专利名称：液相均相测定的制作方法
液相均相测定
背景技术：
特异性结合测定是用于检测物质存在或含量的测试方法，并且是以特异性识别和与特异性结合伴侣结合一起为基础的。免疫测定是特异性结合测定的实例，其中抗体可结合于特定的蛋白质或化合物。在这些实例中，抗体是特异性结合配对成员中的成员。核酸结合性测定是另一种类型，其中互补核酸链是特异性结合配对。特异性结合测定构成了较宽的和正在发展的技术领域，其能够精确地检测疾病状态、传染性生物体和非监管药物。在过去的几十年中，一直进行这些工作，以便设计出具有所要求的灵敏度、动态范围、实用性、 广泛适用性和适合自动化的分析和测定方法。这些方法能够被大体分组为两个类型。均相的方法利用特异性结合分析物的反应来调节或者产生可检测信号，无需要求在对分析物特异的反应物和非分析物特异性的反应物之间的分离步骤。异相的形式则依赖于被分析物结合的和游离的(未被结合于分析物)的可检测地标记的特异性结合伴侣之间的物理分离。分离典型地要求关键的反应物被固定化到一些类型的固体基材上，以使得一些类型的物理过程例如过滤、沉积、聚结或者磁力分离可以被采用；并且典型地还要求洗涤步骤，以便除去游离的可检测地标记的特异性结合伴侣。依赖于产生化学发光信号并且与分析物含量相关联的测定方法已经经历提高的应用。这些方法能够使用相对简单的仪器进行，仍然可显示良好的分析特性。特别地，使用酶标记的用于分析物的特异性结合伴侣和化学发光的检测用酶底物的方法已经得到了广泛应用。普通的标记酶包括碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。美国专利6，911，305公开了一种方法，用于在第一薄膜上检测结合于敏化剂、或用敏化剂标记的探针的多聚核苷酸分析物。该薄膜和携带有固定化化学发光前体的第二薄膜相接触。激发在夹心薄膜中的敏化剂可产生单线态氧，单线态氧可与化学发光前体反应从而在第二薄膜上产生可引发的化学发光化合物。该可引发的化学发光化合物可与试剂起反应从而在第二薄膜上产生化学发光，用于检测分析物。这些方法并不依赖于用于使反应物进行接触的特异性结合反应；相反，第二薄膜用作试剂输送装置。美国专利6，406，913公开的测定方法包括在一定条件下处理怀疑含有分析物的介质，使得该分析物可以引起光敏剂和化学发光化合物获得密切接近。该光敏剂当用光源辐照时可产生单线态氧；单线态氧可通过溶液扩散至化学发光化合物，并且当密切接近化学发光化合物时，单线态氧可激活该化学发光化合物。被激活的化学发光化合物随后产生光。产生的光量与介质中的分析物含量有关。在一种实施方式中，至少一种光敏剂或化学发光化合物与悬浮的颗粒相关联，并且特异结合性配对成员被与其相结合。美国专利申请公开US2007(^64664和US2007(^64665公开了用于进行特异性结合配对分析的测定方法，涉及固定化化学发光化合物与活化剂化合物的反应，所述活化剂化合物借助于特异性结合反应而进入反应性构造中。其不要求分离或者除去过量的未结合的化学发光化合物或者活化剂。与现有测定技术相比，这些测定形式提供了优良的操作便利性和在自动化中的灵活性。尽管具有这些优点，在测定方法设计和性能中附加的改进始终是分析方法开发人员的目标。本发明公开的测定方法通过提供简单的灵敏度改进的测定法而满足了这些需要。

发明内容
本发明公开了用于检测怀疑含有反应物的样品中反应物的方法、试剂、试剂盒和系统， 其中所有的试剂皆可溶于水溶液。一种测定方法包括在反应物存在的条件下，处理怀疑含有反应物的样品，使活化剂达到反应构型，化学发光化合物将其激活。样品还被处理以减少与分析物不相关的信号。最后，用引发剂溶液处理该样品，借此由被激发的化学发光化合物产生光。没有试剂与某一表面或其他固相相连接。
具体实施例方式
定义烷基一含有1-20个碳的支链、直链或者环烷基团，其可以用1个以上除H之外的取代基取代。在此使用的低级烷基是指含有8个以下碳原子的那些烷基。分析物一测定中在待检测样品中的物质。一种以上具有对分析物的特异性结合亲合力的物质将被用于检测分析物。该分析物可以是蛋白质、肽、抗体、或半抗原，与这些分析物结合的抗体可以被制备。该分析物可以是核酸或低聚核苷酸，其可以被互补的核酸或低聚核苷酸结合。该分析物可以是任何其他可形成特异性结合配对成员的物质。其他示例性的分析物类型包括药物比如留族化合物、激素、蛋白质、糖蛋白、粘蛋白、核蛋白、磷蛋白、非监管药物、维生素、抗菌药物、抗真菌药物、抗病毒药物、嘌呤、抗肿瘤药试剂、安非他明、氮杂化合物、核苷酸、和前列腺素、以及所有这些药物的代谢产物、杀虫剂和杀虫剂的代谢产物、以及受体。分析物还包括细胞、病毒、细菌和真菌。活化剂一一种化合物，还可被认为是标记，其具有活化化学发光化合物的功能以使得在存在的条件下产生化学发光。被活化剂标记sbm或者活化剂特异性的结合成员共轭物--在测定混合物中的反应物，该混合物至少包括连接构造中的下述物质a)用于分析物的特异性结合成员；和b) 具有活化化学发光化合物效果的活化剂化合物或标记。
抗体包括全长免疫球蛋白及天然或基因工程化的片段。芳烷基--用芳基取代的烷基。例子包括苯甲基、二苯甲基、三苯甲基、和苯乙基。芳基一含有芳香环的基团，该基团含有1至5个碳环的芳香环，其可以用1个以上除H之外的取代基取代。生物材料一包括，例如全血、抗凝血的全血、血浆、血清、组织、动植物细胞、细胞内容物、病毒、以及真菌。化学发光化合物一一种化合物，其还可以被称为标记，其可例如通过被转化为另一种在电子激发态下形成的化合物而参与引起光辐射的反应。该激发态可以是单线激态或三重激态。该激发态可以刚一衰减成基态就直接发光，或者可以将激发能传递至发射能受体，借此返回到基态。在该过程中，能量受体跃迁至激发态并发光。化学发光标记的固定化sbm-在测定混合物中的反应物，该混合物至少包括连接构造中的下述物质a)用于分析物的特异性结合成员；b)化学发光化合物或标记；和c)固相。
