专利名称：鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法
技术领域：
本发明涉及鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，尤其涉及一种通过水稻标志 性代谢物含量的变化鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，属于转基因植物的检测领 域。
背景技术：
人类基因组测序工作的完成后，基因功能的研究逐渐成为热点，现在已有一系列 的组学研究，代谢组学是众多组学中的一种，它是通过考察生物体系受刺激或扰动(如将 某个特定基因导入)，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门学科。 所谓代谢组是基因组的下游产物即终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常 功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子质量小于1000的内源性小分子。 植物代谢组学主要是通过研究植物细胞中的代谢组在基因变异或环境因素变化后的响应 变化，去研究基因型和表型的关系及揭示一些沉默基因的功能。大多集中在代谢轮廓或代 谢物指纹图谱上。2003年，Fiehn等人利用GC/MS技术通过对不同表型葫芦韧皮部的433 种代谢物进行代谢组学分析，结合化学计量学方法对这些植物的表型进行了分类，找到了 4 种在分类中起着相当重要作用的代谢物质苹果酸和柠檬酸、葡萄糖和果糖。最近，Arbona 等人利用非靶标的LC-MS和GC-MS代谢物轮廓谱，结合化学计量学方法对柑橘属和李属的 不同品种植物叶提取物进行了分型。随着各国转基因标识制度的相继建立和公众对转基因产品关注度的提高，截至 2009年底，我国批准发放了转基因棉花、番茄、矮牵牛、辣椒、番木瓜、水稻、玉米等植物的安 全证书。因此，对转基因检测技术的灵敏度和准确性提出了严格的要求，各种转基因检测技 术也就成了研究热点。常用的定性PCR检测技术仅鉴定筛选基因(如35S启动子、NOS终止 子、报告基因等)极易出现假阳性，已经不能满足转基因产品检测的要求。因为35S启动子 存在于天然花椰菜花叶病毒，NOS终止子存在于植物病毒Ti质粒中，抗生素类报告基因自 然界中也普遍存在。对于含有相同外源DNA的不同转基因作物，不能鉴别出转基因同属植 物是哪种转化事件，如Mon809和Mon810。对于复合性状的转基因杂交新品种，如最新获得 安全证书的由华中农业大学培育的高抗鳞翅目害虫转基因水稻品系转基因抗虫水稻“华恢 1号”与“珍汕97A”所配的杂交组合“Bt汕优63”。目前，全球还没有找到合适的品系特异 性检测手段。随着新技术和新仪器的出现，转基因检测技术得到了不断发展，当转基因产品 的化学成分较非转基因产品有很大变化时，利用色谱-质谱联用技术结合化学计量学方法 可以鉴别转基因产品。目前尚未发现有关利用转基因水稻C418-Xa21与非转基因水稻C418 的代谢物指纹图谱进行分型的专利。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用水稻的代谢物 含量变化鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，该方法能够准确的、快速的鉴别出转基因水稻和非转基因水稻；本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，包括(1)分别测定非转基因水稻 叶片和待检测水稻叶片的莽草酸和半乳糖醛酸的含量；(2)如果待检测水稻叶片的莽草酸 和半乳糖醛酸的含量相比非转基因水稻叶片的莽草酸和半乳糖醛酸的含量呈显著性下降， 则待检测水稻是转基因水稻。其中，所述的转基因水稻品系优选为转入了抗白叶枯病基因)Ca21和标记基因hpt 的水稻梗型恢复系C418(C418-Xa21)；所述的非转基因水稻是水稻梗型恢复系C418 ；其中， 转基因水稻C418-Xa21的构建方法可参考有关文献构建得到(李晓兵等经基因工程改良 的抗白叶枯病水稻梗型恢复系“C418-Xa21”及其杂交稻.生物工程学报，17卷4期，2001 年7月)。其中，所述的“显著性下降”是指莽草酸和半乳糖醛酸的含量有2倍或2倍以上的 下降(P<0.