专利名称：：一种用于检测骨髓增殖性疾病mplw515l突变的试剂盒及其专用引物与探针的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的试剂盒及其专用引物与探针。技术背景骨髓增殖性疾病(myeloproliferativedisorders,MPDs)是一组造血干细胞肿瘤增生性疾病，在骨髓细胞普遍增生的基础上有一个系列细胞尤其突出，呈持续不断的过度增殖。临床上根据增生为主细胞系列的不同分为4种①以红细胞系增生为主者，称真性红细胞增多症(polycythemiavera，PV);②以粒细胞系增生为主者，称慢性粒细胞性白血病(chronicmyelogenousleukemia,CML);③以巨核细胞系增生为主者，称原发性血小板增多症(essentialthrombocythemia，ET);④以原纤维细胞增生为主者，称原发性骨髓纤维化症(idiopathicmyelofibrosis,IMF)。其中，95%的CML患者存在BCR/ABL融合基因，PCR-BCR/ABL检测已成为用于CML诊断的常规项目，而其余三种MPDs分别是影响红细胞、巨核细胞、血小板及骨髓微环境的恶性肿瘤，长期以来，未发现特异的分子诊断标志。近年来，有关MPDs发病机理研究的主要进展是发现部分PV、IMF和ET患者具有JAK2V617F突变，该突变是后天获得性的髓系细胞中JAK2激酶自氨基末端第617位氨基酸残基由缬氨酸(V)突变为苯丙氨酸(F)，造成JAK2激酶活性增加，细胞生长信号系统获得活化，进而导致细胞异常增殖。这一发现，不仅使快速、可靠、准确诊断MPDs成为可能，而且可针对JAK2V617F突变开发出与格列卫类似的新的靶向疗法(格列卫目前正在被用来治疗慢性髓性白血病)，将为治疗MPDs提供一种新的治疗方法。目前，已发现74-97%以上的PV、23-57X的ET以及35-95%的IMF患者中JAK2V617F突变的检测结果呈阳性。在慢性髓性单核细胞白血病(C画L)、慢性中性粒细胞白血病(CNL)和急性髓性白血病(AML，尤其是M2、M6、M7型)患者中，该突变的检测阳性率可达13-18%(其中CNL、C画L已被世界卫生组织新的分型归为MPD及MPD/MDS);而在急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病及继发性红细胞增多症等疾病患者中，该突变的检测结果为阴性，JAK2V617F突变的检测已广泛用于白血病的鉴别和诊断中。但在MPDs病人中，仍然有相当一部分病人JAK2V617F突变是阴性的，缺乏特异的分子诊断标志。近一年来，MPDs研究出现了重要的进展，在JAK2V617F突变阴性的患者中发现存在MPL(myeloproliferativeleukemiavirusoncogenehomology,MPL)突变(包括MPLW515L突变和MPLW515K突变)。MPL突变在JAK2V617F突变阴性的MF和ET患者中约占5-10%。MPLW515L突变是MPL激酶自氨基末端第515位氨基酸编码的密码子由TGG突变为TTG，导致MPL编码的氨基酸在该处由色氨酸(密码子TGG)突变为亮氨酸(密码子TGG)。与JAK2V617F突变检测一样，MPLW515L突变的检测也为明确MPDs诊断提供了可靠依据，还有可能作为治疗MPDs的一个药物靶标，用来治疗这一类疾病。目前，国际上已报道的用于检测MPL突变的方法主要包括PCR直接测序和定性PCR等，这些方法普遍存在灵敏度低、特异性不高、费时费力且易污染等缺点，使应用受到一定限制。2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan-MGB探针(TaqManMinorGrooveBinderProbe,TaqMan-MGB探针)，TaqMan-MGB探针是带有一个小沟结合物基团的寡核苷酸探针，工作原理与TaqMan探针相同，报告荧光基团连接在探针的5'端(如FAM、HEX、VIC等)，3'端标记有淬灭基团，不同的是淬灭基团为不发光的淬灭基团(Non-FluorescentQuencher,NFQ)，淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3'端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindoletripetide，DPI3)，DPI3可折叠进由探针末端5-6bp核苷酸形成的小沟内。DPI3呈新月行，与B型DNA螺旋的浅深小沟一样螺旋，主要通过范德华力稳定。TaqMan-MGB探针显示了更强的序列特异性。可以大大稳定探针与模板的杂交，升高探针Tm值，使较短的探针同样能达到较高的Tm值一而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高，一个15bp的MGB探针的信噪比大于6，优于理想状态下的25bp的普通TaqMan探针(信噪比约为1.5)。允许采用更短的探针也简化了探针的设计和成本。与传统的TaqMan探针比较，TaqMan-MGB探针有以下优势MGB增加了探针熔点温度(Tm)，这样可使探针较短，尤其适合富含A/T的序列，并且提高配对与非配对模板间的Tm值差异，可进行更多重的PCR;提高信噪比，由于在探针的3'端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间的位置更接近，实验的结果更精确，分辨率更高；且实验步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性大大提高。但是，目前尚没有专门用于检测基因组DNA上的MPLW515L突变的合造的引物和特异性的TaqMan-MGB荧光探针。
