专利名称：一种对猪瘟病毒e2蛋白含量的定量检测方法
技术领域：
本发明利用凝胶回收-液相色谱联用方式，对猪瘟E2蛋白进行定量的方法，有效的避免了杂蛋白对定量分析结果的影响。
背景技术：
目前对猪瘟病毒的蛋白进行定量的检测方法，有以下几方面①对蛋白跑胶后的特定条带颜色比对法特定波长下的吸光值计算法；③铜离子还原的蛋白定量法；④染料结合的蛋白定量法；其①方法存在人为与试剂差异因素，判定结果最不准确；而后三种方法对样品中所有的蛋白同时进行定量，无法完成针对某一种特殊蛋白的准确定量，换言之，单一的液相色谱难以将这种同源性较接近的蛋白质进行完全分离。
本发明构思使用PAGE胶回收-液相色谱联用方式，对猪瘟E2蛋白进行定量分析，既解决了异种蛋白质分离难，造成结果假阳性的问题，又能很大程度的提高对猪瘟E2蛋白定量检测的准确度和精度。

发明内容
本发明的目的在于针对猪瘟E2蛋白定量分析，即PAGE胶回收-液相色谱联用方法，替代了传统的比色法，检验效果既准确，又易于操作，有重要的推广价值。本发明的目的是这样实现的一种对猪瘟病毒E2蛋白含量的定量检测方法，用PAGE胶进行猪瘟E2蛋白的纯化回收，经液相色谱仪分析，避免了杂蛋白对定量结果的影响，其步骤如下步骤I试剂配制1)0. IM 磷酸盐缓冲液称取 NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 12H203 63g, KH2PO4O. 24g，溶于900ml超纯水中，用盐酸调pH值至7. 2，加超纯水定容至1L，混匀；2) 0. OlM磷酸盐缓冲液取0. IM磷酸盐缓冲液100ml，加超纯水定容至1L，混匀；3)匀浆缓冲液:1. OM Tris-HCl I. Oml,即 pH 6. 8 ；10%SDS 6. 0ml, ^ -巯基乙醇0. 2ml，超纯水2. 8ml，混勻；4)转膜缓冲液:甘氨酸2. 9g，Tris 5. 8g，SDS 0. 37g，甲醇200ml，加超纯水定容至1000ml，混匀；5) 0. OlM 磷酸盐缓冲液，即 pH7. 4 NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g, Na2HPO4 I. 44g, KH2PO40. 24g，加超纯水至1000ml，混勻；6)膜染色液考马斯亮兰0. 2g,甲醇80ml,乙酸2ml,超纯水118ml,混匀；7)包被液5%脱脂奶粉I. 0g，溶于200ml的磷酸盐缓冲液中，混匀；8)显色液DAB 6. Omg ；0. OlM 磷酸盐缓冲液 10. Oml ；硫酸镍胺 0. Iml ；H202l.Oiil，混匀；9)辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG，即为二抗；10) 6mo 1/L盐酸溶液取0. 5L浓盐酸，加水稀释至1L，混匀；
ll)20mM盐酸溶液取出6. 68ml的浓盐酸，以超纯水稀释定容为1L，混匀；12) Norleucine 溶液取 Norleucine 粉末 6. 56mg,以 20mM 盐酸溶液稀释至 1L,混匀；13)氨基酸标准品配制取 4ml Amino Acid Standard H Stock 与13. 12mgNor leucine粉末,用超纯水定容至IOOml,混勻；14) HPLC流动相A IOOmL Eluent A浓缩液，加入IL的超纯水，混匀；15) HPLC 流动相 B :1L 的 100%Acetonitrile 溶液；16) HPLC流动相C : IL的0. IM磷酸氢二钠缓冲液；步骤2样品处理取high five细胞的猪瘟E2蛋白和健康细胞的上清各1-1. 