约相当于 50mgL-谷氨酰胺、15mg盐酸半胱氨酸和30mg的维生素B2),置于IOOml的棕色容量瓶中，加入二次去离子水60mL，100°C水浴溶解后，冷却至室温，用二次去离子水稀释至刻度，摇匀， 即得样品溶液N。2. 3、溶剂、空白辅料的干扰性试验和L 一谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB2定性为排除色谱图中有溶剂和空白辅料干扰L 一谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB2峰的出现，
5对单独的溶剂和空白辅料进行专属性试验和三种物质的定性以增加检测的准确性。溶剂的影响将二次去离子水滤过，取20 μ L照上述色谱条件进样，记录色谱图， 如图I所示，溶剂色谱图中没有干扰峰出现，表明溶剂对测定没有影响。空白样品影响按照制剂配方规定的比例，除L 一谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸、维生素民外，其他组分和辅料称取一定量，混匀，研细，精密称取细粉I. 25g，置于IOOmL的棕色容量瓶中，用二次去离子水溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤；取续滤液20 μ L照上述色谱条件进样，记录色谱图，如图2所示，空白样品色谱图中没有干扰峰出现，表明空白样品对测定没有影响。谷氨酰胺的定性精密称取L-谷氨酰胺对照品25mg，置于50mL棕色容量瓶中，用二次去离子水溶解并稀释至刻度，摇匀。取20 μ L照上述色谱条件进样，记录色谱图，如图 3所示。盐酸半胱氨酸的定性精密称取盐酸半胱氨酸一水物对照品16mg，置于IOOmL棕色容量瓶中，用二次去离子水溶解并稀释至刻度，摇匀。取20 μ L照上述色谱条件进样，记录色谱图，如图4所示。维生素B2的定性精密量取2. 2项下的维生素B2对照品贮备液20mL，置于IOOmL 棕色容量瓶中，用二次去离子水稀释至刻度，摇匀。取20 μ L照上述色谱条件进样，记录色谱图，如图5所示。取2. 2项下的对照品溶液M 20 μ L，按照上述色谱条件进样，记录色谱图，如图6所
/Jn ο取2. 2项下的样品溶液N 20 μ L，按照上述色谱条件进样，记录色谱图，如图7所
/Jn ο说明对照品溶液的色谱图中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B2与样品溶液的色谱图中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B2保留时间一致。2. 4、样品的测定
取三批批号为10072801、10080501、10072601的样品，依照方法2. 2制备样品溶液，每批样品做两个平行样，按上述色谱条件精密量取20 μ L进样，按面积外标法计算L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和维生素B2的含量，样品测定结果见表I。试验测定结果显示L 一谷氨酰胺，盐酸半胱氨酸和VB2含量均在标示量的90. 0%-110. 0%范围内，说明此检测方法可行。
权利要求
1.一种同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，其特征在于它是利用 HPLC法同时测定多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB2含量，该方法的色谱条件为(1)色谱柱岛津VP-ODS (250mm X 4. 6mm，5 μ m);(2)流动相是混合比例为1090的乙腈和离子对试剂的水溶液；(3)紫外检测器的检测波长为215nm。
2.根据权利要求I所述的同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，其特征在于所述的离子对试剂的水溶液为庚烷磺酸钠的水溶液或辛烷磺酸钠的水溶液。
3.根据权利要求2所述的同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，其特征在于所述的离子对试剂的水溶液为辛烷磺酸钠的水溶液。
4.根据权利要求3所述的同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，其特征在于所述的辛烷磺酸钠的水溶液浓度为O. 0865%。
5.根据权利要求4所述的同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，其特征在于所述的辛烷磺酸钠的水溶液用85%的磷酸调节pH值至2. 5。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，其特征在于该方法的色谱条件为所用流动相的流速为1.2mL/min，进样体积为 20 μ L，柱温为 350C ο
全文摘要
本发明公开了一种同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法，即利用HPLC法同时测定多维氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB2含量，该方法的色谱条件为(1)色谱柱岛津VP-ODS(250mm×4.6mm，5μm)；(2)流动相为混合比例为1090的乙腈和离子对试剂的水溶液；(3)紫外检测器的检测波长为215nm；所用流动相的流速为1.2mL/min，进样体积为20μL，柱温为35℃。本发明的测定方法操作简单，提高了检测的灵敏度和准确度，并可以适用于有颜色干扰的样品。本发明适于多维氨基酸咀嚼片中L－谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸和VB2含量的测定。
文档编号G01N30/02GK102590393SQ20121007020
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月16日 优先权日2011年11月30日
发明者张江艳, 王付平, 田会彦, 魏桂香 申请人:河北科星药业有限公司