专利名称：：一种安培型生物传感器电极及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种安培型生物传感器电极及其制备方法，尤其涉及一种静电纺丝制备复合电子媒介体的活化层的方法。
背景技术：
：电化学生物传感器中，生物敏感膜是关键部分，决定了传感器的质量与功能。基于氧化还原蛋白质和酶(以下统称为酶)的电化学传感器一直是生物传感器研究的主流。根据酶与电极的电子转移机理，大致可将电化学酶传感器划分为三代。以葡萄糖氧化酶电极为例，第一代电化学传感器以溶解氧作为酶与电极之间的电子通道；第二代以人工合成的电子媒介体作为代替溶解氧作为电子通道；第三代则既不需要氧分子，也不需要电子媒介体，而是利用酶自身与电极间的直接电子转移来完成信号转换。第一代传感器中相应信号与氧分压或溶解氧关系较大，响应时间较长，灵敏度不高，且易受到抗坏血酸、尿酸、乙酰氨基酚等电活性物质的干扰。人工媒介体的采用降低了传感器对氧分压或溶解氧的依赖以及电活性物质的干扰，使传感器的工作寿命延长。电子媒介体可以被溶解在试样的溶液中或固定于生物敏感膜内。前者须向试样中不断加入媒介体，不利于电极的反复使用。后者在测量时无须加入其它试剂，被称为无试剂传感器，提高了传感器的响应稳定性。第三代传感器则已完全排除了外界的干扰，但由于理论的不成熟性，目前尚处于研究探索中。有多种方式可将电子媒介体固定于生物敏感膜内。Carolan等将二茂铁与过氧化物酶偶联以实现酶活性中心与电极的电子传递(N.Carolan，R.J.Forster,C.O'Fagain."Covalentattachmentofferrocenetosoybeanperoxidaseglycans:Electrontransfermediationtoredoxenzymes",BioconjugateChem.，2007,18:524-529)。Garcia等将二茂铁偶联于壳聚糖侧基，而后将这种修饰过的壳聚糖与酶共沉积到电极表面(A.Garcia,C.Peniche國Covas,B.Chico,B.K.Simpson,R.Villalonga."Ferrocenebranchedchitosanfortheconstructionofareagentlessamperometrichydrogenperoxidebiosensor",Macromol.Biosci.2007,7，435-439)。US6720164和US552551将电子媒介体包裹于电极材料中，确保了酶电极的反复使用性。静电纺丝纤维膜是目前受关注的一种酶固定化载体，静电纺丝也是制备复合材料的一种常见方法。
发明内容本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种安培型生物传感器电极及其制备方法。安培型生物传感器电极包括基底电极和活化层，在基底电极上设有活化层，特征是1)活化层由丙烯腈共聚物和电子媒介体复合纳米纤维膜和固定的氧化还原酶构成。2)活化层的纳米纤维膜由静电纺丝法制备。■3)丙烯腈共聚物中，共聚单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、马来酸酐、衣康酸或甲基丙烯酸縮水甘油酯，共聚单体占丙烯腈共聚物摩尔百分数为520%，丙烯腈共聚物的粘均分子量为3万10万，电子媒介体占丙烯腈共聚物的质量分数为5%80%。4)电子媒介体为二茂铁、卟啉、铁卟啉或锌卧啉。所述的氧化还原酶为过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇脱氢酶或漆酶。安培型生物传感器电极的制备方法包括如下步骤1)将含有丙烯酸、甲基丙烯酸或衣康酸的丙烯腈共聚物与电子媒介体共溶解于二甲基甲酰胺中，其中丙烯腈共聚物质量分数为2%15%，电子媒介体的质量占丙烯腈共聚物的5%80%。以铂电极、金电极或玻碳电极为接收板，当电压为1020千伏、挤出速率为0.53.0毫升/小时、接收距离为1020厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续210小时，得到沉积有丙烯腈共聚物和电子媒介体复合纳米纤维膜的电极。2)将沉积有丙烯腈共聚物和电子媒介体复合纳米纤维膜的电极表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为520毫克/毫升，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为312毫克/毫升，在4°C25°C下振荡活化210小时，然后用缓冲溶液洗涤35次；将活化的电极表面浸入含有l10毫克/毫升氧化还原酶的缓冲溶液，在4°C25°C下振荡反应324小时后，得到含有丙烯酸、甲基丙烯酸或衣康酸的纤维表面固定酶的电极，4。C下保存待用。安培型生物传感器电极的制备方法包括如如下步骤l)将含有马来酸酐或甲基丙烯酸缩水甘油酯的丙烯腈共聚物与电子媒介体共溶解于二甲基甲酰胺中，其中丙烯腈共聚物质量分数为2%15%，电子媒介体的质量占丙烯腈共聚物的5%80%。