5ml，同时置于微量离心管中，以3000rPm离心10分钟，吸取上清液进行蛋白质分析；由-20° C冰箱中取出5倍上样缓冲液，取80 ill离心的上清液与20 ill 5倍的蛋白上样缓冲液混合均匀后，于水浴中煮沸15分钟后，置于冰上备用配制12%SDS-PAGE，将蛋白质分子量标准样品依序上样至胶片中，以电压150V，电泳80分钟后，一片以考马斯亮蓝进行染色，时间30min后，以脱色液脱色，初步确定蛋白大小；另一片胶片进行蛋白质免疫印记杂交，条件40mA，时间2小时，使蛋白质转印到醋酸纤维膜上，完成后取出膜放置于塑料洗盒中，加入25ml 5%脱脂乳在室温下进行封闭，时间30min ;倒掉脱脂乳，以PBST洗三次后，在PBST中加入一抗WH303，即1:3000，置于4° C冰箱隔夜摇晃感作，倒掉一抗，以PBST洗三次后，再以PBST洗五次，每次25ml，每次时间IOmin加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗，即1:5000稀释，室温下摇晃感作，时间Ih，倒掉二抗，以PBST洗三次后，再以PBST洗五次，每次25ml，每次时间IOmin在暗室内，将膜放入平皿中，先加Iml去离子水，再加入DAB显色液，即A液和B液各I滴，用移液器反复冲洗膜表面I分钟，在约48KD附近见到的特异性条带则表示在High five细胞上表达的E2蛋白能被单抗WH303识别,根据Western_blot确定的条带大小确定E2蛋白的位置，将SDS-PAGE上的条带切下，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收目的蛋白，将回收的目的蛋白再次进行Western-blot分析，以确定回收的目的蛋白的正确性；其3检测步骤将回收的猪瘟E2蛋白经离心浓缩仪浓缩至80-110 iiL，并抽取IOii L浓缩样，加至水解小管中，加6mol/L的HCl 200ul,l-2mg的固体苯酚，抽真空脱气，采用N2气体密封保护，110°C下反应24小时；反应结束，用离心浓缩仪将水解液旋蒸至干燥状态，加入Norleucine 溶液 20 ii L，Borate buffer 60 y L，AQC衍生试剂 20 y L，最终体积 100 y L，震荡混匀，在55°C温箱中反应10分钟，冷却至室温，进行液相检测；使用Waters的AccQ -Tag ,即Size 3. 9xl50nm的水解衍生柱，柱温设定37°C，样品槽温度10°C，荧光激发波长设为295nm，输入波长设为395nm，进样量为5 y L ;其中离心浓缩仪的温度45 °C，真空度93. 3-98. 6KPa，转速 3500rPm。所述的方法获取的蛋白水解浓度相对标准偏差仅为I. 09%，具有很好的重复性和准确性。本发明的构思及作用机理根据已知的猪瘟E2蛋白上的比较稳定存在的5种氨基酸数目，通过计算得到该样品的含量，将已知浓度的猪瘟E2蛋白标准品，经过梯度稀释，进行 HPLC 检测，色谱柱Phenomenex 的 BioS印-SEC-S2000 色谱柱(Size 300x7. 80mm)，柱温65°C，样品槽温度8°C，使用流动相C，波长扫描时间20分钟，紫外检测器在226nm处有最大吸收峰，即得到一条标准曲线，依据此标准曲线，计算出未知样品的猪瘟E2蛋白的含量，相对于传统的比色法对蛋白定量的方式，采用的PAGE胶回收-液相色谱联用法对猪瘟E2蛋白定量分析方式，可以有效的避免杂蛋白对结果的干扰，判定结果更精确，结果可信度更高。机理通过SDS-PAGE胶回收目的蛋白片段，有效的避免了杂蛋白对浓度结果的影响，当标准品蛋白经过HCl水解法确定含量后，并使用液相色谱建立一条标准曲线，未知样品根据此标准曲线就可以得知其浓度，该结果的准确度可以精确到ng级别，使我们对于蛋白定量的精度有了大幅度的提高，为以后的研究、生产工作提供了更加可靠的数据。本发明使用PAGE胶回收-液相色谱联用方式对猪瘟E2蛋白定量分析方法，包括16种试剂配制；经样品处理经考马斯亮蓝进行染色，初步确定蛋白大小；根据蛋白质印迹法确定E2蛋白的位置，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收目的蛋白，并采用蛋白印迹法确定其正确性，方法精准可靠，彰显技术进步。


