专利名称：快速定性与定量分析银杏制品中所含的活性成分的方法
技术领域：
本发明涉及一种用核磁共振光谱(1H NMR)来进行快速准确地定性与定量分析银杏制品中的活性成分的方法，特别是同时定量银杏内酯及黄酮醇类化合物的分析方法。
背景技术：
银杏(Ginkgo biloba L.)为一传统使用的中药，过去的研究显示，银杏叶所含的银杏内酯(Ginkgo terpene trilactones)及黄酮醇类(flavonols)为主要活性成分(参阅参考文献1～3)。较普遍的认定是原料药供货商所生产的银杏叶萃取物中所含的银杏内酯总量应在5.4～6.6％以上，黄酮醇类总量应在21.6～26.4％以上。
针对银杏内酯的分析方法主要以高效液相色谱仪(HPLC)配合紫外光检测器(UV)或折射率检测器(RI)作为主要分析工具(参阅参考文献4～6)，但分析样品须先经过前处理，除去可能的干扰物质，特别是黄酮醇类化合物。另外也有以气相层析仪(GC)配合火焰离子化检测器(FID)或质谱仪(MS)作为分析工具(参阅参考文献7～11)，同样必须先经过样品前处理，除去可能的干扰物质，并将欲分析的银杏内酯化合物修饰成挥发性较高的结构，以进行气相层析。此外也有人提出可以利用核磁共振光谱仪的分析方法。
针对黄酮醇类的分析则主要以高效液相色谱配合紫外光检测器为主要分析工具(参阅参考文献12)。
目前尚未有同时有效地分析银杏内酯及黄酮醇两类化合物的方法。

发明内容
由于银杏内酯及黄酮醇类化合物为市售银杏叶萃取物的主要活性成分(参阅参考文献3)，而这两类活性化合物尤其是银杏内酯，其在银杏叶中的含量会随着银杏的产地、品种、树龄以及银杏叶嫩、老、青翠、枯黄的情况，以及采收的季节等因素有很大的变化，所制造出的银杏萃取物中所含的银杏内酯及黄酮醇化合物的定量工作十分重要。
由于银杏内酯化学结构(图6所示)并没有明显的发色团(Cllromophore)，其在银杏叶中的含量极低，且分离纯化不易，容易被银杏叶中所含的其它具有强的紫外光吸收物质所存在的干扰，在过去分析此类化合物极为困难，必须先除去可能的干扰，特别是具有强紫外光吸收的黄酮醇类化合物，而该黄酮醇类化合物也是另一类需要定量分析的活性化合物。因此过去的方法是牺牲黄酮类化合物，只定量分析银杏内酯。样品前处理的方法通常是先经过管柱层析或固相吸附或超临界萃取法除去大部分可能的干扰物质，再进行高效液相色谱法定量分析，并配合改变检测器以提高灵敏度。若以气相层析仪分析时则须经过结构修饰以提高挥发性(参阅参考文献7～11)。这些方法都有灵敏度低、基线(Baseline)不稳定、需要样品前置纯化或衍生化步骤及回收率不佳等等缺点。为改善这些缺点，以核磁共振光谱仪作为分析工具的分析方法也被提出(参阅参考文献13、14)，但同样也无法同时定量黄酮醇类化合物。
至于黄酮醇类化合物，由于其具有很好的发色团(如图6所示)，因此可很容易的藉由高效液相色谱配合紫外光检测器定量分析。但同样也由于银杏内酯化学结构上并没有明显的发色团，故无法同时定量银杏内酯化合物。
至今尚未出现有效、快速、准确的分析方法可同时定量银杏萃取物中所含的银杏内酯及黄酮醇类化合物。
由于核磁共振光谱法的特殊优点，包括快速、容易、再现性佳、不需衍生化以及可以不需要有高纯度分析标的物作为标准品，因此本发明也利用核磁共振光谱仪做为分析工具，经过简单的水解步骤，以不同的氘化溶剂组合做为测试溶剂，同时定性与定量分析银杏内酯及黄酮醇类化合物。
