专利名称：作为pi3k/akt激酶途径抑制剂效能的预测性生物标记的foxo3a的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为P13K/AKT途径激酶抑制剂效能的预测的F0X03a定位、基于F0X03a定位对患者进行分级(stratifying)以及给予PI3K/AKT途径激酶抑制剂的方法。
背景技术：
蛋白激酶包括两类蛋白酪氨酸激酶(PTK)和丝氨酸-苏氨酸激酶(STK)。蛋白激酶B/AKT酶为一类丝氨酸-苏氨酸激酶，其在多种人类肿瘤中过表达。PI3K脂质产物的最充分表征的靶标中的一种为57KD丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶AKT，其位于在信号转导途径中 PI3K 的下游(Hemmings，B. A. (1997) Science 275:628 ；Hay N. (2005) Cancer Cell8:179-183)。磷酸肌醇3-激酶(PI3K)为这样的脂质激酶，其在肌醇环的3-羟基残基上对脂质进行磷酸化(Whitman et al (1988) Nature, 332:664)。由PI3-激酶产生的3-磷酸化磷脂(PIP3s)作为募集具有脂质结合区域(包括锤型同源性(PH)区域)的激酶的第二信使，诸如AKT和磷酸肌醇依赖性激酶-1 (PDKl)。AKT与膜PIP3的结合引起AKT向质膜的易位，这使得AKT与TOKl接触，这 导致激活AKT。肿瘤抑制基因磷酸酶PTEN使得PIP3去磷酸化且因此作为AKT活化的负性调节剂。PI3-激酶AKT和TOKl对于以下而言是重要的许多细胞进程包括细胞周期调节、增殖、存活、凋亡以及运动性的调节，且为疾病诸如癌症、糖尿病和免疫炎症的分子机制的重要组成(Vivanco et al (2002) Nature Rev. Cancer 2:489 ；Phillips et al (1998)Cancer 83:41)。认为AKT通过抑制凋亡且同时增强血管发生和增殖而维持其对癌症的效应(Toker et al (2006) Cancer Res. 66(8) :3963-3966) 癌症中的主要PI3-激酶同工型为I型PI3-激酶pllO a (alpha)。AKT的三种同工型通过对一组下游靶标包括F0X03a、TSCl/2、GSK3 β和BAD的磷酸化来调节细胞进程。由AKT对F0X03a的磷酸化导致细胞质定位(cytoplasmic localization)以及F0X03a的负性调节,这是因为其避开了促细胞凋亡基因和细胞周期抑制基因的转录调控。其它同工型牵涉于心血管和免疫炎性疾病中。PI3激酶/AKT途径为开发在癌症细胞中抑制增殖、逆转细胞凋亡抑制以及克服对细胞毒素剂的耐药性的抗癌药物的引人注目的靶标。

发明内容
本发明的一方面包括预测肿瘤细胞生长对由PI3K/AKT激酶途径抑制剂产生的抑制的敏感性的方法，包括确定F0X03a在肿瘤细胞中的定位分布，其中F0X03a的细胞质定位分布与对由PI3K/AKT激酶抑制剂产生的抑制的敏感性相关，且F0X03a的细胞核定位分布与对由PI3K/AKT激酶抑制剂产生的抑制的抗性相关。本发明的一方面包括治疗患者中的肿瘤的方法,包括对所述患者给予治疗有效量的PI3K/AKT激酶途径抑制剂或者其立体异构体或者盐，其中治疗取决于具有细胞质F0X03a定位分布的患者的肿瘤。本发明的一方面包括治疗患者中的肿瘤的方法,包括对所述患者给予治疗有效量的PI3K/AKT激酶途径抑制剂或者其立体异构体或者盐，其中F0X03a在肿瘤中的定位分布基本上为细胞质中的。本发明的一方面包括治疗患者中的肿瘤的方法，包括选择具有细胞质定位分布的肿瘤的患者以及对所述患者给予治疗有效量的PI3K/AKT激酶途径抑制剂或者其立体异构体或者盐。


图1示例说明了 FOXO患者如何成为PI3K/AKT信号传导的直接靶标。AKT通过磷酸化负性调节F0X03a，进而将其定位于细胞质。当AKT为失活时，F0X03a被去磷酸化且易位至细胞核，在此其启动诱导细胞周期停滞以及细胞凋亡的基因。图2A-B为荧光显微图像，其显示未处理的以及用式I的化合物⑶C-0068处理后的BT474细胞。在图2A中，F0X03a集中于细胞质中。在图2B中，BT474细胞显示为用式I的化合物处理后的，其中所述AKT已经失活且F0X03a被去磷酸化且显示为易位至细胞核。图3A-B为荧光显微图像，其显示基线F0X03a在对AKT抑制剂⑶C-0068敏感的细胞系中为在细胞质中的，且在抗性细胞系中为在细胞核中的。图像显示Hoechst细胞核染色(底部)、F0X03a染色(中间)和合并的(叠加)图像(顶部)。图3A显示F0X03a在一组乳腺癌细胞系中的基线定位，所述细胞系先前确定为对AKT抑制剂处理敏感的。在敏感细胞系中，F0X03a显示为在细胞质中的，这与激活的AKT—致。图3B显示F0X03a在一组乳腺癌细胞系中的基线定位，所述细胞系先前确定为对AKT抑制剂处理具有抗性的。在抗性细胞系中，F0X03a主要显示为在细胞核中的。MDA-MB-468为PTEN缺失的细胞系且因此预期为使得AKT途径激活。然而，该细胞系对至少一种式I的化合物GDC-0068具有抗性。在该细胞系中，观察到F0X03a的分布式的细胞质和细胞核染色。图4显示使用在Cellomics平台上的细胞核易位算法进行F0X03a定位的定量。F0X03a细胞核vs细胞质定位使用Cellomics HCS Arrayscan、使用细胞质对细胞核易位算法进行定量。该数据作为细胞核与细胞质染色强度之间的差异呈现于图表上。F0X03a在AKT抑制剂GDC-0068敏感细胞系中的染色在该分析中主要为在细胞质中的(负数)，而AKT抑制剂GDC-0068抗性细胞系显示细胞核信号(正数)。给出了 GDC-0068在各细胞系中的IC5tl值(微摩尔)，这证实了该细胞系对AKT抑制剂的敏感性。给出了各细胞系的PTEN状态(PTEN缺失的细胞系显示为)。图5显示了另外的细胞系数据,其证实了 F0X03a细胞质定位预测出对式I的AKT抑制剂⑶C-0068的敏感性。显示了先前确定为对至少一种式I的AKT抑制剂⑶C-0068具有抗性(IC5tl大于约20微摩尔)但PTEN处于缺失状态的细胞系。鉴于PTEN缺失的状态，这些细胞系通常预期为对式I的AKT抑制剂诸如⑶C-0068进行响应的。
相比于先前确定为PTEN缺失的敏感的且显示细胞质染色的细胞系(EVSAT、HCC70)，PTEN缺失的四种抗性细胞系中的三种仍然显示对于F0X03a主要为细胞核染色，这与其抗性表型一致。对全部细胞系进行比较，在对AKT抑制剂具有抗性的PTEN(-)乳腺癌细胞系中，F0X03a定位相比于细胞质而言趋向于在细胞核中更强。该数据表明了 F0X03a定位测定可用于鉴别对AKT抑制剂具有抗性的肿瘤且可为AKT抑制剂敏感性的更准确的预测齐U。除了遗传改变之外，可使用该定位测定诸如作为激活的AKT途径的标记物的PTEN。此夕卜，该数据表明了当与PTEN状态组合使用来预测AKT抑制剂效能时，F0X03a定位分布提供了由于单独使用PTEN状态的优势。图6显示了散布图，其在对AKT抑制剂⑶C-0068具有抗性和敏感的各种细胞系中比较了对于F0X03a的定位测定敏感性以及对于磷酸-AKT的Luminex测定敏感性。如所观察到的，对于F0X03a测定在抗性与敏感性细胞系之间存在更清晰的差异。对于磷酸-AKT的Luminex测定结果在抗性与敏感性细胞系之间具有更多的叠加，且因此具有减弱的敏感性。因此，F0X03a定位相比于磷酸-AKT ( 一种充分描述的AKT激活的标记物)而言可更有效地区分AKT抑制剂敏感性与抗性细胞系。图7显示了在用⑶C-0941 ( 一种PI3K抑制剂)和( C-0068 ( 一种式I的AKT抑制剂)处理之前和之后的各种敏感性细胞系的荧光图像。这些图像表明了在对PI3K/AKT抑制剂敏感的细胞系中在用PI3K和AKT抑制剂处理后F0X03a由细胞质易位至细胞核。图8显示了在用⑶C-0941(—种PI3K抑制剂)和⑶C_0068(—种式I的AKT抑制齐U)处理之前和之后的各种抗性细胞系的荧光图像。F0X03a在PI3K/AKT抑制剂抗性细胞系中在基线为在细胞核中的且在用PI3K/AKT抑制剂处理后保留在细胞核中。在具有PI3K/AKT激活的抗性细胞系(即PTEN缺失的MB-468)中，F0X03a同时存在于细胞核和细胞质中且用PI3K/AKT抑制剂进行处理导致了更完全的重新定位至细胞核中。图9显示了针对在用式I的AKT抑制剂⑶C-0068处理后的F0X03a定位的图7和8的定量数据的条形图。该图下面的图表表明激活PI3K/AKT途径的遗传改变(PI3K突变或者PTEN缺失)是否存在于 测试的细胞系中。此外，指出了各种细胞中的每种对于式I的AKT抑制剂的IC50值。基于测量的IC50值，各种细胞分类为敏感性组⑶或者抗性组(R)。图1OA-C显示了在用⑶C-0941处理细胞系之前和之后的定位测定结果。在图1OA中，在对⑶C-0941敏感的细胞系中在用⑶C-0941处理后F0X03a由细胞质重新定位至细胞核中。在图1OB中，在对GDC-0941具有抗性的细胞系中，F0X03a在基线为在细胞核中的且在处理后保留在细胞核中。图1OC显示了图1OA-B数据的定量，这表明了在用⑶C-0941处理后F0X03a定位至细胞核中。由于F0X03a定位变化一致性地响应于⑶C-0941和式I的AKT抑制剂，该数据表明F0X03a定位通过PI3K/AKT途径调节且对靶向该途径的抑制剂敏感。图1lA-C显示在用Η)-901(—种已知的MEK抑制剂)处理细胞系之前和之后的定位测定结果。在图1lA-C中，F0X03a定位在用PD901 ( 一种MEK1/2抑制剂)处理后未改变，这表明F0X03a定位在这些细胞系中未被MAPK途径调节。在该施用浓度的Η)901已经在该组乳腺癌细胞系中证实为具有活性的(Hoeflich KP et al，Clin Cancer Res15(14):4649-64, 2009)。图12A-B显示在对式I的AKT抑制剂⑶C-0068敏感的或者具有抗性的前列腺细胞系中的定位测定结果。在图12A中，对式I的AKT抑制剂GDC-0068敏感的细胞系具有细胞质定位分布，而抗性细胞具有细胞核定位分布。图12B显示了图12A数据的定量，这表明定位分布可用于预测式I的AKT抑制剂在前列腺细胞系中的效能。
具体实施方式
定义“酰基”是指由式-C (O)-R所表示的含有取代基的羰基，其中R为H、烷基、环烷基、杂环基、环烧基取代的烧基或者杂环基取代的烧基，其中所述烧基、烧氧基、环烧基和杂环基如本申请所定义。酰基包括烷酰基(例如乙酰基)、芳酰基(例如苯甲酰基)和杂芳酰基(例如吡啶酰基)。术语〃烷基〃是指饱和直链或者支链一价烃基，其中所述烷基可任选独立取代有本申请所述的一种或者多种取代基。在一个实例中，所述烷基含有一至十八个碳原子(C1-C18)。在其它实例中，所述烧基为 Ctl-Cp C0-C5, Ctl-Cy C1-C12, C1-C10, C1-C8, C1-C6, C1-C5,C1-C4或者C1-C315烧基的实例包括甲基(Me、_CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n_Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2_ 丙基(丨- 1*、异丙基、-01((!13)2)、1- 丁基(η-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2_ 甲基 _1_ 丙基(i_Bu、异丁基、-CH2CH(CH3)2)、2_ 丁基(s_Bu、仲丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2_ 甲基 _2_ 丙基(t_Bu、叔丁基、-C(CH3)3)、1-戍基(正戍基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戍基(-CH(CH3) CH2CH2CH3) >3-戊基(-CH (CH2CH3) 2)、2-甲基-2- 丁基(-C (CH3)2CH2CH3) >3-甲基-2- 丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1- 丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1- 丁基(-CH2CH(CH3) CH2CH3) >1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH (CH3) CH2CH2CH2CH3)、