发明内容本发明的目的是提供一种用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的试剂盒。本发明所提供的用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的试剂盒，包括用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的引物和TaqMan-MGB探针。所述用于对骨髓增殖性疾病MPLW515L突变进行定性、定量检测的引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。其中，序列表中的SEQIDNO.1由21个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5'端第43587604-43587624位碱基的反向互补序列，SEQIDNO.2由21个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5，端第43587534-43587554位碱基，扩增片段长度为91bp。所述TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；所述探针为经过荧光标记的，5'端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3'端不仅标记有不发光的淬灭基团，还连接有二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindoletripetide，DPI3)。所述报告荧光基团可为F細、HEX或VIC等，不发光的淬灭基团可为NFQ(Non-FluorescentQuencher,NFQ)等。将具有序列表中SEQIDNO.3的TaqMan-MGB探针命名为W515wt—MGB—Probe，序列表中的SEQIDNO.3由16个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5'端第43587586-43587601位碱基的反向互补序列，针对43587596位的碱基G。将具有序列表中SEQIDNO.4的TaqMan-MGB探针命名为W515L-MGB-Probe，序列表中的SEQIDNO.4由18个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5，端第43587586-43587603位碱基的反向互补序列，针对43587596位的突变碱基T。上述试剂盒中还包括阳性对照、野生型对照和阴性对照；所述阳性对照为MPLW515L突变阳性病人细胞的DNA;所述野生型对照为正常人细胞的DNA;所述阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系。本发明的另一个目的是提供一种检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的方法。本发明所提供的检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的方法，包括以下步骤1)提取受试者的骨髓、外周血或组织的基因组DNA;2)以受试者骨髓或外周血的基因组DNA为模板，用上述试剂盒对上述步骤l)提取到的基因组DNA进行PCR扩增；3)对步骤2)的扩增产物进行MPL激酶基因的等位基因鉴别分析，若用于标记SEQIDNO:3的荧光染料发出的荧光强度呈S型增长，同时用于标记SEQIDNO:4的荧光染料发出的荧光强度无增长，表示野生型基因型；反之，表示MPLW515L纯合突变基因型；若两种荧光染料发出的荧光强度同时呈S型增长，则表示MPLW515L杂合突变基因型；4)根据步骤3)的基因型分析结果进行判断，具有MPLW515L纯合突变基因型或MPLW515L杂合突变基因型的受试者的MPLW515L突变检测结果为阳性。在上述检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中的MPLW515L突变的方法中，为了便于对检测结果进行分析，还可在步骤2)中添加MPLW515L突变阳性对照质粒、野生型质粒和阴性对照，其中，MPLW515L突变阳性对照质粒、野生型对照质粒分别来自以MPLW515L突变阳性病人及正常人细胞的DNA为模板，用SEQIDNO.5和SEQIDN0.6引物对进行PCR扩增后的产物，扩增产物经纯化后，分别被克隆进入pMD18-T质粒载体，经过细菌转化、筛选、测序验证及扩增后，提取DNA分别得到MPLW515L突变及野生型质粒标准品，通过测定吸光度值计算出拷贝数，分别制备十倍梯度稀释(107，106，105，104，103，102个拷贝)样品，用于制作MPLW515L突变及野生型的标准曲线；MPLW515L杂合突变基因型可为来自MPLW515L质粒和野生型质粒的不同比例的混合物，并以MPLw突变/MPL总与ACt(CtMP固5L突变-Ct帆野生)做标准曲线。测试样本的平均ACt分别代入标准曲线计算MPLW515L突变基因占MPL总基因型(MPU肌突变/MPL总)的百分比值。阴性对照可为不含DNA的PCR扩增体系。此外，根据步骤3)的分析结果，测试样本为MPLW515L杂合突变基因型的，可根据标准曲线计算MPLW515L突变基因占MPL总基因型(JMPLW5ia突变/MPL,e)的百分比值。本发明的第三个目的是提供一种用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的引物。