本发明结合附图作进一步阐明。附图I为蛋白电泳图；如图所示蛋白经蛋白印迹法分析，可以确定E2蛋白的大小。附图2为蛋白电泳图；如图所示显示了我们准备回收的E2蛋白。附图3为蛋白电泳图；如图所示E2蛋白经蛋白印迹法分析，确定回收的目的蛋白的正确性。附图4采用上海生物工程的PAGE胶蛋白微量回收试剂盒(产品编号BSP062)进行回收；使用了 6种E2上稳定存在的氨基酸(Asn, Asp, Leu, Lys, Thr, Val)对未知样品的蛋白水解产物进行浓度分析，使用waters的蛋白水解衍生试剂，通过计算可以得到该样品的含量。如图所不使用Phenomenex 的 BioSep-SEC_S2000 的色谱柱(Size 300x7. 80mm),柱温设为65°C，样品槽温度为8°C，流动相为0. IM磷酸氢二钠缓冲液，波长扫描时间20分钟，紫外检测器吸收光波值为226nm，得到一条标准曲线，依据此标准曲线，计算出未知样品中的猪瘟E2蛋白含量。附图5、图5-1为第一天的校准曲线数据图与E2样品的HPLC分析图；如图所不Name:E2;ProcessingMethod:Std;Fit Type:线性(一阶);CalCurve Id:2954;A:2. 288351e+005;B:4. 986142e+003;C:0. 000000e+000;D:0. 000000e+000;R~2:0. 995065 ;X轴显示时间；Y轴显示的峰面积。附图6、图6-1为第二天的校准曲线数据图与E2样品的HPLC分析图；如图所不Name:E2;ProcessingMethod:Std;Fit Type:线性(一阶);CalCurve Id:2941;A:2. 199966e+005;B:5. 014100e+003;C:0. 000000e+000;D:0. 000000e+000;R~2:0. 994154 ;X轴显示时间；Y轴显示的峰面积。附图7、图7-1为第三天的校准曲线数据图与E2样品的HPLC分析图；如图所不Name:E2;ProcessingMethod:Std;Fit Type:线性(一阶);CalCurve Id:2932;A:2. 199785e+005;B:5. 019950e+003;C:0. 000000e+000;D:0. 000000e+000;R~2:0. 994323 ;X轴显示时间；Y轴显示的峰面积。
具体实施例方式本发明结合实施例作进一步阐明。实施例使用PAGE胶回收-液相色谱联用方式对猪瘟E2蛋白定量分析方法的具体实施步骤(一)反应试剂的制备0. IM 酸盐缓冲液称取 NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 12H20 3. 63g，KH2PO4 0. 24g，溶于900ml超纯水中，用盐酸调pH值至7. 2，加超纯水定容至1L，混匀；0. OlM酸盐缓冲液取0. IM酸盐缓冲液100ml，加超纯水定容至1L，混匀；SDS-PAGE 试剂水 8. 2ml, 30% 丙烯酰胺溶液 10ml, I. 5mol/L Tris 6. 3ml, 10%SDS