3-己基(-CH(CH2CH3) (CH2CH2CH3))、2-甲基 _2_ 戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH (CH3) CH2CH (CH3) 2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3) (CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2，3- 二甲基-2- 丁基(-C (CH3) 2CH(CH3) 2)、3，3- 二甲基-2- 丁基(-CH(CH3) C (CH3) 3、1-庚基和1-辛基。术语〃烯基〃是指具有至少一个不饱和位点即碳碳双键的直链或者支链一价烃基，其中所述烯基可任选独立取代有本申请所述的一种或者多种取代基，且包括具有"顺"和〃反〃定向或者可选择地"E"和"Z"取向的基团。在一个实例中，所述烯基含有二至十八个碳原子(C2-C18)。在其它实例中，所述烯基为C2-C12、C2-C10, C2-C8, C2-C6或者C2-C3。实例包括但不限于乙烯基(-CH=CH2)、丙-1-烯基(-CH=CHCH3)、丙-2-烯基(-CH2CH=CH2)、2_甲基丙_1_稀基、丁 _1_稀基、丁 _2_稀基、丁 _3_稀基、丁 -1，3- 二稀基、2_甲基丁 -1，3- 二稀基、己_1_稀基、己-2-稀基、己-3-稀基、己-4-稀基和己-1，3- 二稀基。术语“烷氧基”是指由式-OR所表示的直链或者支链一价基团，其中R为烷基、烯基、块基或者环烧基，其可进一步任选如本申请所述取代。烧氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、单氟甲氧基、二氟甲氧基和三氟甲氧基以及环丙氧基。 术语〃炔基〃是指具有至少一个不饱和位点即碳碳三键的直链或者支链一价烃基，其中所述炔基可任选独立取代有本申请所述的一种或者多种取代基。在一个实例中，所述炔基含有二至十八个碳原子(C2-C18)。在其它实例中，所述炔基为C2-C12、c2-c1Q、c2-c8、C2-C6或者C2-C3。实例包括但不限于乙块基(-C = CH)、丙-1-块基(-C = CCH3)、丙_2_块基(块丙基、-CH2C = CH)、丁 -1-块基、丁 _2_块基和丁 -3-块基。
“氨基”表示任选取代的伯氨基(即-NH2)、仲氨基(即-NRH)和叔氨基(即-NRR)，其中R为烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、环烷基取代的烷基或者杂环基取代的烷基，其中所述烧基、烧氧基、环烧基和杂环基如本申请所定义。具体的仲胺和叔胺为烧基胺、~■烧基胺、芳基胺、二芳基胺、芳烷基胺和二芳烷基胺，其中所述烷基如本申请所定义且任选取代。具体的仲胺和叔胺为甲基胺、乙基胺、丙基胺、异丙基胺、苯基胺、苄基胺、二甲基胺、二乙基胺、二丙基胺和二异丙基胺。本申请使用的“氨基保护基”是指通常用于阻碍或者保护氨基而反应在化合物的其它官能团上进行的衍生基团。所述保护基的实例包括氨基甲酸酯基、酰氨基、烷基和芳基、亚氨基以及可移去以重新生成预期氨基的许多N-杂原子衍生基团。具体的氨基保护基为Pmb(对甲氧基节基)、Boc(叔叔丁基氧基羰基)、Fmoc(9-荷基甲基氧基羰基)和Cbz(苄基氧基羰基)。这些基团的其它实例出现于T.W. Greene andP. G. M. ffuts, “Protective Groups inOrganic Synthesis”，2nd ed. , John Wiley &Sons, Inc. , New York, NY,1991，chapter 7 ；E. HasIam, “Protective Groups in OrganicChemistry，，，J. G. W. McOmie, Ed.，Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5 以及T. ff. Greene, “Protective Groups in Organic Synthesis，，，John Wiley and Sons, NewYork, NY, 1981中。术语“保护的氨基”是指取代有上述氨基保护基中的一种的氨基。当单独使用或者作为其它术语的一部分使用时，“芳基”是指具有指定数目的碳原子或者至多14个碳原子(如果未指定数目)的碳环芳族基团(无论是否与一个或者多个基团稠合)。芳基的实例包括苯基、萘基、联苯基、菲基、并四苯基、1，2，3，4-四氢萘基、IH-茚基、2，3- 二氢-1H-却基等(参见例如 Lang，sHandbook of Chemistry (Dean, J. A. , ed) 13thed.表7-2 [1985])。具体的芳基为苯基。取代的苯基或者取代的芳基是指取代有一、二、三、四或者五个选自本申请所述的基团的例如1-2、1-3或者1-4个取代基的苯基或者芳基。在一个实例中，芳基上任选的取代基选自卤素(F、Cl、Br、I)、羟基、经保护的羟基、氰基、硝基、烷基(例如C1-C6烷基)、烷氧基(例如C1-C6烷氧基)、苄基氧基、羧基、经保护的羧基、羧基甲基、经保护的羧基甲基 、羟基甲基、经保护的羟基甲基、氨基甲基、经保护的氨基甲基、三氟甲基、烷基磺酰基氨基、烷基磺酰基氨基烷基、芳基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基烷基、杂环基磺酰基氨基、杂环基磺酰基氨基烷基、杂环基、芳基或者其它所述的基团。在这些取代基上的一个或者多个次甲基(CH)和/或者亚甲基(CH2)本身可取代有如上所述的类似的基团。术语“取代的苯基”的实例包括单-或者二(卤素)苯基诸如2-氯苯基、2-溴苯基、4-氯苯基、2，6-二氯苯基、2，5-二氯苯基、3，4-二氯苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-溴苯基、3，4- 二溴苯基、3-氯-4-氟苯基、2-氟苯基等；单-或者二(轻基)苯基诸如4-轻基苯基、3-羟基苯基、2，4- 二羟基苯基及其经保护的羟基衍生基团等；硝基苯基诸如3-或者
4-硝基苯基；氰基苯基，例如4-氰基苯基；单_或者二(低级烷基)苯基诸如4-甲基苯基、2，4-二甲基苯基、2-甲基苯基、4-(异丙基)苯基、4-乙基苯基、3-(正丙基)苯基等；单-或者_■(烧氧基)苯基，例如3,4- _■甲氧基苯基、3_甲氧基-4-节基氧基苯基、3_乙氧基苯基、4-(异丙氧基)苯基、4-(叔丁氧基)苯基、3-乙氧基-4-甲氧基苯基等；3_或者4- 二氟甲基苯基；单-或者二羧基苯基或者(经保护的羧基)苯基诸如4-羧基苯基、单-或者二(羟基甲基)苯基或者(经保护的羟基甲基)苯基诸如3-(经保护的羟基甲基)苯基或者3，4-二(羟基甲基)苯基；单-或者二(氨基甲基)苯基或者(经保护的氨基甲基)苯基诸如2-(氨基甲基)苯基或者2，4-(经保护的氨基甲基)苯基；或者单-或者二(N-(甲基磺酰基氨基))苯基诸如3-(N-甲基磺酰基氨基))苯基。同样，术语“取代的苯基”表示二取代的苯基，其中所述取代基为不同的，例如3-甲基-4-羟基苯基、3-氯-4-羟基苯基、
2-甲氧基-4-溴苯基、4-乙基-2-羟基苯基、3-羟基-4-硝基苯基、2-羟基-4-氯苯基等，以及三取代的苯基，其中所述取代基为不同的，例如3-甲氧基-4-苄基氧基-6-甲基磺酰基氨基、3-甲氧基-4-苄基氧基-6-苯基磺酰基氨基，以及四取代的苯基，其中所述取代基为不同的，诸如3-甲氧基-4-苄基氧基-5-甲基-6-苯基磺酰基氨基。具体的取代的苯基包括2-氯苯基、2-氨基苯基、2-溴苯基、3-甲氧基苯基、3-乙氧基-苯基、4-苄基氧基苯基、4_甲氧基苯基、3-乙氧基-4-节基氧基苯基、3，4- _■乙氧基苯基、3_甲氧基-4-节基氧基苯基、3-甲氧基-4-(1-氯甲基)苄基氧基-6-甲基磺酰基氨基苯基。稠合的芳环也可以与取代的烷基相同的方式取代有本申请所述的例如1、2或者3个任何的取代基。术语“癌症”和“癌性”、“赘生物(neoplasm) ”、“肿瘤”是指或者描述哺乳动物中的生理状况，其典型特征在于未调节的细胞生长。“肿瘤”包括一种或者多种癌性细胞。肿瘤包括实体瘤和非实体瘤。"化学治疗剂"为用于治疗给定病症例如癌症或者炎性病症的药物。化学治疗剂的实例包括NSAID ;激素类，诸如糖皮质激素；皮质激素，诸如氢化可的松、乙酸氢化可的松、乙酸可的松、新戊酸替可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、泼尼松、曲安奈德、曲安西龙醇(triamcinolone alcohol)、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、醋酸氟轻松、氟轻松、哈西奈德、倍他米松、倍他米松磷酸钠、地塞米松、地塞米松磷酸钠、氟可龙、氢化可的松-17-丁酸酯、氢化可的松-17-戊酸酯、双丙酸阿氯米松、戊酸倍他米松、二丙酸倍他米松、泼尼卡酯、氯倍他松-17- 丁酸酯、氯倍他索-17-丙酸酯、己酸氟考龙、特戊酸氟考龙和醋酸氟甲叉龙；免疫选择性抗炎肽(ImSAIDs)诸如苯基丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸(FEG)及其D-同分异构形式(feG) (IMULANBioTherapeutics, LLC);抗风湿药诸如硫唑嘌呤、环孢素(环孢素A)、D-青霉胺、氯金化钠(gold salts)、羟基氯喹、来氟米特、甲氨蝶呤(MTX)、米诺环素、柳氮磺吡啶、环磷酰胺、肿瘤坏死因子a (TNFa)阻断剂诸如依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗 (Remicade)、阿达木单抗(Humira)、赛妥珠单抗(Cimzia)、戈利木单抗(Simponi)、白介素I(IL-1)阻断剂诸如阿那白滞素(Kineret)、抗B细胞单克隆抗体诸如利妥昔单抗(R丨TUXAN )、T细胞共同刺激阻断剂诸如阿巴西普(Orencia)、白介素6(IL-6)阻断剂诸如托珠单抗；激素拮抗剂诸如他莫昔芬、非那雄胺或者LHRH拮抗剂；放射性同位素(例如 At211、I131、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212 和 Lu 