所欲分析的银杏内酯化合物的化学结构有共同的特征质子H-12，由于H-12的邻近取代基构造有些微不同，导致在核磁共振光谱中有不同的化学位移，因此可藉由在核磁共振光谱中H-12的化学位移来区分不同的银杏内酯，而且由于结构的特殊性，H-12的化学位移分布在5.8～6.4ppm之间，在核磁共振光谱中此区段一般是比较不拥挤的区域，因此受到其它化合物的质子讯号干扰较少。而黄酮醇化合物同样具有特征性的质子H-2’，同样由于邻近取代基的不同，不同黄酮醇的H-2'质子也会呈现不同的化学位移，可藉此区分不同的黄酮醇化合物。但是在银杏叶萃取物中所含有的黄酮醇化合物种类非常多，要将所有黄酮醇类化合物的H-2’质子区分开来非常困难，而且讯号也会互相干扰，逐一定量这些化合物在实际应用上也没有太大意义。仔细分析这些黄酮类化合物的化学结构发现，这些化合物大都是以山萘酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)及异鼠李素(isorhamnetin)为骨架，在C-3位置上有不同的醣基取代而成。因此若将这些醣取代基以水解方式处理，则应可得到对应的山萘酚、槲皮素及异鼠李素。如此原本十分复杂多样的黄酮醇类化合物藉由水解可减少至3种主要的黄酮醇。因此在7.8～8.8ppm之间的H-2’特征讯号区域会因为少有其它化合物的质子干扰呈现较为干净的部分，可用来做为区分3种不同黄酮醇的特征区域。如此经过简单的水解步骤将可使利用核磁共振光谱仪同时定量银杏内酯及黄酮醇两类化合物成为可能。
由于银杏萃取物的水解产物中仍含有非常多的其它成分，这些成分可能会干扰到欲分析的标的讯号，且所欲分析的标的讯号相互之间也可能会彼此干扰，因此在测试溶剂的选择上必须仔细考虑。为了将水解产物中所有的成分均溶解，以免造成定量上的不准确性，如氘化甲醇、氘化二氧亚砜、氘化吡啶等高极性溶剂的选择是必要的。另外为了将所欲分析的标的讯号彼此分开或与其它干扰物质子讯号分开，必须藉由如氘化苯、氘化甲苯或氘化吡啶等芳香族溶剂(aromatic solvents)所表现的溶剂效应，对结构相类似的化合物的影响不同，选择以不同比例与高极性氘化溶剂混合，藉以得到较佳的测试溶剂条件(参见图2和图3)。
此外，为定性与定量分析银杏内酯及黄酮醇类化合物，必须选择一适当的内标准品。该内标准品必须具有高纯度且稳定，具有特征吸收讯号且不被分析样品中的成分干扰等条件。将各种不同量欲分析的化合物的标准品添加定量的内标准品，以选择的适当溶剂条件进行核磁共振光谱扫描，以标的讯号与内标准品特征讯号的积分比值对浓度作图，来求得各欲分析物的检量线(见图4)。
为减少核磁共振光谱图中其它化合物的干扰讯号，藉由欲分析成分对不同溶剂的溶解度不同，再以不同的溶剂萃取以除去更多的干扰物质，使核磁共振光谱的干扰降低。银杏萃取物经水解后，以不同溶剂萃取，所得的活性成分部分添加定量的内标准品，以选择的氘化溶剂系统做为测试溶剂，进行核磁共振光谱扫描，并以检量线求得各活性成分的含量。
本发明实际的进行方法(如图1)是将市售银杏萃取物或银杏产品以不同的温度进行水解，通常是利用强酸水解，所得的水解产物利用活性成分如银杏内酯及黄酮醇类化合物对有机溶剂的溶解度不同，进行分配分离。先以低极性有机溶剂与水进行分配萃取除去较低极性的其它成分，再以中等极性溶剂与水进行分配萃取，得到含活性成分的萃取层部份。所得的活性成分部分添加定量的适当内标准品，如1，3，5-三甲氧基苯(如图6所示)等，并以选择的氘化溶剂系统做为测试溶剂，进行核磁共振光谱扫描，并以检量线求得各活性成分的含量。
本发明的目的在于提供一种快速定性与定量分析银杏制品中所含的活性成份的方法，以达到同时定量银杏内酯及黄酮醇类化合物的分析的目的。