连接一在此使用的该术语是指两个以上化学物种或者支持材料被通过化学法连接，例如通过一个以上共价键，或者被动地附着例如通过吸附、离子吸引，或者特异性结合过程比如亲合性结合。当这些物种或者材料彼此相连接时，能够涉及一种以上连接类型。剂量反应一信号比如测定反应所产生的化学发光，其与样品中分析物的含量相关。杂烷基一一种烷基，其上至少一个环或非末端链中的碳原子被选自N、0、或S的杂原子取代。杂芳基一一种芳基，其上1至3个的环中碳原子被选自N、0、或S的杂原子取代。 例举的基团包括批啶基、批咯基、噻吩基、呋喃基、喹啉基和吖啶基。样品一在测定中含有或者怀疑含有待测分析物的混合物。分析物包括，例如蛋白质、肽、核酸、激素、抗体、药物、和甾族化合物。可以在本公开的方法中使用的典型样品包括身体的液体，比如血液，其可以是当收集血液标本时通常见到的抗凝血的血液、血浆、血清、尿液、精液、唾液、细胞培养物、组织提取液等等。其他类型的样品包括溶剂、海水、工业用水样品、食品样品和环境样品比如土壤或水、植物材料、真核生物、细菌、质粒、病毒、真菌、以及源于原核生物的细胞。sbp (特异性结合伴侣)一特异性结合配对成员或特异性结合伴侣是包括生物分子在内的一种分子，具有针对另一种物质(比如分析物)的特异性结合亲合性。用于分析物的两个特异性结合伴侣，最好是在分析物上具有不同的结合位点，可以称为特异性结合配对。SSIA (Selective Signal Inhibiting Agent，选择性信号抑制剂)一一种在本公开的测定反应混合物中提供的化合物，其使得非专一性信号或者背景信号与从测定反应混合物的化学发光产生反应所产生的对分析物特异的信号相比会以更大量降低。固体支持物一一种大小至少为1微米的材料，具有一个其上能固定测定成分的表面。材料可以呈如下形式颗粒、微粒、纳米颗粒、金属胶体、纤维、纸张、珠子、膜片、滤纸及其他支撑物比如试管、微孔板、芯片、载玻片、和微阵列。可溶性的、溶解性、增溶一一种物质与另一种物质均勻混合的能力或者趋势。在本公开中，溶解性和相关术语一般指的是固体在液体中的特性，例如在缓冲水溶液中的 SSIA。固体的可溶性是指它们在溶剂(例如液体)中丧失它们的结晶形状并变成呈分子状态或呈离子状态溶解或者分散、从而形成真溶液的程度。相反二相系统，其中一个相由分布在整个一体物质内的小颗粒(包括微粒或者胶体大小的颗粒)组成，不论是否被稳定化以阻止沉淀、还是未被稳定化。取代一是指基团上至少一个氢原子被非氢基团置换。应该注意，关于被取代基团，本文中指的是可以存在多个置换位点，除非另有明确说明。反应容器一一种容纳样品和其他根据本发明测定法的成分的容器或装置。包括例如，不同大小和形状的试管、微孔滴定板。
公开本发明公开提供了均相测定方法，特别是在分析物结合化学发光标记特异性结合伴侣和活化剂标记的特异性结合伴侣共轭物(conjugate)结合后，使用分析物化学发光检测的均相测定方法。均相测定及其方法的进行可以不需要使游离的特异性结合伴侣与复合体中已被结合的特异性结合伴侣相分离的步骤。本发明公开提供了快速简单的均相测定法，其利用特异性结合配对反应来检测物质的存在、位置和含量。该测定要求使用在液相中的连接于第一个特异性结合伴侣的化学发光化合物(化学发光标记(的)sbp，化学发光标记(的)特异性结合伴侣)、共轭于第二个特异性结合配体的活化剂化合物(活化剂标记(的)特异性结合伴侣)、选择性信号抑制剂(SSIA)、增强剂、以及引发剂溶液。与其他均相测定相比，本公开的基本实施方式，包括活化剂标记特异性结合伴侣和化学发光标记特异性结合伴侣在内的所有反应物皆可溶于水溶液。实际上，本发明的测定不需要或不使用固相。本测定方法与其他均相测定法不同的另一点是，不需要特殊化的构造物一也就是设计成带有可检测成分的被标记的特异性结合配对成员，该配对成员不被活化或者只有在与另一成分在一个复合体中结合后才能产生某种可检测信号。与本发明公开的测定系统相比，其他均相测定系统的制备是复杂、困难或昂贵的，因为那些方法需要这种特殊化的成分。而本发明的测定法提供了一种使测定设计与开发更简单、更灵活的方法，并更容易应用于较宽范围的分析物。不同于常规的异相或基于分离的测定方法，本发明的测定方法不采用分离步骤或工艺将游离的特异性结合伴侣与已结合在复合体中的特异性结合伴侣区分开来。通过使用避免分离步骤的本测定方法，使得测定的控制简化了，测定时间得以缩短，自动化变得更容易。在本发明公开的测定方法中，化学发光标记的特异性结合伴侣、活化剂标记的特异性结合伴侣和选择性信号抑制剂(SSIA)被一同加入到含有样品的水溶液中。在一个实施方式中，当可被特异性结合伴侣成员识别的分析物存在于样品中时，化学发光标记的特异性结合伴侣、活化剂标记的特异性结合伴侣各自结合于分析物上的不同区域。产生与分析物相关的特异性信号，在刚一加入引发剂溶液就开始检测。在另一个实施方式中，提供分析物的化学发光标记类似物比便应用于竞争测定模式中。分析物和化学发光标记的类似物竞争性地结合于活化剂标记的特异性结合伴侣。