0.25ml, 10% 过硫酸铵 0. 25ml, TEMED 0. Olml ；匀浆缓冲液1.OM Tris-HCl (pH 6. 8) I. 0ml, 10%SDS 6. 0ml, ^ -巯基乙醇 0. 2ml,超纯水2. 8ml，混匀； 转膜缓冲液甘氨酸2. 9g，Tris 5. 8g，SDS 0. 37g，甲醇200ml，加超纯水定容至1000ml，混勻；0. OlM 磷酸盐缓冲液(pH7. 4) NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g, Na2HP04 I. 44g,KH2P040. 24g，加超纯水至1000ml，混匀；膜染色液考马斯亮兰0. 2g,甲醇80ml,乙酸2ml,超纯水118ml,混匀；包被液(5%脱脂奶粉，现配):脱脂奶粉I. Og溶于200ml的磷酸盐缓冲液中，混匀；显色液二氨基联苯胺6. Omg ；0. OlM磷酸盐缓冲液10. Oml ;硫酸镍胺0. Iml ；H202l.Oiil，混匀；辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG (二抗)；WH303 :由英国皇家兽医学院惠赠；6mol/L盐酸溶液取0. 5L浓盐酸，加水稀释至1L，混匀；20mM盐酸溶液取出6. 68ml的浓盐酸，以超纯水稀释定容为1L，混匀；Norleucine溶液精确称取Norleucine粉末6. 56mg,以20mM盐酸溶液稀释至1L，混匀；氨基酸标准品配制取4mlAmino Acid Standard H Stock及 13. 12mgNorleucine粉末用超纯水定容至100ml，混匀；HPLC流动相A IOOmL Eluent A浓缩液，加入IL的超纯水，混匀；HPLC 流动相 B :1L 的 100%Acetonitrile 溶液；HPLC流动相C : IL的0. IM磷酸氢二钠缓冲液；(二)样品处理取High five细胞上表达的E2蛋白和健康细胞上清各Iml至I. 5ml微量离心管中，以3000rpm离心10分钟，吸取上清液进行蛋白质分析。由-20° C冰箱中取出5倍上样缓冲液，取80 ill离心的上清液与20 ill 5 X上样缓冲液混合均匀后，于水浴中煮沸15分钟后，置于冰上备用配制12%SDS-PAGEX2片，将protein marker、样品蛋依序上样至胶片中，以电压150V，电泳80分钟后，第一块SDS-PAGE胶以考马斯亮蓝进行染色，时间30min，以液脱色，初步确定蛋白大小(见图I)。第二块SDS-PAGE胶进行Western-blot分析，条件40mA,时间2hr,使蛋白质转溃到PVDF膜上，完成后取出膜放置于塑料洗盒中，加入25ml 5%脱脂乳在室温下进行封闭时间30min。倒掉脱脂乳，以0. 1%的吐温20洗三次后，在0. 1%的吐温20中加入一抗WH303 (1:3000)，置于4° C冰箱隔夜摇晃感作，倒掉一抗，以0. 1%的吐温20洗三次后，再以0. 1%的吐温20洗五次每次25ml，每次时间IOmin加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗(1:5000稀释)，室温下摇晃感作，时间lh，倒掉二抗，以0. 1%的吐温20洗三次后，再以
0.1%的吐温20洗五次每次25ml，每次时间IOmin在暗室内，将膜放入平皿中，先加Iml去离子水，再加入二氨基联苯胺显色液2滴，用移液器反复冲洗膜表面I分钟，在约4 8KD附近见到的特异性条带则表示在High five细胞上表达的E2蛋白能被单抗WH303识别，根据Western-blot确定的条带大小确定E2蛋白的位置，将第一块SDS-PAGE胶上的条带切下，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收目的蛋白(见图2)。将回收的目的蛋白再次进行Western-blot分析，以确定回收的目的蛋白的正确性(见图3)。本方法使用上海生物工程的PAGE胶蛋白微量回收试剂盒(产品编号BSP062)进行回收；其二使用了 6种E2上稳定存在的氨基酸(Asn, Asp, Leu, Lys, Thr, Val)对未知样品的蛋白水解产物进行浓度分析，使用waters的蛋白水解衍生试剂，货号WAT052880，通过计算可以得到该样品的含量。