本发明所提供的用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的引物，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。本发明的第四个目的是提供一种用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的TaqMan-MGB探针。本发明所提供的用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示;所述SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的5'端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3'端标记有不发光的淬灭基团和二氢环化吲哚卟啉-三肽。所述报告荧光基团为FAM或HEX,所述不发光的淬灭基团为NFQ。通过提取待测样品的基因组DNA，再将本发明的引物和TaqMan-MGB探针结合实时荧光定量PCR检测技术，通过检测人MPL激酶自氨基末端第515位的氨基酸，可达到检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的目的。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中对MPLW515L突变进行检测，不仅为MPDs的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，而且可进一步提供MPLW515L突变基因与野生MPL基因的确切比值，从而可为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。图1为十倍梯度稀释MPLW515野生型质粒标准品进行扩增的标准曲线图2为十倍梯度稀释MPLW515L突变质粒标准品进行扩增的标准曲线图3为MPL激酶自氨基末端第515位氨基酸位点为野生型的扩增曲线图4为MPL激酶自氨基末端第515位氨基酸位点为W515L杂合型的扩增曲线图5为测序验证部分样品的MPLW515L突变的结果图6为计算MPLW515L突变基因占MPL总基因型的百分比值的标准曲线图7为本发明的MPLW515L突变检测方法的稳定性及灵敏度测定结果具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物、TaqMan-MGB探针的合成及序列测定工作均由上海基康生物技术有限公司完成。实施例1、用于对骨髓增殖性疾病MPLW515L突变进行检测的引物和TaqMan-MGB探针的设计根据MPL激酶基因(1号染色体GeneLocmapregion，41,576,062-45,592,722bp，GeneLoclocationforGC01P043576)及其反向互补序列用PrimerExpressSoftware2.0软件设计一对PCR引物，同时根据野生型MPL激酶基因及MPL激酶MPLW515L突变基因的反向互补序列设计2条TaqMan-MGB探针，将2条TaqMan-MGB探针的5'端分别依次标记报告荧光基团HEX和FAM，3'端标记不发光的淬灭基团，并连接DPI3，引物、TaqMan-MGB探针序列如表1所示表1检测MPLW515L突变的引物、探针序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>测序用SEQIDNO.5与SEQIDNO.6引物扩增片段549序列表中的SEQIDNO.1由21个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5，端第43587604-43587624位碱基的反向互补序列，SEQIDNO.2由21个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5，端第43587534-43587554位碱基，扩增片段长度为91bp。将具有序列表中SEQIDNO.3的TaqMan-MGB探针命名为W515wt-MGB-Probe，序列表中的SEQIDNO.3由16个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5，端第43587586-43587601位碱基的反向互补序列，针对43587596位的碱基G。将具有序列表中SEQIDNO.4的TaqMan-MGB探针命名为W515L-MGB—Probe，序列表中的SEQIDNO.4由18个碱基组成，该序列为1号染色体GC01P043576自5'端第43587586-43587603位碱基的反向互补序列，针对43587596位的突变碱基T。实施例2、骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的检测一、用根据MPL基因组基因设计的引物和TaqMan-MGB探针进行骨髓增殖性疾病MPLW515L突变检测用实施例1中根据MPL基因组基因设计的引物和TaqMan-MGB探针对MPDs患者，包括ET、MF、未归类的MPDs，及CML等骨髓或外周血标本(来自人民医院)进1)待测样品基因组DNA的提取按DNAzol试剂盒(购自美国Gibco公司)并参照试剂盒说明书在无菌条件下提取MPDs患者及正常骨髓移植供者(见表l)的骨髓标本的基因组DNA，方法为-用EDTA抗凝，用淋巴细胞分层液(相对密度1.077g/L，上海华精高科技有限公司)分离出单个核细胞，将分离出的单个核细胞用生理盐水洗涤2次后，加入600ulDNAzol试剂，轻轻混合吹打后加入600iil无水冷乙醇，4°C、12000rpm离心1分钟，弃上清，将沉淀用80%的冷乙醇洗涤一次，室温干燥，用适量的灭菌注射用水溶解沉淀，最后用DNA/RNA紫外检测仪测定DNA含量及纯度，结果A260/A280>1.8，表明所提取的DNA纯度较高。