专利名称：一种不同季节堆肥中酶的测定方法
技术领域：
本发明属于环境保护技术领域，涉及不同季节堆肥中的酶的种类和性质，筛选出酶活性较高的，微生物生长发育较好季节时期的堆肥菌种。
背景技术：
堆肥化(composting)是利用自然界广泛存在的微生物(细菌、放线菌、真菌等) 或商业菌株，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质〔humicsubstance，HS) 转化的生物化学过程。这一过程也是地球表面生态过程的一部分，它参与地球表面的物质和能量循环。在人为控制条件下，通过堆肥化可以将固体废物中的有机物转化成为有机肥料一堆肥(compost)，这种有机肥料作为堆肥化的最终产物，不仅性能稳定，并且对环境的危害甚小。因此，堆肥化是固体废物，尤其是城市生活垃圾无害化、稳定化和资源化的有效途径之一。堆肥化发展至今，已经历了漫长的历史，对其产生和发展的历史过程进行回顾和分析，可为今后开发新的堆肥工艺技术提供理论和实践上的借鉴和帮助。陈世和等(1989)采用垃圾培养基，在城市生活垃圾堆肥处理过程中，温度达 45°C和55°C时，对堆肥菌株进行分离，发现在45°C时曲霉菌[Aspergillus]、芽孢杆菌属[Bacillus]、假单孢菌属[Pseudomonas]禾Π 芽孢乳杆菌属[Sporolactobaci Ilus] 等是堆肥中的优势菌群。而到55°C时则有所不同，除了芽孢杆菌属[Bacillus]和假单孢菌属Pseudomonas]仍然为优势菌群外，乳酸杆菌属[LactcAacilIus]、链球菌属 [Streptococcus]和小单孢菌[Micromonospora]属则成为新的优势菌群，替代了其它种微生物，表明在堆肥化过程中，微生物种群处在一个不断变化的动态平衡之中。从城市生活垃圾中分离出大量参与高温好氧堆肥的微生物，经鉴定分别为芽孢杆菌属、假单孢菌属，乳酸杆菌属、葡萄球菌属、埃希氏菌属等5属细菌；曲霉属，毛霉属、红曲霉属，青霉属、地霉属、霉属、脉孢苗属、头孢霉属等8属霉菌；链霉菌属1属放线菌；酵母菌属，裂殖酵母菌等2属酵母菌。该研究结果有力地促进了对垃圾堆肥中微生物的研究和利用。Hassen (2001)对城市垃圾堆肥过程诶生物变化的调查发现，分解有机物产生的高温引起微生物群落的重要变化，使致病菌、酵母菌及中温菌大量减少，而产芽孢的杆菌大量存在，在堆肥过程中，高温阶段初期和中文阶段细菌均占主要地位。马文漪等也报道了嗜热真菌，嗜热褐色放线菌等参与垃圾堆肥的微生物种群。从城市生活垃圾中有机物的组成来看，而被微生物所分解利用。但各种微生物对各种物质的分解能力和分解速度是不尽相同的，不同温度下(中温、高温)堆肥过程中出现的微生物种群和数量上亦截然不同。近期的相关文献及实际生产表明目前如何提高城市生活垃圾堆肥处理的技术水平、提高处理效率、改善产品质量，一直是相关科研人员所重点关注的研究内容；在堆肥物料中针对特定物质有目的的添加一些人工微生物制剂，已经被很多研究所证实是可以加快堆肥腐熟，提高堆肥效率的方法。考虑到在很多研究和生产实践中，合理配比的复合菌剂往往较单一菌株更具好的效果，于是如何将堆肥中提取和筛选出来的各种功能菌株结合起来开发高效堆肥复合菌剂，从根本上优化和合理配制使用城市垃圾堆肥基质便成了相关科研人员研究的热点问题。尽管植物接种微生物的效应研究报道较多，但大部分研究工作涉及的微生物菌剂只限于从土壤中提取。生活垃圾堆肥化是利用自然界广泛存在的微生物(细菌、放线菌、真菌等)或商业菌株，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定腐殖质转化的生物化学过程，是由群落结构演替非常迅速的多个微生物群体共同作用而实现有机废弃物资源化、无害化的动态过程。研究表明，单一的细菌、真菌、放线菌群体，无论其活性多高，在加快堆肥化进程中的作用都比不上复合微生物菌群的共同作用。Ros和Wrez-Piqueres等人研究了接种外源微生物复合菌剂对堆肥化过程中微生物的影响，有利于了解堆肥过程的生物化学过程及加入微生物制剂对堆肥的影响。近年来国内外学者对堆肥过程中的微生物现象进行了一系列理论和实践研究，Vaz-Moreira等人对堆肥中细菌的群落多样性进行分析，以期深入认识堆肥过程的本质，为堆肥技术和工艺的研究提供理论基础。但在复合微生物菌剂研究过程中，有关堆肥内部微生物种类的鉴定和分类，堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性，以及将堆肥微生物菌剂应用于正常条件下对植物生长的影响方面，相关研究也鲜为报道。而有关堆肥内部微生物种类的鉴定和分类，堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性，以及从城市生活垃圾堆肥中提取筛选和配制堆肥复合有益微生物菌剂，对草坪植物生长、生理特性的影响方面的研究还未见报道。随着城市发展的不断加快，生活垃圾产生量也与日俱增，如何有效处理这些垃圾成为一个亟待解决的社会问题。垃圾堆肥法在消纳城市生活垃圾的同时，还可以起到腐殖质源、补充土壤损失的营养成分，提高土壤肥力，改善土壤环境及向植物提供各种基本微量元素的作用。尽管这些研究为垃圾堆肥其理化性质提供了理论依据，但从城市垃圾堆肥中存在的酶的种类和活性的角度与微域营养效应方面研究，国内外的报道目前还较少。如何利用这些固体废弃物自身的价值营养成分为人们所用，已经越来越所到关注。