其三使用已知浓度的E2蛋白作为标准品，经过梯度稀释，使用 Phenomenex 的 BioS印-SEC-S2000 的色谱柱(Size 300x7. 80mm)，柱温设为 65°C，样品槽温度为8°C，流动相为0. IM磷酸氢二钠缓冲液，波长扫描时间20分钟，紫外检测器吸收光波值为226nm，得到一条标准曲线，依据此标准曲线，计算出未知样品中的猪瘟E2蛋白含量。(二)检测流程将回收的猪瘟E2蛋白经过离心浓缩系统(温度45°C，真空度93. 3-98. 6KPa，转速3500rpm)，浓缩至100 y L，记录准确的体积数，并抽取10 y L浓缩样，加至水解管中，力口6mo 1/L的HCl 200ul，l-2mg的固体苯酚，抽真空脱气，N2密封保护，110°C下反应24小时；反应结束后用离心浓缩系统将水解液旋蒸干(温度45°C，真空度93. 3 98. 6KPa，转速 3500rpm),加入 Norleucine 溶液 20 u L, Borate buffer 60 u L, AQC 衍生试剂 20 u L,终体积IOOy L，震荡混匀，在55°C温箱中反应10分钟，冷却至室温，准备进行液相检测；使用Waters的AccQ *Tag (Size :3. 9xl50nm)的水解衍生柱,柱温设定37°C,样品槽温度10°C,荧光激发波长295nm，输入波长395nm ;进样量5 u L，流动相设定见表I。表I 流量设定
权利要求
1.一种对猪瘟病毒E2蛋白含量的定量检测方法，其特征在于用PAGE胶进行猪瘟E2蛋白的纯化回收，经液相色谱仪分析，避免了杂蛋白对定量结果的影响，其步骤如下 步骤I试剂配制1)0.IM 磷酸盐缓冲液称取 NaCl 8g，KCl 0. 2g, Na2HPO4 12H203 63g，KH2PO4O. 24g，溶于900ml超纯水中，用盐酸调pH值至7. 2，加超纯水定容至1L，混匀； 2)0. OlM磷酸盐缓冲液取0. IM磷酸盐缓冲液100ml，加超纯水定容至1L，混匀；3)匀浆缓冲液:1.OM Tris-HCl I. Oml,即 pH 6. 8 ；10%SDS 6. 0ml, ^ -巯基乙醇 0. 2ml,超纯水2. 8ml，混匀； 4)转膜缓冲液甘氨酸2.9g，Tris 5. 8g，SDS 0. 37g，甲醇200ml，加超纯水定容至1000ml，混匀； 5)0.OlM 磷酸盐缓冲液，即 pH7. 4 NaCl 8. 0g,KCl 0. 2g,Na2HPO4 I. 44g,KH2PO4 0. 24g,加超纯水至1000ml，混匀； 6)膜染色液考马斯亮兰0.2g，甲醇80ml，乙酸2ml，超纯水118ml，混匀； 7)包被液5%脱脂奶粉I.0g，溶于200ml的磷酸盐缓冲液中，混匀； 8)显色液DAB6. Omg ；0. OlM磷酸盐缓冲液10. Oml ;硫酸镍胺0. Iml ；H202 l.Ou 1，混匀； 9)辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG，即为二抗； 10)6mol/L盐酸溶液取0. 5L浓盐酸，加水稀释至1L，混匀； 11)20mM盐酸溶液取出6. 68ml的浓盐酸，以超纯水稀释定容为1L，混匀； 12)Norleucine溶液取Norleucine粉末6.56mg,以20mM盐酸溶液稀释至1L,混勻； 13)氨基酸标准品配制:取4ml Amino Acid Standard H Stock 与 13. 12mgNorleucine粉末，用超纯水定容至100ml，混匀； 14)HPLC流动相A IOOmL Eluent A浓缩液，加入IL的超纯水，混匀；15)HPLC 流动相 B :1L 的 100%Acetonitrile 溶液； 16)HPLC流动相C :1L的0. IM磷酸氢二钠缓冲液； 步骤2样品处理取high five细胞的猪瘟E2蛋白和健康细胞的上清各1-1. 