2)PCR扩增以步骤l)提取的DNA为模板，在实施例1中所述引物SEQIDNO.1、SEQIDNO.2及由序列表中SEQIDNO.3和SEQIDNO.4组成的TaqMan-MGB探针的引导下，用ABI7500实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)进行PCR扩增，PCR反应体系为1XTaqMar^通用PCR扩增预混试剂(购自美国应用生物系统公司)，弓l物SEQIDNO.1、SEQIDNO.2各400nM，荧光标记的W515wt—MGB—ProbelOOnM，W515L—MGB—Probe250nM，150-500ngDNA。PCR反应条件为:先50°C2分钟;然后95。CIO分钟；最后95。C15秒，60°C1分钟，共45个循环。为了便于对检测结果进行分析，同时设置MPLW515L突变阳性对照质粒、野生型质粒和阴性对照，其中，MPLW515L突变阳性对照质粒、野生型对照质粒分别来自以MPLW515L突变阳性病人及正常人细胞的DNA为模板，用SEQIDNO.5和SEQIDN0.6引物对进行PCR扩增后的产物，扩增产物经纯化后，分别克隆入pMD18-T质粒载体，经过细菌转化、筛选、测序验证及扩增后，提取DNA分别得到MPLW515L突变及野生型质粒标准品，通过测定吸光度值计算出拷贝数，分别制备十倍梯度稀释(107，106,105，104，103，102个拷贝)样品，用于制作MPLW515L突变及野生型的标准曲线。十倍梯度稀释的MPLW515野生型质粒标准品进行扩增的标准曲线如图1所示，十倍梯度稀释的MPLW515L突变质粒标准品进行扩增的标准曲线如图2所示。阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系。3)PCR扩增曲线鉴别分析对步骤2)的扩增产物进行等位基因鉴别分析，若用于标记TaqMan-MGBSEQIDNO.3的荧光染料HEX发出的绿色荧光强度呈S型增长，同时用于标记TaqMan-MGBSEQIDN0.4的荧光染料FAM发出的蓝色荧光强度无增长，表示野生型基因型，扩增曲线见图3(箭头指示的曲线表示荧光强度变化)；反之，表示纯合突变基因型;若两种荧光染料发出的荧光强度同时呈s型增长，则表示杂合突变基因型，扩增曲线见图4(箭头指示的曲线分别表示荧光强度变化，在图4中分别表示MPLW515L突变基因型和野生型基因型)。4)结果判断根据步骤3)的基因型分析结果进行判断，具有杂合突变基因型或纯合突变基因型的待测样品的MPLW515L突变检测结果为阳性，受试者为骨髓增殖性疾病患者，检测结果如表l所示。对其中9例标本(阳性7例，阴性2例)用测序的方法进行了验证，其中6例标本的测序检测结果如图5所示，与以上方法的检测结果一致。表明用本发明的引物、TaqMan-MGB探针及方法可对MPLW515L突变进行检测，检测结果准确。表1MPLW515L突变在JAK2V617F阴性的MPDs中的检出情况<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>5)同时对阳性对照突变基因型MPLW515L的质粒DNA依次用野生基因型质粒DNA稀释为80%、40%、20%、10%、5%的比例，每梯度重复3-5管进行扩增，以MPLW515L突变/MPL总与其相应的平均ACt(Ct亂醒突变-CW野生)做标准曲线为y=-0.0722x+0.1828，检测MPLW515L突变，相关系数r:0.99，其中Y代表不同的突变基因百分比，X代表平均ACt(Ct歡w涯突变-CWl野生)，测试样本的平均ACt代入上述标准曲线方程可计算出测试样本的突变基因百分比(MPLW515L突变/MPL总)。对上述阳性的MPDs患者的结果根据DNA标准曲线(见图6)计算其突变基因百分比(MPLW515L突变/MPL总)，结果平均值为24.63±12.71%。二、本发明骨髓增殖性疾病MPLW515L突变检测方法的灵敏度测定将阳性对照突变基因型MPLW515L的质粒DNA依次用野生基因型质粒DNA稀释为60%、40%、20%、10%、0.5%(突变基因型/(突变基因型+野生基因型))的比例，按上述相同方法进行检测，结果在0.5X梯度均可检出MPLW515L突变扩增曲线，表明本发明方法的检测灵敏度可达0.5%(见图7)。序列表<160〉6<210〉1〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220><223〉<400〉1gcggtacctgtagtgtgcagg21〈210〉2<211〉21〈212〉腿〈213〉人工序列〈220〉〈223〉<400>2ggtgaccgctctgcatctagt21〈210〉3<211〉16〈212〉DNA<213>人工序列<220〉〈223〉200810226511.X<400〉3actgccacctcagcag〈210〉4<211〉18〈212>薩<213>人工序列<220><223〉<>4aaactgcaacctcagcag〈210〉5<211>19<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉<400〉5c6Lcagagcgasccaagaat<210〉6〈211〉19<212>DNA<213〉人工序列〈220〉〈223>〈400〉6cgatctcgctaccgtttac19权利要求1、一种用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的试剂盒，包括用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的引物和TaqMan-MGB探针；所述用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的引物，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO1和SEQIDNO2所示；所述TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO3和SEQIDNO4所示。