在竞争性结合测定的一个实施方式中，化学发光标记的类似物和活化剂标记的特异性结合伴侣的复合体可以被预先形成，加入分析物以取代被标记的类似物。在另一个实施方式中，化学发光标记的类似物、分析物、活化剂标记的特异性结合伴侣在未预先形成结合性复合体的情况下被混合一起。产生与分析物相关的特异性信号，在刚一加入引发剂溶液就开始检测。信号与测定模式中的分析物浓度逆向相关。作为特异性结合伴侣与分析物结合的结果，使活化剂与化学发光化合物呈可操作地接近，这样活化剂可有效地地活化反应，在刚一加入引发剂溶液时就产生化学发光。活化剂与化学发光化合物的反应可活化或改变化学发光化合物，使得用引发剂溶液处理导致进一步生成光的反应。术语“可操作地接近”是指，化学发光化合物和活化剂足够接近，包括并且直至物理接触，这样它们能够进行反应。相对于检测分析物浓度所需的量，可以向系统中提供过量的活化剂标记的特异性结合伴侣和/或化学发光标记的特异性结合伴侣。在加入引发剂溶液和检测之前不除去多余的未结合的活化剂标记的特异性结合伴侣、未结合的化学发光共轭物，因为它们的存在和测定系统中固相的缺乏并不会抑制化学发光检测信号与分析物的量之间精确地建立关联。因为未结合的被标记的特异性结合伴侣能够经受相同的化学发光检测反应，并且反应物不与固相连接(没有有用的相关性，即使最好的情况)，所以信号与反应物的相关性也非常有限，这是期望的。按照经验，这个特点通常将导致测定失败。令人惊讶的是，这个问题已经通过在这本发明的方法中使用选择性信号抑制剂而被克服。在本方法中，溶液中不与固相连接的反应物、未被去除的多余活化剂的存在、多余化学发光化合物的存在并不丧失进行灵敏的、特异性的、分析物浓度依赖性的结合测定的能力。这个发现是不可预知的或预料不到的。特别是当活化剂是催化剂比如酶时(当分子在溶液中游离反应时，酶通常每秒可以诱导数百数千倍的反应)，预料不到的是已被结合的活化剂可以有效地区别排除于游离的活化剂反应，以便在整个较宽的分析物浓度范围内产生剂量反应信号。而且，发明者还发现，极好的区别性源于特定的SSIA化合物的加入。通过使用SSIA，在化学发光标记与活化剂标记(两者通过被标记的特异性结合配对成员与分析物的复合体而呈反应构型)之间的反应所产生的信号与来自存在的(但并不存在于该复合体中)标记物的信号的比率被戏剧化地提高。参考示意

图1，可以理解SSIA在改进的测定灵敏度中的功能。游离(未与分析物结合)的和被复合的化学发光标记(的)特异性结合伴侣(CLsbp)与活化剂标记(的)特异性结合配对(ALsbp)有多种不同的组合方式，当加入引发剂溶液时，这些方式都可能对所观察的化学发光信号有贡献。四种建议的反应图列于如下
1被结合的ALsbp+被结合的CLsbp —特异性信号 2被结合的ALsbp+游离的CLsbp —非特异性信号 3游离的ALsbp+被结合的CLsbp —非特异性信号 4游离的ALsbp+游离的CLsbp —非特异性信号如上所示，四种不同类型的化学发光化合物与活化剂的配对能在混合反应中反应；但只有第一种类型产生了与测定中分析物的含量相关的信号。SSIA取得了令人惊讶的作用，相对于1反应所产生信号，它选择性地抑制2-4反应所产生的信号量。在一些实施方式中，四种反应都会减弱，但2-4反应的信号相应地减少更多，即SSIA取得了同样的作用。在本发明的实施方式中，提供了通过分析物与用于分析物的特异性结合伴侣之间的特异性结合反应来分析所样品中所关注的分析物的方法，其中，一个特异性结合伴侣被用活化剂化合物标记，该活化剂可以催化剂比如酶、尤其是过氧化氢酶。另一个用于分析物的特异性结合伴侣被化学发光化合物标记。标记的Sbp与分析物的结合生成带标记的复合体。化学发光化合物经受被活化剂诱导的在加入引发剂溶液后引起的化学发光反应。化学发光的结果与样品中分析物的含量有关。特异性结合配对反应和化学发光反应由所有溶解在溶液中的成分完成，典型的溶液是水溶液。显著地，提供的被标记的特异性结合伴侣的含量相对于样品中分析物的量是过量的，从而使得不是所有的标记Sbp都与分析物生成复合体。即使多余的标记Sbp能参与化学发光反应，但并不从反应溶液中去除。未在复合体中、 也未被按常规除去的标记Sbp的反应性会阻止这种均相测定的进行，因为会产生不可接受的高信号，这种高信号不是由于存在分析物介导的复合体形成而产生的。在许多情况下，这种如此多的“背景”信号的产生使得无法得到有用的剂量反应关系。为了能够进行均相的非分离式测定，当所有为化学信号产生所必需的反应成分呈结合性复合物形式和游离或未结合形式这两种形式存在时，必须提供除物理分离之外的某种手段来区分已被结合的和未被结合的标记sbp。针对这个问题，本发明提供了一种长期被追求的溶液，提供了所有成分都在溶液中的测定方法，不进行分离。不同于已知的均相测定方法，本方法不需要或不使用特别设计的标记结合伴侣，这些结合性伴侣能够不经受产生信号的反应，除非它们被带入在结合性复合体中。在发明实施的测定方法中，被结合于具有分析物的复合体中的标记sbp成员与游离的标记Sbp成员的必要区分是通过向反应溶液中提供选择性信号抑制剂(SSIA)而实现的。向反应溶液中加入有效量的SSIA可导致来自已结合的标记sbp成员的信号超过包括来自任何未结合的标记sbp成员的信号在内的背景信号，相比未使用SSIA的情况超过程度极其明显。当信号对背景关系的这一改进被实现时，测定的效用得以增强，包括更高程度的检测灵敏度。