的放射性同位素)；其他试验药诸如硫代钼(Thioplatin)、PS-341、丁酸苯酯、ET-18_0CH3或者法尼基转移酶抑制剂(L-739749、L-744832);多酚类诸如槲皮素、白藜芦醇、白皮杉醇、表没食子儿茶素没食子酸酯、茶黄素、黄烷醇、原花青素、桦木酸及其衍生物；自噬抑制剂诸如氯喹；烷化剂诸如塞替派和环磷酰胺(CYTOXAN );焼基磺酸酯类诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙唳诸如硫丹、卡波醌、meturedopa和uredopa ;乙撑亚胺和甲基氨基卩丫唳,包括六甲密胺、三亚胺嗪、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫化磷酰胺和trimethylomelamine ;番蒸枝内酯(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮);S -9-四氢大麻酚(屈大麻酚、MARINOL ) ; β -拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成性类似物托泊替康(HYCAMTIN )、CPT-1K伊立替康、CAMPTOSAR )、乙酰基喜树碱、东莨菪亭和9-氨基喜树碱);苔藓抑素；callystatin ;CC_1065 (包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成性类似物);鬼臼毒素；鬼曰酸；替尼泊苷；cryptophycins (特别是cryptophycin I和cryptophycin8);多拉司他汀；du0carmycin (包括合成性类似物KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素；pancratistatin ；sarcodictyin ；spongistatin ;氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆留醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫斯汀和雷莫司汀；抗生素如烯二炔抗生素(例如刺孢霉素尤其是刺孢霉素Y II和刺孢霉素 ω Il (参见例如 Nicolaou et al. , Angew. Chem Intl. Ed. Engl. , 33:183-186 (1994))；⑶P323，口服α-4整联蛋白抑制剂；蒽环类抗生素，包括蒽环类抗生素A ;埃斯培拉霉素；以及新抑癌蛋白生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团、aclacinomysin、放线菌素、authramycin、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、去甲柔红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地拖比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括ADRIAMYCIN 、吗啉代_多柔比星、氰基吗啉代_多柔比星、2-吡咯啉子基-多柔比星、多柔比星盐酸盐脂质体注射剂(D0XIL )、脂质体多柔比星TLCD-99 (MY0CET )、PEG化脂质体多柔比星(CAELYX )和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物诸如甲氨喋呤、吉西他滨(GEMZAR )、替加氟(UFTORAL )、卡培他滨(XEL0DA )、埃坡霉素和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物诸如二甲叶酸、甲氨喋呤、喋罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮鸟苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、伊诺他滨、氟尿苷；雄激素诸如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿喃唳；安吖唳；bestrabucil ;比生群；伊达曲杀；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine ;依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；轻基脲；香燕多糖；氯尼达明；美登醇诸如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；m0pidanm0l ;根瘤菌剂；喷司他丁 ；蛋氨氮芥；吡柔 比星；洛索蒽醌；2_乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK. 多糖复合物(JHSNatural Products, Eugene, OR);雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；单端孢菌毒素(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和anguidine);乌拉坦；长春地辛(ELDISINE TILDESIN );达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烧；gacytosine ;阿糖胞苷(〃Ara_C〃)；塞替派；紫杉烷例如紫杉醇(TAXOL )、紫杉醇的白蛋白工程化纳米微粒制剂(ABRAXANE )和多西他赛(TAXOTERE )； chloranbucil ;6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；钼制剂诸如顺钼、奥沙利钼(例如ELOXATIN )和卡钼；长春药属，其防止微管蛋白聚合以形成微管，包括长春碱(VELBAN )、长春新^(0!^(0￥取 )、长春地辛(ELDISINE JILDESINig)和长春瑞滨(NAVELBINE );依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺；米托蒽醌；亚叶酸；诺安托；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000 ;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类视黄醇诸如芬维A胺、视黄酸包括贝沙罗汀(TARGRET1N ):. '.膦酸盐诸如氯膦酸盐(例如BONEFOS 或者OSTAC )、依替膦酸乩(DIDROCAL· )、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(ZOMETA )、阿伦膦酸盐(FOSAMAX )、帕米膦酸盐(AREDIA )、替鲁膦酸(SKELID 域者利塞膦酸盐(ACTONEL );曲沙他滨(1，3- 二氧戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常细胞增殖的信号转导途径中的基因表达的那些，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R);疫苗诸如THERATOPE 疫苗和基因治疗疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；拓扑异构酶I抑制剂(例如LURTOTECAN ) ；rmRH (例如ABARELIX ) ；BAY439006 (索拉非尼；Bayer) ;SU_11248(舒尼替尼、SUTENT 、Pfizer);哌立福辛、C0X-2抑制剂(例如塞来考昔或者艾托考昔)、蛋白体抑制剂(例如PS341);硼替佐米(VELCADE );CC1-779 ;替吡法尼(tipifarnib) (R11577) ；orafenib,ABT510 ;Bcl_2 抑制剂诸如 oblimersen sodium(GENASENSE )；pixantrone ;EGFR抑制剂(参见如下定义)；法尼基转移酶抑制剂诸如洛那法尼(SCH 6636.SARASAR );以及上述药物的药用盐、酸或者衍生物；以及上述药物中的两种或者多种的组合，诸如CHOP，其为环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的组合治疗的缩写；和F0LF0X，其为使用奥沙利钼(ELOXATIN )与5-FU和亚叶酸的组合治疗方案的缩写。如本申请所定义的额外的化学治疗剂包括用于调节、降低、阻断或者抑制可促进癌症生长的激素作用的“抗激素药物”或者“内分泌治疗剂”。它们本身可为激素，包括但不限于具有混合的激动剂/拮抗剂分布的抗雌激素药物，包括他莫昔芬(nolvadex )、
4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(FARESTON )、艾多昔芬、屈洛昔芬、雷洛昔芬(EVISTA )、曲沃昔芬、雷洛西芬，以及选择性雌激素受体调节剂(SERM)诸如SERM3 ;不具有激动剂性质的纯的抗雌激素药物，诸如氟维司群(FASLODEX )和ΕΜ800(所述药物可阻断雌激素受体(ER) 二聚化、抑制DNA结合、增加ER翻转和/或者抑制ER水平);芳香酶抑制剂，包括甾体芳香酶抑制剂诸如福美坦和依西美坦(AROMASIN )，以及非类固醇类芳香酶抑制齐 诸如阿那曲挫(ARIMTOEX )、来曲唑(FEMARA )和氨鲁米特，以及其它芳香酶抑制齐抱括伏氯唑(RIVISOR ) 、醋酸甲地孕酮(MEGASE )、法倔唑和4(5)-咪唑；黄体生成激素释放激素激动剂(lutenizing hormone-releaseing hormone agonists),包括醋酸亮丙瑞林(1^〒1^01\[email protected]和[丄1(^4110武0、戈舍瑞林、布舍瑞林和tripterelin ;性甾体，包括黄体激素诸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮、雌激素诸如二乙基己烯雌酚和倍美力，以及雄激素/类视黄醇诸如氟甲睾酮、全反式维甲酸和芬维A胺；奥那司酮；抗黄体酮药物；雌激素受体下调剂(ERDs);抗雄激素药物诸如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺。另外的化学治疗剂包括治疗抗体诸如阿仑单抗(Campath)、贝伐单抗(AVASTIN 、Genentech);西妥昔单抗(ERBITUX 、Imclone);帕木单抗(VECTIBIX 、Amgen)、利妥昔单抗(RITUXAN 、Genentech/Biogen Idee)、培妥珠单抗(OMNITARG 、2C4、Genentech)、曲妥单抗(HERCEPTIN 、Genentech)、托西莫单抗(Bexxar、Corixia),以及抗体药物轭合物奥吉妥珠单抗(MYLOTARG 、Wyeth)。