5ml，同时置于微量离心管中，以3000rPm离心10分钟，吸取上清液进行蛋白质分析；由-20° C冰箱中取出5倍上样缓冲液，取80 ill离心的上清液与20 ill 5倍的蛋白上样缓冲液混合均匀后，于水浴中煮沸15分钟后，置于冰上备用配制12%SDS-PAGE，将蛋白质分子量标准样品依序上样至胶片中，以电压150V，电泳80分钟后，一片以考马斯亮蓝进行染色，时间30min后，以脱色液脱色，确定蛋白大小；另一片胶片进行蛋白质免疫印记杂交，条件40mA，时间2小时，使蛋白质转印到醋酸纤维膜上，完成后取出膜放置于塑料洗盒中，加入25ml 5%脱脂乳在室温下进行封闭，时间30min ;倒掉脱脂乳，以PBST洗三次后，在PBST中加入一抗WH303，即1:3000，置于4° C冰箱隔夜摇晃感作，倒掉一抗，以PBST洗三次后，再以PBST洗五次，每次25ml，每次时间IOmin加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗，即1:5000稀释，室温下摇晃感作，时间lh，倒掉二抗，以PBST洗三次后，再以PBST洗五次，每次25ml，每次时间IOmin在暗室内，将膜放入平皿中，先加Iml去离子水，再加入DAB显色液，即A液和B液各I滴，用移液器反复冲洗膜表面I分钟，在48KD处见到特异性条带，则表示在High five细胞上表达的E2蛋白能被单抗WH303识别，根据Western-blot确定的条带大小确定E2蛋白的位置，将SDS-PAGE上的条带切下，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收目的蛋白，将回收的目的蛋白再次进行Western-blot分析，以确定回收的目的蛋白的正确性； 其3检测步骤 将回收的猪瘟E2蛋白经离心浓缩仪浓缩至80-110 ii L，并抽取IOii L浓缩样，加至水解小管中，加6mol/L的HCl 200ul, l_2mg的固体苯酚，抽真空脱气，采用N2气体密封保护，110°C下反应24小时；反应结束,用离心浓缩仪将水解液旋蒸至干燥状态,加入Norleucine溶液20 u L，Borate buffer 60 u L，AQC衍生试剂20 u L，最终体积100 u L，震荡混匀，在55°C温箱中反应10分钟，冷却至室温，进行液相检测；使用Waters的AccQ *Tag ,即Size .3.9xl50nm的水解衍生柱，柱温设定37°C，样品槽温度10°C，荧光激发波长设为295nm，输入波长设为395nm，进样量为L ;其中离心浓缩仪的温度45°C，真空度93. 3-98. 6KPa，转速3500rPmo
2.依据权利I所述的方法，其特征在于采用该方法获取的蛋白水解浓度相对标准偏差仅为I. 09%，具有很好的重复性和准确性。
全文摘要
本发明提供的一种对猪瘟病毒E2蛋白含量的定量检测方法，用PAGE胶进行猪瘟E2蛋白的纯化回收，经液相色谱仪分析，避免了杂蛋白对定量结果的影响；其步骤为试剂配制及样品处置，以电泳及脱色液脱色，确定蛋白大小，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收目的蛋白，再进行Western-blot分析，以确定回收的目的蛋白的正确性；其检测采用N2气体密封保护，进行液相检测；采用该方法获取的蛋白水解浓度相对标准偏差仅为1.09%，具有很好的重复性和准确性。
文档编号G01N30/06GK102967666SQ201210464999
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者赵毅, 李俊辉 申请人:新疆天康畜牧生物技术股份有限公司