(^)；更优选的，当待检测水稻的莽草酸叶片的含量相比于非转基因水稻叶片 的草酸有3. 1倍的下降，待检测水稻叶片的半乳糖醛酸的含量相比于非转基因水稻叶片的 半乳糖醛酸有3. 6倍的下降，则待检测水稻为转基因水稻C418-Xa21。优选的，所述的非转基因水稻叶片和待检测水稻叶片为将水稻种子在限定条件下 人工培养生长达6周的叶片；所述的限定条件包括将水稻种子在30°C暗室中水中浸泡2 天，萌发后在人工气候培养箱中土培，光强度为365 μ EnT2iT1,光照时间为14h、温度为^°C， 暗培养时间为10h、温度为M°C。本发明首先利用溶剂萃取和分级分离获得转基因水稻品系不同类别代谢物；接着 应用气相色谱-质谱联用得到相应的代谢物指纹图谱；利用多维统计分析软件进行分析、 识别含量差异显著的代谢物；最后鉴定部分标志代谢物。试验结果发现，莽草酸和半乳糖醛 酸是转基因水稻品系的标志性代谢物，转基因水稻C418-Xa21相比于非转基因水稻C418， 其体内的两种代谢物莽草酸和半乳糖醛酸的含量有显著性下降(P < 0. 05)。为了验证以上 结论，本发明对12个批次的转基因水稻C418-Xa21叶片的莽草酸和半乳糖醛酸的含量进行 了检测，结果均发现，转基因水稻C418-Xa21叶片内的莽草酸和半乳糖醛酸的含量相比于 非转基因水稻C418均呈显著性下降，所以通过检测待检测水稻叶片莽草酸和半乳糖醛酸 的含量可以准确、快速的鉴别出待检测水稻品系是否属于转基因水稻。其中，如何测定水稻叶片内莽草酸和半乳糖醛酸的含量，本领域技术人员可按照 植物生理生化中的常规方法进行，作为参考，可采用以下技术手段包括利用溶剂萃取、分 级分离莽草酸和半乳糖醛酸；采用高效液相色谱或其它的方法测定所分离的莽草酸和半乳 糖醛酸含量。


图1转基因水稻C418_Xa21和非转基因水稻C418的PCR扩增及鉴定结果。图2分析不同水稻品系叶片的PCA评分示意图(□，C418_Xa21 ； Δ，C418)。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。一、试验材料1、转基因水稻植物C418_Xa21可按照文献所公开的方法构建得到(李晓兵等经 基因工程改良的抗白叶枯病水稻梗型恢复系“C418-Xa21”及其杂交稻.生物工程学报，17 卷4期，2001年7月)；2、非转基因水稻C418种子可通过商业途径购买得到，例如可购自辽宁农科院稻 作所或北方杂交梗稻研究中心；实施例1转基因水稻C418_Xa21和非转基因水稻C418的鉴定分别提取转基因水稻C418_Xa21和非转基因水稻C418的DNA，以所提取的DNA为 模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩增(该PCR扩增的体系组成和PCR扩增的具体条件可 参考文献方法李晓兵等经基因工程改良的抗白叶枯病水稻梗型恢复系“C418-Xa21”及 其杂交稻.生物工程学报，17卷4期，2001年7月)Pl 5' -CGATCGGTATAACAGCAAAAC-3‘
P2 5' -ATAGCAACTGATTGCTTGG-3‘转基因水稻C418_Xa21和非转基因水稻C418的PCR扩增及鉴定结果见图1。实施例2将转基因水稻C418_Xa21种子和非转基因水稻C418种子在30°C暗室中水中浸 泡2天，萌发后在人工气候培养箱中土培，光强度为365 μ E HT2iT1,光照时间为14h、温度为 ^°C，暗培养时间为10h、温度为；采集转基因水稻C418-Xa21和非转基因水稻C418 人工气候培养箱培养生长至6周鲜叶约lOOmg，放在加有一钢珠的2mL圆底离心管中，立 即液氮冷冻。随后将离心管放在液氮预冷的球磨仪适配器中进行25Hz，2min的震荡，在研 磨后的样品中加入水/甲醇(1 4)11^，然后在热混合仪中进行125011)111、41条件下提取 15min，重复提取两次，15000rpm，4°C离心30min，合并上清，并采用0. 22上m的微孔滤膜过 滤后取100 μ L进行真空浓缩干燥4h。然后加入40 μ L盐酸甲氧胺OOmg/mL溶于吡啶) 在热混合仪中进行250rpm，30°C孵育90min，最后加入60 μ L MSTFA. 1 % TMCS在热混合仪 中进行250rpm，37°C硅烷化反应30min，所有样品随机进样进行GC-MS分析。将获得的代谢 物指纹图谱元数据直接导入AMDIS2. 