在一个实施方式中，提供的测定方法尤其是特异性测定方法中，由于分析物的存在，使得化学发光标记的sbp和活化剂标记的sbp经由至少一个特异性结合反应而得以可操作地接近，其中已结合的活化剂标记的sbp可激活一旦加入引发剂溶液就产生化学发光的反应，该反应用以检测分析物的存在、位置和量。在另一个实施方式中，本发明的测定方法还与传统测定方法不同的是，不去除存在的未结合的活化剂标记的sbp，这些未结合的活化剂标记的Sbp在测定中相对于与分析物特异结合的量大量剩余，不要求洗涤或分离多余的未结合的活化剂标记的sbp。在另一个实施方式中，本发明的方法也不用除去相对于与分析物特异结合的量有剩余的未结合的化学发光共轭物，不需要洗涤或分离未结合的化学发光共轭物的步骤。测定组成，即含有分析物的样品、活化剂标记的sbp，化学发光标记的sbp，选择性信号抑制剂及引发剂溶液可以被陆续加入试管，不需要洗涤或分离，并且读取发光。除了最后加入的引发剂溶液之外的测定组成可以以任何次序或组合加入试管中。在一个实施方式中，在注入引发剂溶液前，样品和活化剂标记Sbp可以被预先混合并加入含有化学发光标记Sbp的试管中。使用化学发光底物和酶标记的结合物的常规测定法要提供大大过量于标签酶的量的化学发光底物。通常，底物/酶的摩尔比率可以超过十的九次幂，即，过量十亿倍。据相信，在常规的测定中有必要供应这样极大过量的化学发光化合物，以便确保充分的底物供应，用于连续的酶法转化，并且该过程确保在测定中足够的检测灵敏度。申请人发现，有可能设计出高灵敏度的测定方法，其将化学发光化合物对活化剂的比率减小了几个数量级。 就这点来说，在此描述的这些方法本质上不同于已知的酶联测定方法。通过省去如上所述和如下所述示例性测定法显示的洗涤和分离步骤，提供了使测定方案设计简单化的机会。操作步骤数量的减少可以降低测定次数、由不完全的洗涤带来的内测定变化性、以及成本。同时，增强了自动化和小型化测定性能的能力，具有自动化和小型化伴随的所有固有优点。按本发明方法进行的测定法包括提供特异性结合伴侣(sbp)来特异性地结合或捕捉所关注的分析物。特异性结合伴侣能直接或间接地结合待检测的分析物。随后进一步向特异性结合伴侣提供直接或间接地附着于其上的化学发光标记化合物。化学发光标记可以由如下所详述的不同途径得到。各个情况下，化学发光标记稳定地、或不可逆地被直接或间接地以可维持“化学发光标记sbp”水溶性的方式与特异性结合伴侣相连接。术语“不可逆地”是指在待进行的测定中的使用条件下，基本上不从化学发光标记Sbp中除去化学发光标记。倘若在使用条件下标记被稳定附着、且仍保持在化学发光标记sbp上，则被动或非共价附着也是可以考虑的。该测定法进一步包括提供具有分析物的活化剂标记sbp和与化学发光标记sbp连接的用于分析物的特异性结合伴侣，并且允许这些组成形成特异性结合复合体。样品、化学发光标记sbp、催化剂标记Sbp可以被以任意次序分别加入、或者以组合形式陆续或同时加入，也可以提前混合作为组合物加入。分析物与标记的Sbp成员的结合一般要求一段时间。 在一些实施方式中，可以如此进行为使结合反应发生，结合成分经可选的延迟时间被陆续加入。当结合性复合体形成后，加入引发剂溶液以产生用来检测分析物的化学发光，并且检测化学发光。典型地，光强度水平的峰值或光强度以固定的时间间隔积分，或测量所有积分的光强度。所产生光的量与反应试管中样品含有的分析物的量相关。通过按通常已知方法建立校准曲线，光的量可以被用来确定反应物的数量。当光的发射在继引发剂溶液加入后迅速发生时，期望的是，或者用机械方法测量开始用合适的注射器添加的时间、或者用已经置于检测中的反应试管进行添加步骤。反应物的适宜量、容积、稀释度、特异性结合配对反应的温育时间、反应物浓度等，可以由常规测定法事先确定，参考进行特异性结合测定方法的标准论述，之后详述的实施例可以作为指南。本测定和方法中所用sbp成员的浓度和含量将取决于如下这些因素分析物浓度、所期望的结合速度/测定时间、共轭物的成本和可用性、Sbp成员的非特异性结合度等。 通常Sbp成员以至少等于最低的预期分析物的浓度存在，更常见的是，以等于至少最高的期望的分析物浓度存在。并且，对于非竞争性测定，浓度可以是分析物最高浓度的10倍到 IO6倍。通常sbp成员的浓度小于10_4M，更多的情况是小于10_6M，经常是在10_"到1(ΓΜ之间。与sbp成员连接的活化剂或化学发光化合物的含量通常是至少1个分子/每sbp成员，可以高到IO2或更高。在许多实施方式中，与sbp成员连接的活化剂或化学发光化合物的量是1-20个分子。例举的活化剂对化学发光化合物的比率被提供于工作实施例中。
化学发光标记(的)sbp本方法需要使用与第一个特异性结合伴侣相连接的化学发光化合物(化学发光标记sbp)，在本发明公开的测定和方法中，化学标记sbp可溶于水溶液。在本公开的测定和方法中，不同于在其他亲合性测定和方法中看到的那样，化学发光标记化合物未被固定在诸如微粒、多孔板膜片、滤纸、试管、试纸、移液吸头等固体表面。化学发光标记sbp包括化学发光标记化合物和特异性结合配对中的一个成员。在一些实施方式中，化学发光标记sbp包括一个以上化学发光标记化合物。在一些实施方式中，化学发光标记sbp包括特异性结合配对中一个成员的一个以上拷贝。在一些实施方式中，化学发光标记化合物直接与特异性结合配对中一个成员的一个以上拷贝连接。在另一些实施方式中，一个以上化学发光标记化合物被直接地连接于特异性结合配对中一个成员的一个拷贝。直接连接，也称为直接标记，包括共价结合作用、离子结合作用、以及疏水作用。