以铂电极、金电极或玻碳电极为接收板，当电压为1020千伏、挤出速率为0.53.0毫升/小时、接收距离为1020厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续210小时，得到沉积有丙烯腈共聚物和电子媒介体复合纳米纤维膜的电极。2)将沉积有丙烯腈共聚物和电子媒介体复合纳米纤维膜的电极表面浸入含有110毫克/毫升的氧化还原酶的缓冲溶液，在425°C下振荡反应324小时后得到含有马来酸酐或甲基丙烯酸縮水甘油酯的纤维表面固定酶的电极，放于4°C下保存待用。所述的氧化还原酶为过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇脱氢酶或漆酶。所述的电子媒介体为二茂铁、卟啉、铁卟啉或锌卟啉。本发明与现有相比具有的有益效果1)酶电极制备方法简单；电极表面的纤维层含有反应性基团，便于酶固定化;2)纤维复合层极高的比表面积和高的孔隙率使得电极的载酶效率高，底物扩散阻力小；而且电子媒介体的引入明显降低了电极的检测限，加快了响应速度，提高了电极响应，加宽了可检测分析物的线性响应范围，增加了电极的抗干扰能力；3)酶和电子媒介体的固定化极大的提高了电极的响应稳定性，且由于电子媒介体的疏水特性使得电极可被反复使用并且可被储存很长时间，从而降低了电极的制作成本并提高了电极使用的普遍性；4)电子媒介体的固定化方法简便易行，而且不消耗支撑层的反应性基团。具体实施例方式以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实施例不构成对本发明的限制。实施例11)将含有丙烯酸的丙烯腈共聚物(粘均分子量10万，共聚单体摩尔百分数为5%)与二茂铁共溶解于二甲基甲酰胺中，其中丙烯腈共聚物质量分数为2%,二茂铁的质量占丙烯腈共聚物的5%。以铂电极为接收板，当电压为IO千伏、挤出速率为0.5毫升/小时、接收距离为IO厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续2小时，得到沉积有丙烯腈共聚物和二茂铁复合纳米纤维膜的电极。2)将沉积有丙烯腈共聚物和二茂铁复合纳米纤维膜的电极表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为5毫克/毫升，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为3毫克/毫升，在25。C下振荡活化2小时，然后用缓冲溶液洗涤3次；将活化的电极表面浸入含有l毫克/毫升过氧化氢酶的缓冲溶液，在25。C下振荡反应3小时后，得到含有丙烯酸的纤维表面固定酶的电极，4°C下保存待用。实施例21)将含有甲基丙烯酸的丙烯腈共聚物(粘均分子量3万，共聚单体摩尔百分数为20%)与卟啉共溶解于二甲基甲酰胺中，其中丙烯腈共聚物质量分数为15%，电子媒介体的质量占丙烯腈共聚物的80%。以金电极为接收板，当电压为20千伏、挤出速率为3.0毫升/小时、接收距离为20厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续IO小时，得到沉积有丙烯腈共聚物和电子媒介体复合纳米纤维膜的电极。2)将沉积有丙烯腈共聚物和卟啉复合纳米纤维膜的电极表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为20毫克/毫升，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为12毫克/毫升，在4°C下振荡活化10小时，然后用缓冲溶液洗涤5次；将活化的电极表面浸入含有10毫克/毫升葡萄糖氧化酶的缓冲溶液，在4。C下振荡反应24小时后，得到含有甲基丙烯酸的纤维表面固定酶的电极，4。C下保存待用。实施例31)将含有衣康酸的丙烯腈共聚物(粘均分子量3万，共聚单体摩尔百分数为20%)与铁卟啉共溶解于二甲基甲酰胺中，其中丙烯腈共聚物质量分数为15%，铁卟啉的质量占丙烯腈共聚物的80%。以玻碳电极为接收板，当电压为20千伏、挤出速率为3.0毫升/小时、接收距离为20厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续IO小时，得到沉积有丙烯腈共聚物和铁卟啉复合纳米纤维膜的电极。2)将沉积有丙烯腈共聚物和铁卟啉复合纳米纤维膜的电极表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为20毫克/毫升，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为12毫克/毫升，在4°C下振荡活化10小时，然后用缓冲溶液洗涤5次；将活化的电极表面浸入含有10毫克/毫升葡萄糖氧化酶的缓冲溶液，在4。C下振荡反应24小时后，得到含有甲基丙烯酸的纤维表面固定酶的电极，4°C下保存待用。实施例4l)将含有衣康酸的丙烯腈共聚物(粘均分子量3万，共聚单体摩尔百分数为20%)与锌卟啉共溶解于二甲基甲酰胺中，其中丙烯腈共聚物质量分数为15%，锌卟啉的质量占丙烯腈共聚物的80%。以玻碳电极为接收板，当电压为20千伏、挤出速率为3.0毫升/小时、接收距离为20厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续10小时，得到沉积有丙烯腈共聚物和锌卟啉复合纳米纤维膜的电极。