具有作为药物的治疗潜力而与本发明化合物联用的人源化单克隆抗体包括阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、atlizumab、bapineuzumab、莫 t匕伐珠单抗(bivatuzumabmertansine)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、西利珠单抗(cedelizumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、cidfusituzumab、cidtuzumab、达克珠单抗(daclizumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、泛维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、奥吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)、奥英妥珠单抗(inotuzumabozogamicin)、ipilimumab、拉贝珠单抗(Iabetuzumab)、林妥珠单抗(Iintuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊珠单抗(mepolizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、motovizumab、那他珠单抗(natalizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、nolovizumab、numavizumab、ocrelizumab、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、pecfusituzumab、pectuzumab、培妥珠单抗(pertuzumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、ralivizumab、雷珠单抗(ranibizumab)、reslivizumab、瑞利珠单抗(reslizumab)、resyvizumab、罗维珠单抗(rovel izumab)、卢利珠单抗(rup I izumab) >西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、他珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)、tadocizumab、他利珠单抗(talizumab)、特非珠单抗(tefibazumab)、托珠单抗(tocilizumab)、托利珠单抗(toralizumab)、tucotuzumab西莫白介素(tucotuzumab celmoleukin)、tucusituzumab、umavizumab、乌珠单抗(urtoxazumab)、伏特克单抗(ustekinumab)、维西珠单抗(vi si I izumab);以及抗白介素-12 (ABT-874/J695, Wyeth Research and Abbott Laboratories),其为通常基因修饰为识别白介素_12p40蛋白的重组体专属人类序列、全长IgG1 λ抗体。化学治疗剂也包括“EGFR抑制剂”，其是指与EGFR结合或者直接相互作用且阻止或者降低其信号转导活性的化合物，其可选择地称为“EGFR拮抗剂”。所述药物的实例包括与EGFR结合的抗体和小分子。与EGFR结合的抗体的实例包括MAb579 (ATCC CRL HB 8506)、MAb 455 (ATCC CRLHB8507)、MAb 225 (ATCC CRL 8508)、MAb528 (ATCC CRL 8509)(参见美国专利 4，943，533，Mendelsohn et al.)及其变化形式，诸如嵌合225(C225或者西妥昔单抗；ERBUTIX )和重塑的人类225 (H225)(参见WO96/40210, Imclone Systems Inc.) ；IMC-11F8, 一种完全人类、EGFR-革巴向抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利5，212，290);美国专利5，891，996所述的结合EGFR的人源化且嵌合抗体；以及结合EGFR的人类抗体，诸如ABX-EGF或者帕木单抗(参见 W098/50433, Abgenix/Amgen) ；EMD 55900 (Stragliotto et al. Eur. J. Cancer32A:636-640 (1996)) ；EMD7200 (马妥珠单抗)，一种直接对抗EGFR的人源化EGFR抗体，其与 EGF 和 TGF- α 竞 争结合 EGFR (EMD/Merck)；人类 EGFR 抗体 HuMax-EGFR (GenMab)；完全人类抗体，已知为 EL1、E2. 4、E2. 5、E6. 2、E6. 4、E2. 11、E6. 3 和 E7. 6. 3 且在 US6，235，883 中有述；MDX-447 (Medarex Inc);以及 mAb 806 或者人源化 mAb 806 (Johnset al.，J. Biol. Chem. 279(29) :30375-30384(2004))。所述抗-EGFR 抗体可与细胞毒素剂轭合，由此生成免疫交联物(参见例如EP659，439A2, Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子诸如在以下美国专利中所述的化合物5, 616，582,5, 457，105,5, 475，001、5，654，307,5, 679，683,6, 084，095,6, 265，410,6, 455，534,6, 521，620,6, 596，726、6，713，484,5,770，599,6, 140，332,5,866，572,6,399，602,6,344，459,6,602，863、6，391，874,6, 344，455,5, 760，041,6, 002，008 和 5，747，498，以及在以下 PCT 公开中所述的化合物W098/14451、W098/50038、W099/09016 和 W099/24037。具体的小分子 EGFR 拮抗剂包括 0S1-774(CP-358774，厄洛替尼，TARCEVA Genentech/OSIPharmaceuticals) ；PD 183805 (Cl 1033，N_[4_[ (3-氯-4-氟苯基)氨基]_7-[3-(4_ 吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-2-丙烯酰胺二盐酸盐，Pfizer Inc.) ；ZD1839,吉非替尼(IRESSA )4-(3’ -氯-4’ -氟苯胺基)_7_甲氧基_6_ (3-吗啉代丙氧基)喹唑琳，AstraZeneca) ；ZM 105180 ((6_ 氛基 _4_ (3_ 甲基苯基-氛基)-喧唑琳，Zeneca)；BIBX-1382 (N8- (3-氯-4-氟-苯基)-N2- (1-甲基-哌啶 _4_ 基)-嘧啶并[5，4_d]嘧P定-2, 8_二胺,Boehringer Ingelheim) ;PKI_166 ((R) -4_[4_[ (1-苯基乙基)氛基]-1H-批咯并[2，3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶)；(^-387785 0-[4-[(3-溴苯基)氨基]_6_喹唑啉基]-2-丁烯酰胺)；EKB-569 (N- [4- [ (3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]_4_ ( 二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth) ;AG1478 (Pfizer) ；AG1571 (SU5271 ；Pfizer);双重EGFR/HER2 酪氨酸激酶抑制剂诸如拉帕替尼(TY KERB ，GSK572016或者N- [3-氯-4- [ (3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6 [5-[[[2-甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]喹唑啉-4-胺)。化学治疗剂也包括“酪氨酸激酶抑制剂”，其包括在先前段落中有述的EGFR-靶向药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂诸如由Takeda得到的TAK165 ；CP-724, 714，一种ErbB2受体酪氨酸激酶的口服选择性抑制剂(Pfizer and OSI);双重-HER抑制剂诸如EKB-569 (由Wyeth得到)，其优先结合EGFR但同时抑制HER2和EGFR-过表达细胞；拉帕替尼(GSK572016 ；由Glaxo-SmithKline得到)，一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PK1-166(由 Novarti s 得到);全-HER 抑制剂诸如卡奈替尼(C1-1033 ；Pharmacia)；Raf-1抑制剂诸如由ISIS Pharmaceuticals得到的反义药物ISIS-5132，其抑制Raf-1信号转导；非-HER靶向TK抑制剂，诸如甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC ，由Glaxo SmithKline得到)；多重靶向的酪氨酸激酶抑制剂，诸如舒尼替尼(SUTENT ，由Pfizer得到)；VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，诸如瓦他拉尼(vatalanib) (PTK787/ZK222584,由Novartis/ScheringAG得到)；MAPK细胞外调节激酶I抑制剂CI_1040(由Pharmacia得到);喹唑啉，诸如H) 153035, 4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶；嘧啶并嘧啶；吡咯并嘧啶，诸如CGP 59326、CGP 60261和CGP 62706 ;吡唑并嘧啶，4_(苯基氨基)_7H_吡咯并[2, 3-d]嘧啶；姜黄(二阿魏酰甲烷，4，5-二(4-氟苯胺基)酞酰亚胺)；含有硝基噻吩部分的酪氨酸憐酸化抑制剂(tyrphostines) ；PD~0183805 (Warner-Lamber);反义分子(例如与HER-编码核酸结合的分子)；喹噁啉(美国专利5，804，396) ;tryphoStin(美国专利5,804,396) ；ZD6474(AstraZeneca) ；PTK-787(Novartis/Schering AG);全-HER(pan-HER)抑制剂，诸如 C1-1033 (Pfizer) ；Aff initac (ISIS 3521 ；Isis/Lilly);甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC ) ；PKI 166(Novartis) ；GW2016 (Glaxo SmithKline) ;CI_1033(Pfizer)；EKB-569 (Wyeth) ；Semaxinib(Pfizer) ；ZD6474 (AstraZeneca) ；PTK-787 (Novartis/Schering AG) ;INC_1C11 (Imclone)、雷帕霉素(西罗莫司，RAPAM U NE );或者如在以下专利公开中任一项中所述的药物美国专利5，804，396 ；W0 1999/09016 (AmericanCyanamid) ；W0 1998/43960 (AmericanCyanamid) ；W0 1997/38983 (WarnerLambert) ；W0 1999/06378 (WarnerLambert) ；W0 1999/06396 (Warner Lambert) ；W01996/30347(Pfizer, Inc) ；W0 1996/33978(Zeneca) ；W0 1996/3397(Zeneca)和 WO1996/33980(Zeneca)。此外，化学治疗剂包括本申请所述的任意的化学治疗剂的药用盐、酸或者衍生物，以及它们的两种或者多种的组合。