发明内容
本发明通过在基于城市生活垃圾堆肥理化性质的研究的基础上，意在探索四个不同季节时期堆肥中的酶的种类和性质，筛选出酶活性较高的，微生物生长发育较好季节时期的堆肥菌种，一方面为生活垃圾堆肥在微域营养效应方面研究提供依据，另一方面为生活垃圾堆肥中提取出的微生物菌种在草坪建植体系中的安全有效利用提供科学依据。为实现上述目的本发明公开了如下的技术方案
一种不同季节时期堆肥中酶的测定方法，其特征在于分别在春、夏、秋、冬四个不同季节时期采集(T20cm的新鲜堆肥样，将采集的堆肥样品，放在荫凉处，摊开晾干，然后剔出植物残体，石块和其它的杂物，过2-5mm筛孔的土样用来测定堆肥中的酶活性包括
(1)不同季节时期堆肥蔗糖酶活性的变化取0、l、2、3、4、5、6、7ml葡萄糖工作液，分别注入50ml容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线；对同一个堆肥标准地的不同季节的取样测定的基质蔗糖酶取均值，分别和土壤中的蔗糖酶变化对比；
(2)不同季节时期堆肥多酚氧化酶或过氧化物酶活性的变化取0.75gK2Cr207溶于1L0. 5N的HCl (相当于50ml乙醚中含5mg紫色没食子素)；取重铬酸钾标准溶液，用0. 5N HCl稀释成各种不同浓度；定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定；以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线；
(3)不同季节时期堆肥脲酶活性的变化取0、1、3、5、7、9、11、131111氮工作液，移于501111 容量瓶中，然后加蒸馏水至20mL ；再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇勻， 20min后显色，定容，Ih内在分光光度计上于波长578nm处比色，根据吸光值与氮溶液浓度绘制标准曲线。本发明更加详细的制备方法如下 1材料与方法
1. 1试验供试堆肥
分别在四个不同季节时期(春季，夏季，秋季和冬季)采集天津市六里台实验基地试验地(T20cm的新鲜堆肥样，将采集的堆肥样品，放在荫凉处，摊开晾干，然后剔出植物残体， 石块和其它的杂物，过2-5mm筛孔的土样用来测定堆肥中的酶活性。1.2测定指标与方法
测定指标包括不同颗粒粒径堆肥的容重、PH值、孔隙度、饱和含水量、有机质含量、全氮 (TN)、全磷(TP)、全钾(TK)。垃圾堆肥的容重采用重量法；pH值采用pHS-3C型pH计测定。孔隙度采用比重(重量法测定)和容重比值法，依照如下公式进行计算 P^ = (I-ClAl1) X 100，式中P为孔隙度，Cl1为比重，d为容重；饱和含水量采用重量法，依照如下公式进行计算饱和含水量(%)=(原堆肥重量-烘干堆肥重量)X100/烘干堆肥重量； 以上测定方法均参照土壤农化分析方法(鲍士旦，2000)
有机质采用浓硫酸浴外加热重铬酸钾氧化法；全氮采用浓硫酸-高氯酸消煮，半微量凯式定氮法(鲍士旦，2000);全磷、全钾含量的测定以3 ml H2SO4, 7 ml而03和21 ml HCl在 120 140°C下分别对称取的0.5 g垃圾堆肥和土样进行消化，当棕黄色的烟散尽后，再加入2 ml此104直到溶液变得澄清透明，然后将温度提高到150 160°C以除尽残余的HClO4, 最后加入1 ml HNO3和少量去离子水将消化物溶解，过滤后再用去离子水定容到25 ml，采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AEQ测定。1.3堆肥酶活性的测定方法