在一种实施方式中，化学发光标记与分析物特异性结合伴侣共价连接。在一些实施方式中，化学发光标记化合物被间接地连接于特异性结合配对中一个成员的一个以上拷贝。在另一些实施方式中，一个以上化学发光标记化合物被间接地连接于特异性结合配对中一个成员的一个拷贝。间接连接除化学发光标记化合物和特异性结合配对成员之外还可包括一种或多种辅助物。辅助物可溶于水溶液，含有一种以上辅助物的化学发光标记sbp可溶于水溶液。在不同的实施方式中，辅助物包括可溶性蛋白质(例如链霉亲合素、亲合素、中性亲合素、生物素、阳离子化牛血清白蛋白、fos蛋白、jun蛋白、匙孔血蓝蛋白“KLH”、合成或天然的免疫球蛋白及其片断或部分)、可溶性的合成树状聚体(如PAMAM)、可溶的合成聚合物(如聚丙烯酸“PAA”)，可溶性的天然聚合物(如功能化的右旋糖苷、氨基右旋糖苷的多糖、低聚核苷酸、蛋白质、及其组合物)、脂质体、胶束、泡囊、及一种以上可溶合成聚合物、 可溶天然聚合物和可溶性蛋白质的组合物(如免疫球蛋白G/生物素/链霉亲合素/PAA)。 其他可溶于水溶液、并能使一个以上化学发光标记化合物sbp附着的辅助物，预想可以应用在本发明和方法中。在一些的实施方式中，化学发光标记共价连接的辅助物是蛋白质或肽。例举的可溶蛋白质包括白蛋白、亲合素、链霉亲合素、α螺旋蛋白、fos蛋白、jun蛋白、匙孔血蓝蛋白 “KLH”、合成或天然的免疫球蛋白及其片段或部分、及它们的任意组合物。在一种实施方式中，辅助物是通用抗体比如IgG，其中化学发光标记与通用抗体通过可维持分析物特异性捕捉抗体的结合亲合力的方式共价连接。在另一个化学发光标记sbp实施方式中，化学发光化合物经由生物素-链霉亲合素或生物素-中性亲合素的结合而连接一个以上sbp。当化学发光化合物处于链霉亲合素共轭时，化学发光标记sbp与链霉亲合素-生物素的结合或相当的连接例如可以使特异性结合伴侣成为一个生物素共轭物。生物素-链霉亲合素的选择性排列(arrangement)及类似的连接已为人所知。作为选择，化学发光标记sbp与链霉亲合素-生物素的结合或相当的连接可以利用用于sbp或化学发光化合物与一个以上附加的辅助物之间附着的连接。在另一种实施方式中，与化学发光标记共价连接的辅助物质是合成聚合物。。使用聚合物辅助物用于连接化学发光化合物的测定形式能够通过共价键比如生物素-亲合素共轭物而连接于分析物特异性结合伴侣，，或者通过使用通用捕捉成分比如种类特异性免疫球蛋白的间接附着来连接。在优选的实施方式中，化学发光标记sbp包括辅助物，该辅助物选自多糖或可溶性自组装(self-assembling)蛋白质。在一些实施方式中，化学发光标记sbp包括多糖，比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在一些实施方式中，多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷有IOkDa到500kDa的平均分子量。在另外一些实施方式中，有25 150kDa的平均分子量。在进一步的实施方式中，化学发光标记sbp包括平均分子量为50-100kDa的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在更进一步的实施方式中，化学发光标记sbp包括平均分子量为70kDa的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。
在许多实施方式中，化学发光标记sbp的平均直径在5nM到SOOnM的区间内。在优选的实施方式中，包含可溶性蛋白质、或其他可溶性自然或合成聚合物、或它们的组合物，化学发光标记sbp的平均直径在200nM到600nM的区间内；在进一步的实施方式中，在300nM 到500nM的区间内。
活化剂标记(的)sbp
本发明的方法要求使用连接于第一个特异性结合伴侣的活化剂化合物(活化剂标记sbp) ο在本发明公开的测定和方法中，活化剂标记的sbp可溶于水溶液。在本公开的测定和方法中，不同于在其他亲合性测定和方法中看到的那样，活化剂化合物不固定在诸如微粒、多微孔板、膜片、滤纸、试管、试纸、移液吸头等固体表面。活化剂标记sbp包括一个活化剂标记化合物和一个特异性结合配对。在一些实施方式中，一个活化剂标记sbp中含有一个以上活化剂化合物。在一些实施方式中，一个活化剂标记sbp中含有一个以上特异性结合配对成员的拷贝。在一些实施方式中，一个活化剂化合物直接连接一个以上特异性结合配对的拷贝。在一些实施方式中，一个以上活化剂标记化合物直接连接一个特异性结合配对成员的拷贝。直接连接，也称为直接标记，包括共价结合作用，离子结合作用，疏水作用。在一种实施方式中，活化剂标记与分析物特异性结合伴侣共价连接