“环烷基”是指非芳族、饱和或者部分不饱和的烃基环基，其中所述环烷基可任选独立地取代有一个或者多个本申请所述的取代基。在一个实例中，所述环烷基含有3至12个碳原子(C3-C12)15在其它实例中，所述环烷基为C3-C8、C3-Cltl或者C5-Ciciij在其它实例中，所述环烷基作为单环可为C3-C8、C3-C6或者C5-C6。在其它实例中，所述环烷基作为二环可为C7-C12。在其它实例中，所述环烷基作为螺环系统可为C5-C12。单环环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基和环十二烷基。具有7至12个环原子的二环环烷基的示例性排列包括但不限于[4,4]、[4,5]、[5,5]、[5,6]或者[6,6]环系。示例性桥环二环环烧基包括但不限于二环[2. 2.1]庚烷、二环[2. 2. 2]辛烷和二环[3. 2. 2]壬烷。螺环烷基的实例包括螺[2. 2]戊烷、螺[2. 3]己烷、螺[2. 4]庚烷、螺[2. 5]辛烷和螺[4. 5]癸烷。本申请使用的“羧基保护基”是指对于在分子其它位置上进行的随后反应条件稳定的基团，其可在适当时移去而不破坏分子的剩余部分，得到未经保护的羧基。羧基保护基的实例包括酯基和杂环基。羧酸基团的酯衍生基团可用于在反应在化合物的其它官能团上进行的同时阻断或者保护羧酸基团。所述酯基的实例包括经取代的芳基烷基酯，包括经取代的节基诸如4-硝基节基、4-甲氧基节基、3，4- 二甲氧基节基、2，4- 二甲氧基苄基、2，4，6-三甲氧基苄基、2，4，6-三甲基苄基、五甲基苄基、3，4-亚甲二氧基苄基、二苯甲基、4，4’ - 二甲氧基二苯甲基、2，2’，4，4’ -四甲氧基二苯甲基酯；烷基酯或者经取代的烧基酷，诸如甲基、乙基、叔丁基、稀丙基或者叔戍基、二苯基甲基(二苯甲基)、4_甲氧基三苯甲基、4，4’ - 二甲氧基三苯甲基、4，4’，4”_三甲氧基三苯甲基、2-苯基丙-2-基酯；硫酷诸如叔丁基硫酷，甲娃烧基酷诸如二甲基甲娃烧基酷、叔丁基~■甲基甲娃烧基酷、苯甲酰甲基、2，2，2-三氯乙基、β_(三甲基甲硅烷基)乙基、β_(二(正丁基)甲基甲硅烷基)乙基、对甲苯磺酰基乙基、4-硝基苄基磺酰基乙基、烯丙基、桂皮酰基、1-(三甲基甲硅烷基甲基)丙-1-烯-3-基等。羧基保护基的其它实例为杂环基，诸如1，3-噁唑啉基。这些基团的其它实例出现在 Τ. W. Greene and P. G. M. ffuts, “Protective Groups inOrganicSynthesis，，，2nd ed. , John Wiley & Sons, Inc. , New York, N. Y. , 1991, chapter5 ；E. Has I am, “Protective Groups in Organic Chemistry，，, J. G. ff. McOmi e, Ed. , PlenumPress, New York, N. Y . , 1973, Chapter 5, and T. ff. Greene, iiProtectiveGroups in OrganicSynthesis”，John Wiley and Sons, New York, NY, 1981, Chapter 5 中。术语“经保护的羧基”是指取代有上述羧基保护基中的一个的羧基。本申请使用的“羟基保护基”是指通常在反应在化合物的其它官能团上进行的同时用于阻断或者保护羟基的羟基的衍生基团。所述保护基的实例包括四氢吡喃基氧基、苯甲酰基、乙酰氧基、氨甲酰基氧基、苄基和甲硅烷基醚(例如TBS、TBDPS)。这些基团的其它实例出现在 T. W. Greene and P. G. M. ffuts, “Protective Groups in OrganicSynthesis”，2nd ed. , John Wiley & Sons, Inc. , New York, NY, 1991, chapters 2-3 ；E. Haslam, “Protective Groups in OrganicChemistry, J. G. ff. McOmie, Ed. , PlenumPress, New York, NY,1973, Chapter5, and T. ff. Greene, “Protective Groups in OrganicSynthesis”，John Wiley andSons, New York, NY, 1981 中。术语“经保护的轻基”是指取代有上述羟基保护基中的一个的羟基。
“杂环基团”、“杂环的”、“杂环(heterocycle) ”、“杂环基”或者“杂环(heterocyclo) ”在单独使用以及用作复合基团诸如杂环烧基的部分使用时，可交替使用且是指具有3至20个环原子的任何的单环、二环、三环或者螺环的、饱和或者不饱和的芳族(杂芳基)或者非芳族环系，其中所述环原子为碳，且环或者环系中的至少一个原子为选自氮、硫或者氧的杂原子。在一个实例中，杂环基包含I至4个杂原子。在其它实例中，杂环基包括具有选自氮、硫或者氧的一个或者多个杂原子的3-至7-元单环。在其它实例中，杂环基包括具有选自氮、硫或者氧的一个或者多个杂原子的4-至6-元单环。在其它实例中，杂环基包括3-元单环。在其它实例中，杂环基包括4-元单环。在其它实例中，杂环基包括5-6-元单环。杂环基包含O至3个双键，任何氮或者硫杂原子可任选被氧化(例如NO、SO、SO2)，且任何氮杂原子可任选被季铵化(例如[NR4]+Cr、[NH4]+OF)。杂环基的实例为环氧乙烷基、氮杂环丙烷基、硫杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、I, 2- 二硫杂环戊基、I, 3- 二硫杂环戊基、吡咯烷基、二氢-1H-吡咯基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、二氢噻吩基、四氢噻吩基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫吗啉基、1，1-二氧代-硫吗啉基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、六氢嘧啶基、噁嗪烷基(oxazinanyl)、噻嗪烷基(thiazinanyl)、硫杂氧杂环己基、闻喊嚷基、闻喊淀基、氣杂环庚烧基、氧杂环庚烧基、硫杂环庚烷基、氧氮杂草基、氧氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、1，4-二氮杂环庚烷基、二氮杂罩基、硫氮杂罩基、硫氮杂环庚烷基、四氢噻喃基、1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二氧杂环己基、1，3- 二氧杂环戊基、吡唑啉基、吡唑烷基、二硫杂环己基、二硫杂环戊基、嘧啶酮基、吡唑烷基、咪唑啉基、3-氮杂二环[3.1.0]己基、3，6-二氮杂二环[3.1.1]庚基、6-氮杂二环[3.1.1]庚基、3-氮杂二环[3.1.1]庚基、
3-氮杂二环[4.1. 0]庚基、氮杂二环[2. 2. 2]己基、2-氮杂二环[3. 2.1]辛基、8-氮杂二环[3. 2.1]辛基、2-氮杂二环[2. 2. 2]辛基和8-氮杂二环[2. 2. 2]辛基。含有硫或者氧原子以及一至三个氮原子的5-元杂环的实例为噻唑基包括噻唑-2-基和N-氧化噻唑-2-基，噻二唑基包括1，3，4-噻二唑-5-基和1，2，4-噻二唑-5-基，噁唑基例如噁唑-2-基和噁二唑基，诸如1，3，4-噁二唑-5-基和1，2，4-噁二唑-5-基。含有2至4个氮原子的5-元杂环的实例包括咪唑基，诸如咪唑-2-基；三唑基，诸如1，3，4-三唑-5-基；1，2，3-三唑-5-基、1，2，4-三唑-5-基，以及四唑基，诸如IH-四唑-5-基。苯并稠合5-元杂环的实例为苯并噁唑-2-基、苯并噻唑-2-基和苯并咪唑-2-基。含有一至三个氮原子以及任选硫或者氧原子的6-元杂环的实例为例如吡啶基，诸如吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基；嘧啶基，诸如嘧啶-2-基和嘧啶-4-基；三嗪基，诸如1，3，4-三嗪-2-基和1，3，5-三嗪-4-基；哒嗪基，特别是哒嗪-3-基和吡嗪基。N-氧化吡啶基和N-氧化哒嗪基以及吡啶基、嘧啶-2-基、嘧啶-4-基、哒嗪基和1，3，4-三嗪-2-基为其它杂环基的实例。“任选取代的杂环”的取代基包括轻基、烧基、烧氧基、酸基、齒素、疏基、氧代、竣基、酸基、齒素取代的烧基、氣基、氛基、硝基、脉基、狐基。单独使用以及用作复合基团诸如杂芳烷基的部分时的“杂芳基”是指任何单环、二环或者三环环系，其中至少一个环为含有I至4个选自氮、氧和硫的杂原子的5-或者6-元芳环,且在示例性实施方案中，至少一个杂原子为氮。参见例如Lang’ s Handbook ofChemistry,同上。定义中包括任何二环基团，其中上述杂芳基环中的任一个与芳环稠合。在一个实施方案中，杂芳基包括4-6元单环芳族基团，其中一个或者多个环原子为氮、硫或者氧。在其它实施方案中，杂芳基包括5-6元单环芳族基团，其中一个或者多个环原子为氮、硫或者氧。杂芳基(无论是经取代的还是未经取代的)的实例包括噻吩基、呋喃基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、噻二唑基、噁二唑基、四唑基、噻三唑基、噁三唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、噻嗪基、噁嗪基、三嗪基、噻二嗪基、噁二嗪基、二噻嗪基、二噁嗪基、氧杂噻嗪基、四嗪基、噻三嗪基、噁三嗪基、二噻二嗪基、咪唑啉基、二氢嘧啶基、四氢嘧啶基、四唑并[l，5-b]哒嗪基和嘌呤基，以及苯并稠合衍生基团例如苯并噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、苯并咪唑基和吲哚基。“杂芳基”的其它实例为1，3_噻唑-2-基、4-(羧基甲基)-5-甲基-1,3-噻唑-2-基、