2)将沉积有丙烯腈共聚物和锌卟啉复合纳米纤维膜的电极表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为20毫克/毫升，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为12毫克/毫升，在4°C下振荡活化10小时，然后用缓冲溶液洗涤5次；将活化的电极表面浸入含有10毫克/毫升葡萄糖氧化酶的缓冲溶液，在4。C下振荡反应24小时后，得到含有甲基丙烯酸的纤维表面固定酶的电极，4°C下保存待用。实施例5以过氧化物酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例4相同。实施例6以细胞色素代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例4相同。实施例7以胆固醇氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例4相同。实施例8以乙醇脱氢酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例4相同。实施例9以漆酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例4相同。实施例101)将含有马来酸酐的丙烯腈共聚物(粘均分子量10万，共聚单体摩尔百分数为5%)与二茂铁共溶解于二甲基甲酰胺中，其中丙烯腈共聚物质量分数为2%，二茂铁的质量占丙烯腈共聚物的5%。以铂电极为接收板，当电压为IO千伏、挤出速率为0.5毫升/小时、接收距离为10厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续2小时，得到沉积有丙烯腈共聚物和二茂铁复合纳米纤维膜的电极。2)将沉积有丙烯腈共聚物和二茂铁复合纳米纤维膜的电极表面浸入含有1毫克/毫升的过氧化氢酶的缓冲溶液，在25°C下振荡反应3小时后得到含有马来酸酐的纤维表面固定酶的电极，放于4T下保存待用。实施例11将含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的丙烯腈共聚物(粘均分子量3万，共聚单体摩尔百分数为20%)与卟啉共溶解于二甲基甲酰胺中，其中丙烯腈共聚物质量分数为15%，电子媒介体的质量占丙烯腈共聚物的80%。以金电极为接收板，当电压为20千伏、挤出速率为3.0毫升/小时、接收距离为20厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续10小时，得到沉积有丙烯腈共聚物和卟啉复合纳米纤维膜的电极。2)将沉积有丙烯腈共聚物和卟啉复合纳米纤维膜的电极表面浸入含有10毫克/毫升的葡萄糖氧化酶的缓冲溶液，在4下振荡反应24小时后得到含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的纤维表面固定酶的电极，放于4QC下保存待用。实施例121)将含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的丙烯腈共聚物(粘均分子量3万，共聚单体摩尔百分数为20%)与铁卟啉共溶解于二甲基甲酰胺中，其中丙烯腈共聚物质量分数为15%，铁卟啉的质量占丙烯腈共聚物的80%。以玻碳电极为接收板，当电压为20千伏、挤出速率为3.0毫升/小时、接收距离为20厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续10小时，得到沉积有丙烯腈共聚物和铁B卜啉复合纳米纤维膜的电极。2)将沉积有丙烯腈共聚物和铁卟啉复合纳米纤维膜的电极表面浸入含有10毫克/毫升的葡萄糖氧化酶的缓冲溶液，在4下振荡反应24小时后得到含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的纤维表面固定酶的电极，放于4°C下保存待用。实施例131)将含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的丙烯腈共聚物(粘均分子量3万，共聚单体摩尔百分数为20%)与锌卟啉共溶解于二甲基甲酰胺中，其中丙烯腈共聚物质量分数为15%，铁卟啉的质量占丙烯腈共聚物的80%。以铂电极为接收板，当电压为20千伏、挤出速率为3.0毫升/小时、接收距离为20厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续IO小时，得到沉积有丙烯腈共聚物和锌卟啉复合纳米纤维膜的电极。2)将沉积有丙烯腈共聚物和锌卟啉复合纳米纤维膜的电极表面浸入含有10毫克/毫升的葡萄糖氧化酶的缓冲溶液，在4下振荡反应24小时后得到含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的纤维表面固定酶的电极，放于4°C下保存待用。实施例14以过氧化物酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例13相同。