2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述TaqMan-MGB探针的5，端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3'端标记有不发光的淬灭基团和二氢环化喷哚叶啉-三肽。3、根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述报告荧光基团为FAM或HEX,所述不发光的淬灭基团为NFQ。4、根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括阳性对照、野生型对照和阴性对照；所述阳性对照为MPLW515L突变阳性病人细胞的DNA;所述野生型对照为正常人细胞的DNA;所述阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系。5、一种用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的方法，包括以下步骤1)提取受试者的骨髓、外周血或组织的基因组DNA;2)以受试者骨髓或外周血的基因组DNA为模板，以权利要求1-3中任一所述的试剂盒对上述步骤1)提取到的基因组DNA进行PCR扩增；3)对步骤2)的扩增产物进行MPL激酶基因的等位基因鉴别分析，若用于标记SEQIDNO:3的荧光染料发出的荧光强度呈S型增长，同时用于标记SEQIDNO:4的荧光染料发出的荧光强度无增长，表示野生型基因型；反之，表示MPLW515L纯合突变基因型；若两种荧光染料发出的荧光强度同时呈S型增长，则表示MPLW515L杂合突变基因型；4)根据步骤3)的基因型分析结果进行判断，具有MPLW515L纯合突变基因型或MPLW515L杂合突变基因型的受试者的MPLW515L突变检测结果为阳性。6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤2)中还包括添加阳性对照、野生型对照和阴性对照的步骤；所述阳性对照为MPLW515L突变阳性病人细胞的DNA;所述野生型对照为正常人细胞的DNA;所述阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系。7、用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的引物，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。8、用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；所述SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的5'端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3'端标记有不发光的淬灭基团和二氢环化吲哚卟啉-三肽。9、根据权利要求8所述的TaqMan-MGB探针，其特征在于所述报告荧光基团为FAM或HEX,所述不发光的淬灭基团为NFQ。10、权利要求1-4中任一所述的试剂盒、权利要求7所述的引物、权利要求8或9所述的探针在检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变中的应用。全文摘要本发明公开了一种用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的试剂盒及其专用引物与探针。本发明所提供的试剂盒，包括引物和TaqMan-MGB探针；所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO1和SEQIDNO2所示；所述TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO3和SEQIDNO4所示。本发明所提供的用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的试剂盒可用于临床及科研中对MPLW515L突变进行检测，不仅为MPDs的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，而且可进一步提供MPLW515L突变基因与野生MPL基因的确切比值，从而可为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。文档编号G01N21/75GK101403009SQ20081022651公开日2009年4月8日申请日期2008年11月13日优先权日2008年11月13日发明者刘艳荣,李玲娣,牛继红,秦亚溱,阮国瑞,陈珊珊,黄晓军申请人:北京大学人民医院