4-(羧基甲基)-5-甲基-1，3-噻唑-2-基钠盐、1，2，4-噻二唑-5-基、3-甲基_1，2，4_噻二唑-5-基、I, 3，4-三唑-5-基、2-甲基-1，3，4-三唑-5-基、2-羟基-1，3，4-三唑-5-基、2-羧基-4-甲基-1，3，4-三唑-5-基钠盐、2-羧基-4-甲基-1，3，4-三唑-5-基、I, 3-噁唑-2-基、1，3，4-噁二唑-5-基、2-甲基-1，3，4-噁二唑-5-基、2_ (羟基甲基)-1,3,4-噁二唑-5-基、I, 2，4-噁二唑-5-基、I, 3，4-噻二唑-5-基、2-巯基-1，3，4-噻二唑-5-基、2-(甲基硫基)_1，3，4-噻二唑-5-基、2-氨基-1，3，4-噻二唑-5-基、IH-四唑-5-基、1-甲基-1H-四唑-5-基、1-(1-( 二甲基氨基)乙-2-基)-1Η-四唑-5-基、1-(羧基甲基)-1H-四唑-5-基、1-(羧基甲基)-1H-四唑-5-基钠盐、1-(甲基磺酸)-1H-四唑-5-基、1-(甲基磺酸)-1H-四唑-5-基钠盐、2-甲基-1H-四唑-5-基、1，2，3-三唑-5-基、1-甲基-1，2，3-三唑-5-基、2-甲基-1，2，3-三唑-5-基、4-甲基-1，2，3-三唑-5-基、N-氧化吡啶-2-基、6-甲氧基-2- (N-氧化)-哒嗪-3-基、6-羟基哒嗪-3-基、1-甲基吡啶_2_基、1-甲基吡啶-4-基、2-羟基嘧啶-4-基、1，4，5,6-四氢_5，6-二氧代-4-甲基-1，2，4-三嗪-3-基、1，4，5，6-四氢-4-(甲酰基甲基)_5，6- 二氧代-1，2，4-三嗪-3-基、2，5- 二氢-5-氧代-6-羟基-1，2，4-三嗪-3-基、2，5- 二氢-5-氧代-6-羟基-1，2，4-三嗪-3-基钠盐、2，5- 二氢-5-氧代-6-羟基-2-甲基-1，2，4-三嗪-3-基钠盐、2，5- 二氢-5-氧代-6-羟基-2-甲基-1，2，4-三嗪-3-基、2，5-二氢-5-氧代-6-甲氧基_2_甲基_1，2，4-三嗪-3-基、2，5- 二氢-5-氧代-1，2，4-三嗪-3-基、2，5- 二氢-5-氧代-2-甲基-1，2，4-三嗪-3-基、2，5- 二氢-5-氧代-2，6- 二甲基-1，2，4-三嗪_3_基、四唑并[I，5_b]哒嗪-6-基和8-氨基四唑并[1，5-b]_ 哒嗪-6-基。杂芳基任选如针对杂环所述的被取代。在具体的实施方案中，杂环基在杂环基的碳原子处连接。作为实例，碳键合的杂环基包含以下的键合排列(bonding arrangement):卩比唳环的2、3、4、5或者6位，咕嗪的3、4、5或者6位,喃唳环的2、4、5或者6位,批嗪环的2、3、5或者6位,呋喃环、四氢呋喃环、硫代呋喃环、噻吩环、吡咯环或者四氢吡咯环的2、3、4或者5位，噁唑环、咪唑环或者噻唑环的2、4或者5位,异B,惡唑环、批唑环或者异噻唑环的3、4或者5位,氮杂环丙烧的2或者3位,氮杂环丁烷的2、3或者4位，喹啉环的2、3、4、5、6、7或者8位，或者异喹啉环的1、3、4、5、6、7或者8位。在某些实施方案中，杂环基为N连接的。作为实例，氮键合的杂环基或者杂芳基包括以下的键合排列氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑烷、3-咪唑烷、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、IH-吲唑的I位，异吲哚或者异二氢吲哚的2位，吗啉的4位，以及咔唑或者β -咔啉的9位。
除非另作说明，“任选取代的”是指基团可为未经取代的或者被针对该基团所列的一个或者多个(例如0、1、2、3或者4)取代基取代，其中所述取代基可为相同或者不同的。在一个实施方案中，任选取代的基团具有I个取代基。在其它实施方案中，任选取代的基团具有2个取代基。在其它实施方案中，任选取代的基团具有3个取代基。在某些实施方案中，二价基团为一般性描述，而无特殊键合构型，例如基团-CH2C(O) _。应该理解的是一般性描述是指包括两种键合构型，除非另作说明。例如，在基团R1-R2-R3中，如果基团R2描述为-CH2C(O)-,则应该理解的是该基团可如R1 - CH2C(O) - R3以及如R1 - C (O) CH2 - R3进行键合，除非另作说明。〃包装说明书(package insert) 〃是指通常包括在治疗产品的市售包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或告诫事项的信息，这些信息涉及上述治疗产品的使用。“药用盐”包括酸和碱加成盐。“药用酸加成盐”是指保留游离碱的生物学有效性和性质且在生物学或者在其它方面不属于不期望的那些盐，其用无机酸以及有机酸形成，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、碳酸、磷酸，且所述有机酸可选择脂族、环脂族、芳族、芳脂族、杂环、羧酸以及磺酸类有机酸，诸如甲酸、乙酸、丙酸、羟乙酸、葡糖酸、乳酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、枸橼酸、天冬氨酸、抗坏血酸、谷氨酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、双羟萘酸、苯基乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。“药用碱加成盐”由无机碱衍生的盐，诸如钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。特别地碱加成盐为铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。由药用有机无毒碱衍生的盐包括伯胺、仲胺和叔胺盐、经取代的胺盐包括天然存在的经取代的胺盐、环状胺盐以及碱性离子交换树脂盐，所述胺诸如异丙基胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙基胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、氨丁三醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺树脂等。特别地有机无毒碱为异丙基胺、二乙胺、乙醇胺、氨丁三醇、二环己基胺、胆碱和咖啡因。“无菌”制剂为经灭菌的或者不含所有存活的微生物和它们的孢子。〃立体异构体〃是指具有相同化学组成但它们原子或者基团的排列在空间上不同的化合物。立体异构体包括非对映异构体、对映异构体、构象异构体等。“手性”是指具有镜像配偶体(mirror image partner)不可重叠性质的分子,而术语〃非手性〃是指可与其镜像配偶体重叠的分子。〃非对映异构体〃是指具有两个或更多手性中心并且其分子不互为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，如熔点、沸点、光谱性质或生物活性。非对映异构体的混合物可通过高分辨分析操作诸如电泳和色谱诸如HPLC来分离。〃对映异构体〃是指互为不可重叠镜像的化合物的两种立体异构体。本申请使用的立体化学定义和常规通常按照S. P. Parker, Ed. , McGraw-Hi 11Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hi11 BookCompany, New York ； 以 及Eliel, E. and Wilen, S. , “Stereochemistry of OrganicCompounds，，，John Wiley &Sons, Inc.，New York, 1994。多种有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述有光学活性的化合物时，使用前缀D和L或者R和S来表示分子围绕其一个或多个手性中心的绝对构型。前缀d和I或者(+)和(-)用于指定平面偏振光由化合物引起的旋转的符号，其中(_)或I表示化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。对于给定的化学结构而言，除了这些立体异构体互为镜像外，这些立体异构体是相同的。具体的立体异构体也可称为对映异构体，所述异构体的混合物通常称作对映异构混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，当化学反应或方法中没有立体选择性或立体专一性时可出现这种情况。术语〃外消旋混合物〃和〃外消旋体"是指两种对映异构体物质的等摩尔混合物，其没有光学活性。术语〃互变异构体〃或〃互变异构形式〃是指可通过低能鱼(low energybarrier)互相转化的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(protontautomer)(也称为质子迁移互变异构体(prototropic tautomer))包括通过质子迁移进行的互相转化，如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价互变异构体(valence tautomer)包括通过一些成键电子的重组进行的互相转化。"溶剂化物"是指一种或多种溶剂分子与本发明化合物的结合或络合。形成溶剂化物的溶剂的实例包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMS0、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。术语"水合物"是指当溶剂分子是水时的络合物。“受试者”、“个体”或者“患者”为脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家畜(诸如牛)、运动动物、宠物(诸如猫、狗和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物为人类。“治疗有效量”表示(i)治疗或预防本申请描述的具体疾病、病症或障碍的本发明化合物的量，( )削弱、改善或消除本申请描述的具体疾病、病症或障碍的一种或多种症状的本发明化合物的量，或( iii)预防或延迟本申请描述的具体疾病、病症或障碍的一种或多种症状的发作的本发明化合物的量。在癌症的情况中，治疗有效量的药物可降低癌细胞的数量；减小肿瘤尺寸；抑制(即在一定程度上减慢以及优选停止)癌细胞浸润周围器官中；抑制(即在一定程度上减慢以及优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。如果药物可预防癌细胞的生长和/或杀死现存的癌细胞，其可能是细胞生长抑制性的(cytostatic)和/或细胞毒性的。对于癌症治疗而言，可例如通过评价疾病进展时间(TTP)和/或确定应答率(RR)来测量功效。“治疗”(以及变体诸如“治疗(treat) ”或者“治疗(treating) ” )是指尝试改变待治疗的个体或者细胞的自然过程的临床介入，且可用于预防或者在临床病理学过程中来进行。治疗的所需作用包括预防疾病发生或者复发、缓解症状、减小疾病的任何直接或者间接的病理学结果、稳定(即不恶化)疾病状况、预防病灶转移、减小疾病进展速率、改善或者缓和疾病状况、延长存活率(相比于如果不接受治疗所预期的存活率)以及缓和或者改善的预后。在某些实施方案中，本发明化合物用于延缓疾病或者病症的发展或者减缓疾病或者病症的进程。需要治疗的个体包括已经具有病症或者障碍的个体以及倾向于具有病症或者障碍的个体(例如通过遗传突变)或者其中病症或者障碍待预防的个体。“F0X03a”是指叉头 / 翼状螺旋盒类 O 蛋白(forkhead/winged helix boxclass Oprotein)，其为PI3K/AKT激酶信号转导途径的下游靶标。活化的AKT激酶通过磷酸化直接调控F0X03a活性，这导致其易位至细胞质，在此其被14-3-3侣伴蛋白隔离。PI3K/AKT激酶的抑制导致F0X03a的脱磷酸化以及细胞核定位，这导致其活化。F0X03a的细胞核定位使得其用作转录因子以通过其关键靶标基因诸如p27Kipl和Bim的上调来诱导细胞周期停滞和