实施例15以细胞色素代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例13相同。实施例16以胆固醇氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例13相同。实施例17以乙醇脱氢酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例13相同。实施例18以漆酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例13相同。表1制备的安培型葡萄糖生物传感器电极参数例号<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1.一种安培型生物传感器电极，包括基底电极和活化层，在基底电极上设有活化层，其特征是1)活化层由丙烯腈共聚物和电子媒介体复合纳米纤维膜和固定的氧化还原酶构成。2)活化层的纳米纤维膜由静电纺丝法制备。3)丙烯腈共聚物中，共聚单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、马来酸酐、衣康酸或甲基丙烯酸缩水甘油酯，共聚单体占丙烯腈共聚物摩尔百分数为5～20％，丙烯腈共聚物的粘均分子量为3万～10万，电子媒介体占丙烯腈共聚物的质量分数为5％～80％。4)电子媒介体为二茂铁、卟啉、铁卟啉或锌卟啉。2.如权利要求1所述的一种安培型生物传感器电极，其特征在于所述的氧化还原酶为过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇脱氢酶或漆酶。3.—种如权利要求1所述的安培型生物传感器电极的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)将含有丙烯酸、甲基丙烯酸或衣康酸的丙烯腈共聚物与电子媒介体共溶解于二甲基甲酰胺中，其中丙烯腈共聚物质量分数为2%15%，电子媒介体的质量占丙烯腈共聚物的5%80%。以铂电极、金电极或玻碳电极为接收板，当电压为1020千伏、挤出速率为0.53.0毫升/小时、接收距离为1020厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续210小时，得到沉积有丙烯腈共聚物和电子媒介体复合纳米纤维膜的电极。2)将沉积有丙烯腈共聚物和电子媒介体复合纳米纤维膜的电极表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为520毫克/毫升，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为312毫克/毫升，在4。C25。C下振荡活化210小时，然后用缓冲溶液洗涤35次；将活化的电极表面浸入含有l10毫克/毫升氧化还原酶的缓冲溶液，在4°C25°C下振荡反应324小时后，得到含有丙烯酸、甲基丙烯酸或衣康酸的纤维表面固定酶的电极，4。C下保存待用。4.一种如权利要求1所述的安培型生物传感器电极的制备方法，其特征在于包括如如下步骤l)将含有马来酸酐或甲基丙烯酸縮水甘油酯的丙烯腈共聚物与电子媒介体共溶解于二甲基甲酰胺中，其中丙烯腈共聚物质量分数为2%15%，电子媒介体的质量占丙烯腈共聚物的5%80%。以铂电极、金电极或玻碳电极为接收板，当电压为1020千伏、挤出速率为0.53.0毫升/小时、接收距离为1020厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续210小时，得到沉积有丙烯腈共聚物和电子媒介体复合纳米纤维膜的电极。2)将沉积有丙烯腈共聚物和电子媒介体复合纳米纤维膜的电极表面浸入含有110毫克/毫升的氧化还原酶的缓冲溶液，在425°C下振荡反应324小时后得到含有马来酸酐或甲基丙烯酸縮水甘油酯的纤维表面固定酶的电极，放于4。C下保存待用。5.如权利要求3或4所述的一种安培型生物传感器电极的制备方法，其特征在于所述的氧化还原酶为过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇脱氢酶或漆酶。6.如权利要求3或4所述的一种安培型生物传感器电极的制备方法，其特征在于所述的电子媒介体为二茂铁、卟啉、铁卟啉或锌卟啉。全文摘要本发明公开了一种安培型生物传感器电极及其制备方法。以二甲基甲酰胺为溶剂，丙烯腈共聚物和电子媒介体为原料，电化学电极为接受电极，通过静电纺丝在电极表面制备了丙烯腈共聚物和电子媒介体的复合纤维膜，然后用共价法将氧化还原酶固定于纤维表面，形成电极表面的纤维活化层。纤维的活化层具有极大的比表面积、高孔隙率和通孔结构，同时由于含有电子媒介体，因此电极具有较高的响应强度、线性检测范围和稳定性均较高。该介体电化学酶电极具有制备过程简单，可以反复使用，有效酶膜表面积大，抗干扰能力强等特点，适合批量化生产。文档编号G01N27/327GK101285791SQ20081006162公开日2008年10月15日申请日期2008年5月23日优先权日2008年5月23日发明者徐志康,王振刚,黄小军申请人:浙江大学