①蔗糖酶的测定采用硫代硫酸钠滴定法(严昶升，1988)。称取IOg过Imm筛的的风干土样于IOOml容量瓶中，并加入^iil甲苯在室温下放置15分钟，然后加入10ml20%的蔗糖和IOml磷酸盐缓冲液(pH5. 5)，仔细摇勻，并将瓶置于 37°C恒温箱中培养23小时之后，用热至38°C的水将瓶中混合物稀释至刻度(甲苯应浮在刻度之上)，充分混勻之后，再放入37°C恒温箱中培养1小时。培养结束后，过滤。吸取20ml 滤液于IOOml三角瓶中，加入10啡啉溶液和20ml蒸馏水后，将三角瓶至于沸腾水浴上10分钟，然后立即放在自来水流下冷却至25°C，向三角瓶中加入:3ml，33%碘化钾溶液和細1稀硫酸(1 :3)，最后用0. IN的硫代硫酸钠滴定。在到达终点前加入0. 5ml淀粉指示剂，滴定至蓝色刚刚消失为终点。并设无土对照和无基质对照。转化酶活性用M小时后单位土重的 0. IN硫代硫酸钠的毫升数表示。②脲酶的测定方法采用苯酚一次氯酸钠比色法(靛酚比色法)(严昶升，1988) 取IOg过Imm筛的土样于100容量瓶中，用甲苯处理后15分钟后，加入尿素和柠檬酸溶液(PH6. 7)，并仔细混合，并将容量瓶放入37°C恒温箱中培养M小时。培养结束后，用热至 38°C水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中，吸取Iml滤液于50ml 容量瓶中，加入IOml蒸馏水，充分摇荡，然后加入細1苯酚钠，仔细混合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现靛酚的蓝色，在光电比色计上用Icm 液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。同时设置无土对照和无基质对照。脲酶活性以 24小时后Ig堆肥中NH3-N的毫克数表示。③多酚氧化酶测定采用邻苯三酚比色法(严昶升，1988)
取Ig过Imm筛的风干土样置于50ml带磨口瓶塞的容量瓶中，加入邻苯三酚溶液， 摇荡混勻，于30°C恒温箱中放置3小时。培养结束后，往瓶中加入乙醚，用力摇荡多次，将紫色没食子素提取到乙醚相中直至获得无色的乙醚溶液，将萃取液合并至容量瓶中，用乙醚定容。然后在430nm下比色测定。另外设置无土对照和无基质对照，并且绘制标准曲线。④过氧化物酶采用的是邻苯三酚比色法(严昶升，1988)
取Ig过Imm筛的的风干土样置于50ml容量瓶中，然后加入10mll0%的邻苯三酚溶液， 仔细摇荡并将容量瓶至于30°C恒温箱中放置3小时，培养结束后，往瓶中加入乙醚至刻度， 用力摇荡多次，使紫色没食子素提取到乙醚相中，将着色的乙醚相于430nm波长下比色测定。同时设置无基质对照和无土对照，并绘制标准曲线。1.4数据统计与分析
数据统计与分析采用MICROSOFT EXCEL 2003和SPSS 11. 5分析软件进行处 2研制结果分析 2.1堆肥理化性质(见表1) 表1堆肥的理化性质
权利要求
1. 一种不同季节中堆肥酶的测定方法，其特征在于分别在春、夏、秋、冬四个不同季节时期采集的新鲜堆肥样，将采集的堆肥样品，放在荫凉处，摊开晾干，然后剔出植物残体， 石块和其它的杂物，过2-5mm筛孔的土样用来测定堆肥中的酶活性包括(1)不同季节时期堆肥蔗糖酶活性的变化取0、l、2、3、4、5、6、7ml葡萄糖工作液，分别注入50ml容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线；对同一个堆肥标准地的不同季节的取样测定的基质蔗糖酶取均值，分别和中的蔗糖酶变化对比；(2)不同季节时期堆肥多酚氧化酶或过氧化物酶活性的变化取0.75gK2Cr207溶于 1L0. 5N的HCl (相当于50ml乙醚中含5mg紫色没食子素)；取重铬酸钾标准溶液，用0. 5N HCl稀释成各种不同浓度；定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定；以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线；(3)不同季节时期堆肥脲酶活性的变化取0、1、3、5、7、9、11、131111氮工作液，移于501111 容量瓶中，然后加蒸馏水至20mL ；再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇勻， 20min后显色，定容，Ih内在分光光度计上于波长578nm处比色，根据吸光值与氮溶液浓度绘制标准曲线。
全文摘要
本发明公开了一种不同季节时期堆肥中酶的测定方法，其特征在于分别在春、夏、秋、冬四个不同季节时期采集0～20cm的新鲜堆肥样，将采集的堆肥样品，放在荫凉处，摊开晾干，然后剔出植物残体，石块和其它的杂物，过2-5mm筛孔的土样用来测定堆肥中的酶活性。本发明探索了四个不同季节时期堆肥中酶的种类和性质，筛选出酶活性较高的，微生物生长发育较好季节时期的堆肥菌种，一方面为生活垃圾堆肥在微域营养效应方面研究提供依据，另一方面为生活垃圾堆肥中提取出的微生物菌种在草坪建植体系中的安全有效利用提供科学依据。
文档编号G01N21/78GK102175681SQ20111003702
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月14日 优先权日2011年2月14日
发明者多立安, 王晶晶, 赵树兰 申请人:天津师范大学