/或者细胞凋亡。“定位分布〃是指给定分子在一个位点的量相比于其在第二位点的量。在一个实例中，F0X03a定位分布是指F0X03a在细胞核中的量相比于其在细胞质中的量。所述定位分布可用比例(例如F0X03a在细胞核中的量除以F0X03a在细胞质中的量)或者减法(例如F0X03a在细胞核中的量减去F0X03a在细胞质中的量)的方式来表示。“细胞核定位分布”是指确定为在细胞核中F0X03a水平基本高于在细胞质中的F0X03a水平的定位分布。在一个实例中，与在细胞质中相比，细胞核定位分布在细胞核中具有大于约50%F0X03a。在其它实例中，与在细胞质中相比，细胞核定位分布在细胞核中具有大于约70%、可选择地大于约80%、可选择地大于约90%F0X03a。“细胞质定位分布”是指确定为在细胞质中F0X03a水平基本高于在细胞核中的F0X03a水平的定位分布。在一个实例中，与在细胞核中相比，细胞核定位分布在细胞质中具有大于约50%F0X03a。在其它实例中，与在细胞核中相比，细胞核定位分布在细胞质中具有大于约70%、可选择地大于约80%、可选择地大于约90%F0X03a。“ρΑΚΤ分布”是指在给定样品中AKT的活化或者磷酸化(“ρΑΚΤ” )的水平相比于非活化或者非磷酸化的AKT水平。在一个实例中，所述样品为肿瘤细胞。ρΑΚΤ分布可用比例(例如ρΑΚΤ在肿瘤细胞中的量除以非磷酸化的AKT在相同类型的细胞或者在非肿瘤细胞中的量)或者减法(例如PAKT在肿瘤细胞中的量减去非磷酸化的AKT在相同类型的细胞或者在非肿瘤细胞中的量)的方式来表示。ρΑΚΤ分布也可以如下方式来表示通过测量AKT的磷酸化下游靶标(例如pGSK或者PRAS40)的量获得的活化途径的水平。“高ρΑΚΤ分布”是指全部AKT在样品中的活化或者磷酸化水平高于基线值。在一个实例中，所述基线值为针对给定细胞类型的ρΑΚΤ的基本水平。在其它实例中，所述基线值为在给定样品细胞群体中的ρΑΚΤ的平均值或者平均水平。在其它实例中，“高ρΑΚΤ分布”是指当相比于来自相同哺乳动物或者患者群体的相同类型的平均正常的、健康的(例如非肿瘤)细胞而言，过表达或者在细胞中具有增多的磷酸化或者活化的AKT的肿瘤细胞。所述ρΑΚΤ分布也可用于与其它标记(例如F0X03a定 位分布)结合以预测某些PI3k/AKT激酶途径抑制剂的效能。除非另有说明，术语〃本发明化合物(compound of this invention) 〃和〃该发明化合物(compounds of the present invention)"包括式1-VII的化合物及其立体异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物、盐(例如药用盐)和前药。除非另有说明，本申请所述的结构也意在包括不同之处仅在于存在一个或者多个同位素富集原子的化合物。例如，本发明的范围内也包括式1-VII的化合物,其中一个或者多个氢原子被氣或者氣所取代,或者一个或者多个碳原子被13C-或者14C-富集的碳取代。定位测定方法本发明产生于以下发现F0X03a定位可用作用于在治疗癌症患者中预测PI3K/AKT激酶途径抑制剂的效能的诊断标记。此外，本发明产生于以下发现F0X03a定位可用作药效学生物标记。除了其它方面之外，作为药效学生物标记的F0X03a定位用于测量PI3K/AKT激酶途径抑制剂对患者肿瘤的治疗效果、指导患者的剂量选择包括鉴别抑制剂的最大耐受剂量以及可将PI3K/AKT激酶途径抑制剂活性的大小与临床结果相关联，包括基于定位测定结果的药物剂量的个体化选择。F0X03a可用作单一标记，用于针对使用PI3K/AKT激酶途径抑制剂治疗的患者进行选择或者分级。可选择地，F0X03a也可与其它标记(例如PTEN)联用，用于针对使用PI3K/AKT激酶途径抑制剂治疗的患者进行选择或者分级。标记(其中F0X03a定位分布可用于选择或者分级患者，或者用于确定肿瘤细胞生长对PI3K/AKT激酶途径抑制剂的敏感性)的实例包括但不限于PTEN状态、PI3k和AKT突变的存在以及AKT、PI3k或者HER2的表达或者活性的水平。一个方面包括针对使用PI3K/AKT途径抑制剂的癌症治疗来分级患者的方法，其中具有对PI3K/AKT途径抑制剂的敏感性的患者包括在使用PI3K/AKT途径抑制剂治疗的患者中。一个方面包括预测肿瘤细胞生长对由PI3K/AKT激酶途径抑制剂产生的抑制的敏感性的方法。所述方法包括确定F0X03a在肿瘤细胞中的定位分布，其中F0X03a的细胞质定位分布与对由PI3K/AKT激酶抑制剂产生的抑制的敏感性相关。在另外的方面，F0X03a在肿瘤细胞中的细胞核定位分布与对由PI3K/AKT激酶抑制剂产生的抑制的抗性相关。在另外的方面，所述方法也包括预测肿瘤细胞生长对由PI3K/AKT激酶途径抑制剂产生的抑制的敏感性。在另外的方面，所述方法包括提供肿瘤细胞的样品。在另外的方面， 所述方法包括确定肿瘤细胞是否是PTEN缺失的。在另外的方面，所述定位分布在确定所述肿瘤细胞是否是PTEN缺失的之后确定。PTEN缺失状态可通过本领域已知的任何适当方式来测量。在一个实例中，使用IHC。可选择地，可使用Western blot分析。对PTEN的抗体为可商购得到的(CellSignaling Technology, Beverly, MA, Cascade Biosciences, Winchester, MA)。 针对PTEN状态的IHC和Western blot分析的实例操作描述于Neshat, M. S. et al. Enhancedsensitivity of PTEN-deficient tumors toinhibition of FRAP/mTOR, Proc. NatlAcad. Sc1. USA 98, 10314 - 10319(2001)以及 Perren, A.，et. al.1mmunohistochemicalEvidence of Loss of PTENExpression in Primary Ductal Adenocarcinomas of theBreast, American Journalof Pathology, Vol. 155, No. 4, October 1999 中。确定PI3K突变的存在的方法在本领域中已知。例如，使用实时PCR针对在PIK3CA基因中特异性突变(外显子9和20以及H1047R或者H1047L突变)的检测的测定是已知的(购自 Qiagen, Valencia, CA)。测量AKT活化水平以及ρΑΚΤ在样品中的量的方法是本领域已知的。例如，可使用免疫沉淀测定诸如AKT活性测定试剂盒(购I'labcam' SanFrancisco, CA)。在其它实例中，可使用Western blot测定,诸如AKT WesternBlot测定试剂盒(购自Cell SignalingTechnology, Danvers, MA)。已知用于测量ρΑΚΤ水平的其它测定形式包括化学发光关联的免疫吸附测定，参见 Cicenas, J, et. al.，“Increased level of phosphorylated aktmeasured bychemiluminescence-1inked immunosorbent assay is a predictor ofpoor prognosisin primary breast cancer overexpressing ErbB-2,，，Breast Can.Res.，7(4)，R394，2005。可使用的其它测定为可获得的，例如获自AlphaScreen SureFireAkt I (p-Thr308)测定试剂盒(购自 Perkin Elmer, Waltham, MA) 在另外的方面，所述方法包括首先确定患者肿瘤细胞是否是PTEN缺失的、具有高ρΑΚΤ分布、过表达AKT或者具有PI3k突变。如果患者肿瘤是PTEN缺失的、具有高ρΑΚΤ分布、过表达AKT或者具有PI3k突变，则所述患者更可能响应于使用PI3K/AKT抑制剂的治疗。所述方法进一步包括确定F0X03a在肿瘤细胞(其为PTEN缺失的、具有高ρΑΚΤ分布、过表达AKT或者具有PI3k突变)中的定位分布，其中F0X03a的细胞质定位分布与对由PI3K/AKT激酶抑制剂产生的抑制的敏感性相关，且F0X03a在PTEN缺失的细胞中的细胞核定位分布与对由PI3K/AKT抑制剂产生的抑制的抗性相关。在一个实例中，所述肿瘤细胞为乳腺肿瘤细胞。在其它实例中，所述肿瘤细胞为前列腺肿瘤细胞。在其它实例中，所述肿瘤细胞为胰腺肿瘤细胞。在其它实例中，所述肿瘤细胞为卵巢肿瘤细胞。在其它实例中，所述肿瘤细胞为胃肿瘤细胞。在其它实例中，所述肿瘤细胞为去势难治性前列腺肿瘤(castrationresistant prostate tumor)细胞。在其它实例中，所述肿瘤细胞为头和颈肿瘤细胞。在其它实例中，所述肿瘤细胞为子宫内膜肿瘤细胞。在其它实例中，所述肿瘤细胞为间皮瘤肿瘤细胞。在另外的方面，所述方法包括首先确定患者肿瘤细胞是否是PTEN缺失的。如果患者肿瘤是PTEN缺失的，则患者更可能响应于使用PI3K/AKT抑制剂的治疗。所述方法进一步包括确定F0X03a在PTEN缺失的肿瘤细胞中的定位分布，其中F0X03a的细胞质定位分布与对由PI3K/AKT激酶抑制剂产生的抑制的敏感性相关，且F0X03a在PTEN缺失的细胞中的细胞核定位分布与对由PI3K/AKT抑制 剂产生的抑制的抗性相关。因此，携带具有细胞质定位分布的PTEN缺失的肿瘤细胞的患者可响应于治疗，且因此使用PI3K/AKT抑制剂治疗。然而，携带具有细胞核定位分布的PTEN缺失的肿瘤细胞的患者可能不响应于治疗，且不使用PI3K/AKT抑制剂治疗。因此另外的方面包括预测PTEN-缺失的肿瘤细胞对PI3K/AKT激酶途径抑制剂的敏感性的方法，包括确定F0X03a在PTEN-缺失的肿瘤细胞中的定位分布，其中F0X03a的细胞质定位分布与对由PI3K/AKT激酶抑制剂产生的抑制的敏感性相关。在一个方面，所述PI3K/AKT抑制剂为PI3k抑制剂。在一个实例中，所述PI3k抑制剂为2- (1H-吲唑-4-基)-6- (4-甲磺酰基-哌嗪-1-基甲基)-4-吗啉-4-基-噻吩并[3，2-d]嘧啶。在一个方面，所述PI3K/AKT抑制剂为AKT抑制剂。在一个实例中，所述AKT抑制剂为(S) -2- (4-氯苯基)-1-(4- ((5R, 7R) -7-羟基-5-甲基-6，7- 二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-(异丙基氨基)丙-1-酮。可采用确定F0X03a的相对定位的任何适当方法。在一个实施方案中，具体确定了F0X03a在样品中的细胞核和细胞质水平，且计算确定的细胞核与细胞质水平的比例("细胞核与细胞质比例〃)以确定相对定位。在Iv方面，确定了 F0X03a在患者样品或者患者群体样品中的相对定位。在另外的方面，F0X03a在患者样品中的相对定位与参考样品进行比较。参考样品可来自由已知患者或者表征的肿瘤样品或者细胞系确定的参数。所述参考可由试验进行确定或者可为来自已经存在的数据集的预先确定的数值。
在一个实例中，所述参考样品为具有已知性状的细胞群体(或者实体瘤样品)，所述性状例如对于给定PI3K/AKT途径抑制剂的已知敏感性，如由例如IC5tl、Ki或者EC5tl值所测量。在对于乳腺癌的具体实例中，所述参考样品为来自一种或者多种细胞系的细胞样品，所述细胞系包括 EVSAT、HCC70、T47D、BT474、CAL120、MB231、MB468、BT549、HCC38 和 HCC1937。