在一些实施方式中，活化剂标记化合物间接连接一个以上特异性结合配对成员的拷贝。在另一些实施方式中，一个以上活化剂标记化合物间接连接特异性结合配对成员的一个拷贝。间接连接在活化剂标记化合物和特异性结合配对成员之外包括辅助物。辅助物通常可溶于水溶液。含有一个以上辅助物的活化剂标记sbp可溶于水溶液。在不同的实施方式中，辅助物包括可溶性蛋白质，例如链霉亲合素，亲合素，中性亲合素，生物素，阳离子化BSA，fos蛋白，jim蛋白，匙孔血蓝蛋白〃 KLH"，合成或天然的免疫球蛋白及其片断或部分，可溶的合成树状聚体(如PAMAM)，可溶的合成聚合物(如聚丙烯酸“PAA”)，可溶的天然聚合物，如功能化右旋糖苷，氨基右旋糖苷的多糖，低聚核苷酸，蛋白质，及其组合物，脂质体，胶束，泡囊，及一个以上可溶合成聚合物，可溶天然聚合物和可溶性蛋白质的组合物(如免疫球蛋白G/生物素/链霉亲合素/PAA)。其他可溶于水溶液并能使一个以上化学发光标记化合物，特异性结合伴侣附着的辅助物，预想可以应用在本发明和方法中。在一些的实施方式中，活化剂标记共价连接的辅助物是蛋白质或肽。例举的可溶蛋白质包括白蛋白、亲合素、链霉亲合素、α螺旋蛋白、fos蛋白、jim蛋白、匙孔血蓝蛋白“KLH”、合成或天然的免疫球蛋白及其片段或部分、及它们的任意组合物。在一种实施方式中，辅助物是通用抗体比如IgG，其中活化剂标记与通用抗体通过可维持分析物特异性捕捉抗体的结合亲合力的方式共价连接。在另一个活化剂标记sbp实施方式中，活化剂经由生物素-链霉亲合素或生物素-中性亲合素的结合而连接一个以上sbp。当活化剂处于链霉亲合素共轭时，活化剂标记sbp与链霉亲合素-生物素的结合或相当的连接例活化剂如可以使特异性结合伴侣成为一个生物素共轭物。生物素-链霉亲合素的选择性排列 (arrangement)及类似的连接已为人所知。作为选择，活化剂标记sbp与链霉亲合素-生物素的结合或相当的连接可以利用用于sbp或活化剂与一个以上附加的辅助物之间附着的连接。在另一种实施方式中，与活化剂标记共价连接的辅助物质是合成聚合物。。使用聚合物辅助物用于连接活化剂化合物的测定形式能够通过共价键比如生物素-亲合素共轭物而连接于分析物特异性结合伴侣，，或者通过使用通用捕捉成分比如种类特异性免疫球蛋白的间接附着来连接。在优选的实施方式中，活化剂标记sbp包括辅助物，该辅助物选自多糖或可溶性自组装(self-assembling)蛋白质。在一些实施方式中，活化剂标记sbp包括多糖，比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在一些实施方式中，多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷有 IOkDa到500kDa的平均分子量。在另外一些实施方式中，有25 150kDa的平均分子量。在进一步的实施方式中，活化剂标记sbp包括平均分子量为50-100kDa的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在更进一步的实施方式中，活化剂标记sbp包括平均分子量为70kDa 的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。平均分子量在70kDa。
在大部分实施方式中，活化剂标记sbp的平均直径在200kDa到3000kDa的范围内。在一些的实施方式中，活化剂标记sbp的平均分子量在350kDa到1500kDa。 活化剂标记活化剂化合物形成了被活化剂标记的sbp的一部分，其还可以被认为是活化剂特异性结合成员共轭物。被活化剂标记的Sbp具有双重作用1)在测定中，通过特异性结合伴侣部分直接地或者通过中间的特异性结合伴侣而特异性地经受与分析物含量成比例的特异性结合反应，和2~)通过活化剂部分激活化学发光化合物。被活化剂标记的sbp的活化剂部分是具有活化化学发光化合物的效果的化合物，使得当存在引发剂溶液时产生化学发光。能够用作活化剂标记的化合物包括具有过氧化物酶类活性的含有过渡金属盐和复合物以及酶的化合物，尤其是含有过渡金属的酶，更尤其是过氧化物酶。在活化剂化合物中有用的过渡金属包括周期表中第3-12族的那些过渡金属，尤其是铁、铜、钴、锌、锰、铬、以及钒。可以经受化学发光反应的过氧化物酶包括，例如乳过氧化物酶、微小过氧化物酶、髓过氧化物酶、商素过氧化物酶、钒溴过氧化物酶、辣根过氧化物酶、真菌的过氧化物酶、木质素过氧化物酶和来源于Arthromyces ramosus的过氧化物酶、以及在白腐真菌中产生的Mn依赖性过氧化物酶、以及大豆过氧化物酶。其他已知并不是酶、但是具有过氧化物酶状活性的仿过氧化物酶的化合物包括铁复合物，比如亚铁原卟啉、以及 Mn-TPPS4 (Y. -X. Ci, et al. , Mikrochem. J. ,52 :257-62 (1995))。上述这些物质可催化底物的化学发光氧化，并且应明确地认为包含于在此使用的过氧化物酶含义的范围内。在一些实施方式中，在用于产生化学发光的方法中，被活化剂标记的sbp可以包括过氧化物酶和生物分子的共轭物或复合物，唯一的附带条件是该共轭物可显示出过氧化物酶活性或过氧化物酶状活性。可以结合于一种以上过氧化物酶分子的生物分子包括 DNA、RNA、低聚核苷酸、抗体、抗体片段、抗体-DNA嵌合体、抗原、半抗原、蛋白质、肽、凝集素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和生物素。还可以在本发明公开的方法中使用包含或者结合过氧化物酶的复合物，比如脂质体、胶束、泡囊和因连接生物分子而具功能化的聚合物。