66进行处理获得.Elu和.Fin两种格式的数据文件， 再合并这两种格式的文件导入MPP 2.0统计分析软件进行PCA分析。获得ρ <0.05水平 的导致转基因水稻C418-Xa21 ( □)和非转基因水稻C418 ( Δ )分型的标志代谢物为莽草酸 (Shikimic acid)和半乳糖醛酸(Galacturonicacid)(图 2)。在此基础上，本试验测定了 12个批次的转基因水稻C418_Xa21叶中的莽草酸 (Shikimic acid)和半乳糖醛酸，试验结果见表1。试验结果发现，所测定的12个批次的转基因水稻C418_Xa21叶中的莽草酸 (Shikimic acid)和半乳糖醛酸含量相比于非转基因水稻C418均呈显著性下降(P < 0. 05, 其中，莽草酸的含量平均下降了 3. 1倍，半乳糖醛酸的含量平均下降了 3. 6倍。保留时间
类别
(min)
标志物分子式
变异趋势 [B] [C] [D] vs. [B] 26.22 33.73
莽草酸(shikimic C7H10O5 acid)C6H1208
半乳糖醛酸 (galacturonic acid)
|3.1 |3.6 丨or丨表示相对C418，C418_Xa21中物质的量变化的高低水平c
权利要求
1.一种鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，包括(1)分别测定非转基因水稻叶 片和待检测水稻叶片的莽草酸和半乳糖醛酸的含量；( 如果待检测水稻叶片的莽草酸和 半乳糖醛酸的含量相比于非转基因水稻叶片的莽草酸和半乳糖醛酸的含量呈显著性下降， 则待检测水稻是转基因水稻。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的转基因水稻是转入了抗白叶枯病 基因和标记基因hpt的水稻梗型恢复系C418 ；所述的非转基因水稻是水稻梗型恢复 系 C418。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于如果待检测水稻叶片的莽草酸和半乳糖 醛酸的含量相比非转基因水稻叶片的莽草酸和半乳糖醛酸的含量有2倍或2倍以上的下 降，则待检测水稻是转基因水稻。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于当待检测水稻叶片的莽草酸的含量相比 于非转基因水稻叶片的草酸下降了 3. 1倍，待检测水稻叶片的半乳糖醛酸的含量相比于非 转基因水稻叶片的半乳糖醛酸下降了 3. 6倍，则待检测水稻为转入了抗白叶枯病基因)Ca21 和标记基因hpt的水稻梗型恢复系C418。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的非转基因水稻叶片和待检测水稻 叶片是将水稻种子在限定条件下人工培养生长达6周的叶片。
6.按照权利要求6所述的方法，其特征在于所述的限定条件包括将水稻种子在 30°C暗室中水中浸泡2天，萌发后在人工气候培养箱中土培，光强度为365μΕ m_2 s—1，光照 时间为14h、温度为^°C，暗培养时间为10h、温度为。
全文摘要
本发明公开了一种鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，包括(1)分别测定非转基因水稻C418和待检测水稻限定条件下人工培养生长6周叶中莽草酸和半乳糖醛酸的含量；(2)如果待检测水稻的莽草酸和半乳糖醛酸的含量相比非转基因水稻的莽草酸和半乳糖醛酸的含量有显著性下降，则待检测水稻是转基因水稻C418-Xa21(含hpt)。本发明通过测定待检测水稻植株体内莽草酸和半乳糖醛酸的含量，再将其与非转基因水稻的莽草酸和半乳糖醛酸的含量进行对比，通过莽草酸和半乳糖醛酸的含量变化，就可快速、准确的将转基因水稻C418-Xa21(含hpt)与非转基因水稻C418鉴别出，具有准确性高、方法简捷、成本低等优点。
文档编号G01N30/02GK102081075SQ20101024836
公开日2011年6月1日 申请日期2010年8月9日 优先权日2010年8月9日
发明者吴娇, 彭明, 戴好富, 朱水芳, 梅文莉, 黄新 申请人:中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所, 中国热带农业科学院热带生物技术研究所