当在患者样品中的F0X03a确定为在细胞质隔室中的定位多于在细胞核隔室中的定位(单独或者相对于参考样品)时，所述PI3K/AKT途径为激活的，且针对PI3K/AKT途径抑制剂治疗选择患者。如果在组织样品中的F0X03a确定为在细胞核隔室中的定位多于在细胞质隔室中的定位(单独或者相对于参考样品)，则PI3K/AKT途径中断，且将患者排除在PI3K/AKT途径抑制剂治疗之外。F0X03a水平可通过本领域已知的任何适当方式来测量。患者组织样品由躯体获得且包括细胞和细胞外物质。组织样品可由人类或者非人类动物获得。组织样品可来自任何器官，包括所述器官的疾病状态、血液循环系统以及任何循环肿瘤细胞。组织样品诸如肿瘤活组织可使用已知操作获得，诸如针吸活组织检查(needle biopsy)(参见 Kim, C. H. et al. J. Virol. 66:3879-3882(1992))；Biswas, B. et al. Annals NY Acad. Sc1. 590:582-583 (1990)) ；Biswas, B. et al. J. Clin.Microbiol. 29:2228-2233 (1991)。所述组织以能够精确检测和定量F0X03a的方式进行处理。所述组织样品可以组织微点阵形式进行制备且切片或者可包括整体组织切片。切片典型地在载玻片上制备。例如，可制备石蜡包埋的福尔马林固定的样本，核心取自样本的分开的区域，每个核心排列在接受区，且切下切片并如前所述处理，例如，Konenen, J. et al. , Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling oftumorspecimens, (1987)Nat. Med. 4:844-7中所述。当由个体分析组织样品时，重要的是防止任何变化、生理学处理或者降解，特别是在组织或者细胞已经由受试者移除之后的蛋白表达。已知表达水平的变化在干扰(例如热休克或者用脂多糖(LPS)或者其它试剂的活化)后迅速改变。此外，组织和细胞中的RNA和蛋白可快速降解。因此，由受试者获得的组织在理论上立即被固定或者冷冻。组织样本也可包括异种移植物肿瘤样品，特别是来自药物剂量范围或者毒理学研究中的动物的样品。在本发明方法中可使用定量F0X03a定位的任何适当方法。在一个方面，免疫组织化学(IHC)用于确定F0X03a的定位分布。IHC是指基于免疫酶反应使用单克隆或者多克隆抗体以检测细胞或者特定蛋白诸如组织抗原的染色方法。典型地，针对定性或者定量分析，免疫组织化学操作涉及至少下述步骤中的几种1)抗原提取(例如通过压力蒸煮、蛋白酶处理、微波辐射、在适当缓冲剂中加热等)；2)初级抗体的应用和洗涤；3)与初级抗体结合的标记的次级抗体的应用(通常为进行步骤5)中的检测的第二抗体缀合物)并洗涤；4)可包括扩增步骤；5)检测试剂的应用(例如发色团、荧光标记分子或者具有实现测定所需的敏感性的水平的适当动态范围的任何分子)；6)可使用复染法以及7)使用使得蛋白存在可视(人眼或者自动分析系统可视)的检测系统的检测。用于检测F0X03a的各种免疫酶染色法是本领域中已知的。例如，可使用如下物质可视化免疫酶相互作用不同酶诸如过氧化物酶、碱性磷酸酶，或者不同色原诸如DAB、AEC或者Fast Red ;或者荧光标记诸如FITC、Cy3、Cy5、Cy7、Alexafluors等。复染剂可包括H&E、DAP1、Hoechst,只要所述染料与其它检测试剂相容并且使用可视化方案。如本领域所已知的，扩增试剂可用于强化染色信号。例如，可使用酪胺试剂。可使用对于本领域技术人员显而易见的任何适当方法或者系统来完成本发明的染色方法，包括自动、半自动或者手动系统。可使用本领域技术人员所了解的适当特异性抗体来分析F0X03a水平。可确定总体蛋白水平或者特异性磷酸化蛋白水平。可使用对于本领域技术人员显而易见的用于免疫组织化学分析的适当方法或者系统来完成本发明方法，包括自动系统、定量IHC、半定量IHC和手动方法。本申请使用的〃定量〃免疫组织化学是指这样的方法，其可自动扫描且评分IHC染色的组织以鉴别和定量特异性生物标记诸如抗原或者其它蛋白的存在。给予样品的评分可为样品的免疫组织化学染色的强度或者光密度(OD)的数字表示，且表示存在于样品中的靶标生物标记的量。所述定量测量可为相对的或者绝对的。例如，IHC测定中的对照样本可与针对相同对照样本获得的ELISA结果相关，由此产生用于确定组织样本中的F0X03a绝对浓度的标准曲线。所述评分可表示为染色强度或者OD/单位面积或者染色细胞百分数。本申请使用的半定量免疫组织化学是指例如由人眼获得的免疫组织化学结果的评分，其为受训操作者评级的数字化结果(例如0、1+、2+或者3+)。适于与免疫组织化学一起使用的各种自动化样品处理、扫描和分析系统在本领域中已知。所述系统可包括自动化染色和显微镜扫描、计算机图像分析、连续切片比较(针对定向变化以及样品尺寸与对照进行比较)、数字报表生成以及样品的归档和示踪(诸如组织切片置于其上的载玻片)。细胞显像系统为可商购得到，其将常规光束、荧光或者共聚焦显微镜与数字图像处理系统组合以进行细胞和组织包括免疫染色样品的定量分析。参见，例如CAS-200系统(Becton, Dickinson & Co.) ；BLISS andIHCscore of BacusLaboratories, Inc. (Lombard,111) ；ACIS of Clarient, Inc. (SanJuan Capistrano, Calif) ； iVision and GenoMx of BioGenex (San Ramon, Calif)；ScanScope ofAperio Technologies(Vista, Calif) ；Ariol SL-50 of Applied ImagingCorporation (San Jose, Calif) ；LSC Laser Scanning Cytometer of CompuCyteCorporation (Cambridge, Mass);以及AQUA of HistoRx Inc. (New Haven, Conn)。在某些方面中，使用AQUA 技术确定F0X03a在染色组织切片中的水平，这允许亚细胞隔室内的蛋白表达的定量测量，得到例如与每单位面积表达的分子数目直接成比例的数值(参见 Camp, R. L. , Chung, G. G. & Rimm, D. L. Automated subcellularlocalization and quantification of protein expression intissue microarrays. NatMed 8, 1323-7 (2002) ) 0亚细胞隔室可包括形态学定义的隔室或者分子学定义的隔室。亚细胞隔室可为细胞膜、细胞质、细胞核、溶酶体、ER、高尔基体等。可使用适当抗体分析F0X03a在细胞核和细胞质中的定位定量。F0X03a的抗体为可商购得至Ij (例如Milipore and Cell Signaling Technology)。其它抗体由Calbiocheill'S (Calbiochem General Catalog, 2006-2007)获得。针对适当抗体的其它商购资源在本领域中已知。在某些方面，通过细胞核在Cellomics平台上的易位算法确定F0X03a的定位定量。在其它方面，可通过F0X03a的AQUA 技术评分确定F0X03a的定位定量，例如通过使用AQUA 技术自动化病理学系统。AQUA 技术(对于自动化定量分析)为蛋白原位表达的绝对测量的分析方法。该方法能够测量蛋白在亚细胞隔室内的表达，这得到与每单位面积表达的分子数目直接成比例的数值。PI3K/AKT激酶抑制剂存在数百种激酶但并非所有激酶抑制剂也诱导F0X03a的易位。例如，MEK激酶抑制剂并未诱导F0X03a的易位。本申请描述了用于确定激酶抑制剂是否也诱导F0X03a的易位的测定。诱导F0X03a的易位的激酶抑制包括AKT (例如AKT-1、AKT-2和AKT-3)和PI3K (例如PI3K α )的抑制剂。所述AKT激酶抑制剂可为全-AKT抑制剂、变构AKT抑制剂或者AKT-1、ΑΚΤ-2或者ΑΚΤ-3的选择性抑制剂。所述ΡΙ3Κ抑制剂可为全-ΡΙ3Κ抑制剂或者可为ΡΙ3Κα、β、δ的选择性抑制剂或者它们的两种或者多种的组合。在一个实施方案中，所述AKT激酶抑制剂为式I的化合物及其互变异构体、拆分的
对映异构体、拆分的非对映异构体、溶剂化物和盐
权利要求
1.预测肿瘤细胞生长对由PI3K/AKT激酶途径抑制剂产生的抑制的敏感性的方法，包括确定F0X03a在肿瘤中的定位分布，其中F0X03a的细胞质定位分布与对由PI3K/AKT激酶抑制剂产生的抑制的敏感性相关。
2.权利要求1的方法，其中F0X03a的细胞核定位分布与对由PI3K/AKT激酶抑制剂产生的抑制的抗性相关。
3.权利要求1-2的方法，还包括预测所述肿瘤细胞生长对由PI3K/AKT激酶途径抑制剂产生的抑制的敏感性。
4.权利要求1-3的方法，还包括提供所述肿瘤细胞的样品。
5.权利要求1-4的方法，还包括确定所述肿瘤细胞是否是PTEN缺失的、具有高pAKT分布或者具有PI3k突变。
6.权利要求5的方法，其中在确定所述肿瘤细胞是否是PTEN缺失的、具有高pAKT分布或者具有PI3k突变之后，确定所述定位分布。
7.权利要求6的方法，其中所述定位分布在PTEN缺失的、高pAKT分布或者PI3k突变的肿瘤细胞中确定。
8.权利要求7的方法，其中F0X03a在PTEN缺失的、高pAKT分布或者PI3k突变的细胞中的细胞质定位分布与对由PI3K/AKT抑制剂产生的抑制的敏感性相关。
9.权利要求7的方法，其中F0X03a在PTEN缺失的、高pAKT分布或者PI3k突变的细胞中的细胞核定位分布与对由PI3K/AKT抑制剂产生的抑制的抗性相关。
10.权利要求5的方法，包括确定所述肿瘤细胞是否是PTEN缺失的。
11.权利要求5的方法，包括所述肿瘤细胞是否具有高pAKT分布。
12.权利要求5的方法，包括确定所述肿瘤细胞是否具有PI3k突变。
13.权利要求1-12的方法，其中所述PI3K/AKT抑制剂为2-(1H-吲唑-4-基)-6- (4-甲磺酰基-哌嗪-1-基甲基)-4-吗啉-4-基-噻吩并[3，2-d]嘧啶。
14.权利要求1-12的方法，其中所述PI3K/AKT抑制剂为AKT抑制剂。
15.权利要求1-12和14的方法，其中所述AKT抑制剂为式I的化合物或其互变异构体、拆分的对映异构体、拆分的非对映异构体以及盐其中R1 为 H、Me、Et 和 CF3 ；R2为H或者Me ；R5为H或者Me ； A为
16.权利要求1-12和14-15中任一项的方法，其中所述AKT抑制剂为(S)_2_(4_氯苯基)-1-(4-((51 ，710-7-羟基-5-甲基-6，7-二氢-5!1-环戊二烯并[d]嘧啶_4_基)哌嗪_1_基)_3_ (异丙基氨基)丙-1-酮或者其盐。
17.权利要求1-16的方法，其中F0X03a在肿瘤细胞中的定位分布由免疫组织化学 (IHC)测定来确定。
18.治疗患者中肿瘤的方法,包括对所述患者给予治疗有效量的式I的化合物或者其立体异构体或者盐，其中所述治疗基于具有细胞质F0X03a定位分布的患者肿瘤。
19.治疗患者中肿瘤的方法,包括对所述患者给予治疗有效量的式I的化合物或者其立体异构体或者盐，其中F0X03a在肿瘤中的定位分布基本上为细胞质中的。
20.治疗患者中肿瘤的方法,包括选择具有细胞质定位分布的肿瘤的患者以及对所述患者 给予治疗有效量的式I的化合物或者其立体异构体或者盐。
全文摘要
本发明提供预测肿瘤细胞生长对由PI3K/AKT激酶途径抑制剂产生的抑制的敏感性的方法，包括确定FOXO3a在肿瘤细胞中的定位分布，其中FOXO3a的细胞质定位分布与对由PI3K/AKT激酶抑制剂产生的抑制的敏感性相关且FOXO3a的细胞核定位分布与对由PI3K/AKT激酶抑制剂产生的抑制的抗性相关。
文档编号G01N33/574GK103038643SQ201180029723
公开日2013年4月10日 申请日期2011年4月15日 优先权日2010年4月16日
发明者E.庞诺斯 申请人:基因泰克公司