选择性信号抑制剂(SSIA)本发明的选择性信号抑制剂是这样的化合物当其被包括在包含游离的和/或被分析物结合的化学发光标记的sbp、游离的和/或被分析物结合的被活化剂标记的sbp、增强剂和引发剂溶液的测定反应混合物中时，从被分析物结合的标记Sbp成员得到的信号超过背景信号的程度显著地大于没有SSIA时发生的超出程度。反应方法中存在的一种以上选择性信号抑制剂的浓度在10_6M和IO4M之间、常常在lO—M和IOl之间、经常在IOl和之间、有时在IOl和IO4M之间。在一些实施方式中，在根据本发明方法的反应中选择性信号抑制剂存在的浓度在和切10_%之间。在更进一步的实施方式中，在根据本发明方法的反应中选择性信号抑制剂存在的浓度在 5x1 (T5M 禾口 5x104M 之间。选择性信号抑制剂能够被作为单独的试剂或者浓度比在待进入的反应溶液中更高的溶液提供。本实施方式中，实测量的工作溶液被定量加入反应溶液中，以达到期望的反应浓度。在另一个实施方式中，选择性信号抑制剂被合并进入含有一种或多种被标记的sbp 成员的溶液中。在另一个实施方式中，选择性信号抑制剂被作为引发剂溶液的组分提供。选择性信号抑制剂提高信噪比的程度将依据化合物的一致性和使用时的浓度、连同其它因素而改变。该程度能够被作为提高倍数的术语，其中该倍数为在特定的分析物浓度下通过使用选择性信号抑制剂而进行的测定中的信噪比与在相同的分析物浓度下在不含选择性信号抑制剂情况下进行的测定中的信噪比相比较的倍数。提高倍数> 1是改进的测定方法的量规和选择性信号抑制剂的有益效果的证据。在本发明的实施方式中，可取得至少2比如至少5、并包括至少10、或至少50的提高倍数。参照下述实施例，将可看到，提高倍数能够在测定范围内作为分析物浓度的函数而改变。例如，提高倍数可以随着分析物浓度增加而提高。在另一个实施方式中，提高倍数随浓度的变化可以导致较为线性的校准曲线，即化学发光强度对分析物浓度的曲线。下面的表中列出了，但不限于，能够有效地具有选择性信号抑制剂功能的化合物。 利用本发明的公开教导，包括测定法的常规应用和在实施例中描述的筛选试验方法，能够找到未明确叙述的另外的化合物。
表1.选择性信号抑制剂
权利要求
1.一种测定样品中分析物的方法，该测定方法包括通过以任何次序或同时加入下列物质，在水溶液中形成反应混合物样品，化学发光标记的特异性结合伴侣，活化剂标记的特异性结合伴侣，和选择性信号抑制剂，其中所有成分皆可溶于水溶液，其中所述化学发光标记的特异性结合伴侣和所述活化剂标记的特异性结合伴侣可与样品中的分析物相结合，形成结合性复合体。在反应混合物中加入引发剂溶液，其中引发剂溶液可释放出一种可检测的化学发光信号，该信号与反应混合物中与分析物结合的化学发光标记的特异性结合伴侣及活化剂标记的特异性结合伴侣的量相关。
2.如权利要求1所述的测定样品中分析物的方法，其特征在于，以任何次序或同时加入从而形成反应混合物的物质进一步包括增强剂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述选择性信号抑制剂可引起，在具有分析物的复合体中化学发光标记与活化剂标记之间的反应所产生的信号比率，超过不在这样的复合体中时化学发光标记与活化剂标记之间的反应所产生的信号比率。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述选择性信号抑制剂选自下组在邻位或对位有至少两个羟基的芳香化合物，在邻位或对位有至少一个羟基和一个氨基的芳香化合物，在C-C双键上有至少两个取代的羟基的化合物，以及氮杂环化合物。
5.如权利要求1到4中任一项所述的方法，其特征在于，所述选择性信号抑制剂选自下组抗坏血酸，异抗坏血酸，Trolox, L-抗坏血酸6-棕榈酸酯，5,6-异亚丙基-L-抗坏血酸，BHT,谷胱甘肽，尿酸，生育酚，儿茶酚。
6.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于，所述化学发光标记的特异性结合伴侣包含直接或间接地连接于特异性结合配对成员的化学发光标记化合物，其中所述化学发光标记选自下组芳香环二酰基胼，三羟基芳香化合物，9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫代缩醛化合物，9，10- 二氢化吖啶酯，9，10- 二氢化吖啶硫酯，9，10- 二氢化吖啶磺胺，9， 10- 二氢化吖啶硫醇衍生物，以及下述化学式VI所示的化合物，其中R1选自烷基，链烯基，炔基，具有1到20个碳原子的芳烷基，其中任意一个碳可以被选自下组的1-3个基团取代羰基，羧基，三(C1-C8烷基)甲硅烷基，SO3-基团，0S03_2 基团，糖基，PO3-基团，OPCV2基团，卤素原子，羟基，硫醇基，氨基，季铵基，或季鳞基；X选自 C1-C8烷基，芳基，芳烷基，具有1-20个碳原子的烷基或芳基羧基，三(C1-C8烧基)甲硅烷基， SO3-基团，糖基，三烷基甲硅烷基，碱金属阳离子，碱土金属阳离子，铵基，三烷基鳞阳离子和由式P0(0R' ) (OR")所示的磷酰基，其中R'和R〃独立地选自=C1-C8烷基，氰烷基，芳基和芳烷基；Z1和Z2分别选自0或S原子；R2和R3独立地选自氢和C1-C8烷基。
7.如权利要求1到6中任一项所述的方法，其特征在于，所述化学发光标记的固定化特异性结合成员包含直接或间接地连接于特异性结合成员的化学发光标记化合物，其中所述化学发光标记是下式所示的化合物，
8.如权利要求1到7中任一项所述的方法，其特征在于，所述活化剂标记的特异性结合伴侣包含直接或间接连接于特异性结合配对成员的活化剂标记，其中活化剂标记选自下组过渡金属盐，过渡金属络合物和酶，所述活化剂标记具有过氧化物酶活性。
9.如权利要求1到8中任一项所述的方法，其特征在于，所述活化剂标记化合物是过氧化物酶。
10.如权利要求1到9中任一项所述的方法，其特征在于，所述化学发光标记的特异性结合伴侣和活化剂标记的特异性结伴侣中的至少一个包含选自下组的辅助物质可溶性蛋白质，链霉亲合素，亲合素，中性亲合素，生物素，阳离子化牛血清白蛋白，fos蛋白，jim蛋白，可溶性合成树状聚合物，可溶性合成聚合物，可溶性天然聚合物，多糖，右旋糖苷，寡核苷酸，脂质体，胶束，以及泡囊。
11.如权利要求1到10中任一项所述的方法，其特征在于，增强剂是促进具有过氧化物酶活性的活化剂的催化周转的一种化合物或多种化合物的混合物。
12.如权利要求11中任一项所述的方法，其特征在于，所述增强剂选自下组酚类化合物，芳族胺，苯丙唑，羟基苯丙噻唑，芳基硼酸，及它们的混合物。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法中，其特征在于，所述引发剂溶液包含过氧化物化合物。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法中，其特征在于，所述引发剂溶液包含选自下组的增强剂酚类化合物，芳族胺，苯丙唑，羟基苯丙噻唑，芳基硼酸，及它们的混合物。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法中，其特征在于，所述化学发光标记的特异性结合伴侣和活化剂标记的特异性结合伴侣分别与样品中的分析物结合。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述化学发光标记的特异性结合伴侣包括连接于分析物类似物的化学发光标记，并且所述分析物和所述化学发光标记的类似物竞相与活化剂标记的特异性结合伴侣结合。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，所有成分皆可溶于水溶液。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其特征在于，没有成分直接或间接地共轭于微粒或其他固相。
19.一种用于检测样品中分析物的试剂盒，其包括分析物的第一个特异性结合伴侣，共轭于所述第一个特异性结合伴侣的化学发光化合物，分析物的第二个特异性结合伴侣，和共轭于所述第二个特异性结合伴侣的活化剂化合物，选择性信号抑制剂，以及引发剂溶液。
20.如权利要求19所述的试剂盒中，其特征在于，所有的成分皆可溶于水溶液。
21.如权利要求19-20中任一项所述的试剂盒，其特征在于，没有成分直接或间接地共轭于微粒或其他固相。
22.如权利要求19-21中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述选择性信号抑制剂选自下组在邻位或对位有至少两个羟基的芳香化合物，在邻位或对位有至少一个羟基和一个氨基的芳香化合物，在C-C双键上至少有两个取代的羟基的化合物，以及氮杂环化合物。
23.如权利要求19-22中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光化合物选自下组芳香环二酰基胼，三羟基芳香化合物，9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫代缩醛化合物， 9，10- 二氢化吖啶酯，9，10- 二氢化吖啶硫酯，9，10- 二氢化吖啶磺胺，9，10- 二氢化吖啶硫醇衍生物，下式VI所示的化合物，
24.如权利要求19到23中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述活化剂化合物选自过渡金属盐、过渡金属络合物和酶，所述活化剂标记具有过氧化物酶活性。
25.如权利要求19-24中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述引发剂溶液包含选自下组的过氧化物过氧化氢，过氧化脲，过硼酸盐。
26.如权利要求19-25中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述引发剂溶液包含选自下组的增强剂酚类化合物，芳族胺，苯丙唑，羟基苯丙噻唑，芳基硼酸，及它们的混合物。
27. 一种用于进行权利要求1所述测定方法的系统，其包括 将样品输送到反应混合物中的液体处理系统，将化学标记的特异性结合伴侣、活化剂标记的特异性结合伴侣、选择性信号抑制剂输送到反应混合物中的液体处理系统，将引发剂溶液输送到反应混合物中以便释放化学发光信号的液体处理系统，以及用以检测化学发光信号的检测系统，其中，用以输送引发剂溶液的所述液体处理系统与所述检测系统协调作用，以便在注入引发剂溶液时或注入后测量化学发光信号释放。
全文摘要
本发明公开了用于检测怀疑含有反应物的样品中反应物的方法、试剂、试剂盒和系统，其中所有的试剂皆可溶于水溶液。一种测定方法包括在反应物存在的条件下，处理怀疑含有反应物的样品，使活化剂达到反应构型，化学发光化合物将其激活。样品还被处理以减少与分析物不相关的信号。最后，用引发剂溶液处理该样品，借此由被激发的化学发光化合物产生光。没有试剂与某一表面或其他固相相连接。
文档编号G01N33/58GK102333886SQ201080009871
公开日2012年1月25日 申请日期2010年2月26日 优先权日2009年2月27日
发明者B·厄德戈德, D·宾格, H·阿哈万·塔夫狄, J·门多萨, M·萨尔瓦蒂, N·沙皮尔, R·德席尔瓦, T·麦克勒农, 谢文华, 陈英 申请人:贝克曼考尔特公司