本发明提供一种快速定性与定量分析银杏制品中所含的活性成份的方法，主要是针对银杏中所含银杏内酯及黄酮醇类化合物的定性与定量分析方法，其包含(a)以银杏内酯的H-12及黄酮醇的H-2’做为核磁共振光谱法测量银杏制品活性成分的标的讯号；(b)以芳香族溶剂具有明显溶剂效应的氘化溶剂及各种高极性溶剂混合的氘化溶剂系统做为核磁共振光谱法测量银杏制品的溶解与测试溶剂；(c)以苯取代化合物作为核磁共振光谱法测量银杏制品的内标准品；(d)以各种浓度及温度的组合的强酸水解后，以核磁共振光谱法同时定性与定量分析以测量银杏制品的银杏内酯及黄酮醇类化合物。
本发明所提供的方法藉由利用核磁共振光谱(1H NMR)，可快速准确地定性与定量分析银杏制品中的活性成分。
上述快速定性与定量分析银杏制品中所含的活性成份的方法，其中，该芳香族溶剂为氘化苯、氘化甲苯及氘化吡啶；该高极性溶剂为氘化甲醇、氘化丙酮、氘化二氧亚砜及氘化吡啶；该苯取代化合物为1，3，5-三甲氧基苯。
本方法最大效益在于可同时定量银杏萃取物中所含的活性成分包括银杏内酯(白果内酯(bilobalide)，银杏内酯A(ginkgolide A)，银杏内酯B(ginkgolide B)，银杏内酯C(ginkgolide C)，银杏内酯J(ginkgolideJ))及黄酮醇(山萘酚(kaempferol)，槲皮素(quencetin)，异鼠李素(isorhamnetin))化合物，而只需要经过简单的水解步骤就可达成，不需要牺牲黄酮醇类化合物来分析银杏内酯，或是为了分析黄酮醇类化合物而无法检测银杏内酯。而且不需经过柱层析或固相萃取或超临界流析等等预纯化方法，可减少在前置纯化过程中欲分析成分的流失，避免再现性不佳及回收率低的缺点。也不需要经过衍生化反应导致产率不固定造成分析结果的不准确。且核磁共振光谱法本身的优点包括快速、再现性佳，且若仪器状况良好，欲分析物的标准品及检量线可不需要。


图l为本发明方法的简单流程示意图；图2为以不同氘化溶剂组合做为测试溶剂测定酸水解后的银杏萃取物的核磁共振光谱图，其中(A)氘化吡啶，(B)氘化二氧亚砜-氘化甲苯，(C)氘化二氧亚砜-氘化苯，(D)氘化甲醇-氘化甲苯，(E)氘化甲醇-氘化苯，(F)氘化甲醇；图3为以不同比例的氘化甲醇及氘化苯做为测试溶剂的酸水解后的银杏萃取物的核磁共振光谱图，其中(A)氘化甲醇-氘化苯(25∶75)，(B)氘化甲醇-氘化苯(50∶50)，(C)氘化甲醇-氘化苯(65∶35)，(D)氘化甲醇-氘化苯(75∶25)，(E)氘化甲醇；图4为各欲分析成分的标准品在氘化甲醇及氘化苯65∶35的比例做为测试溶剂所得的核磁共振光谱图，其中(A)白果内酯，(B)银杏内酯A，(C)银杏内酯B，(D)银杏内酯C，(E)银杏内酯J，(F)山萘酚，(G)槲皮素，(H)异鼠李素，IS内标准品(1，3，5-三甲氧基苯)；图5为各种市售的银杏萃取物经水解及分配萃取所得的部分以氘化甲醇及氘化苯65∶35的比例做为测试溶剂所得的核磁共振光谱图，其中(A)样品一，(B)样品二，(C)样品三，(D)样品四，(E)样品五，(F)样品六，(G)样品七，(H)样品八，(I)样品九，IS内标准品(1，3，5-三甲氧基苯)；图6为银杏内酯、黄酮醇类化合物及1，3，5-三甲氧基苯的化学结构。图中峰号说明1 白果内酯(bilobalide)2 银杏内酯A(ginkgolide A)
3 银杏内酯B(ginkgolide B)4 银杏内酯C(ginkgolide C)5 银杏内酯J(ginkgolide J)6 山萘酚(kaempferol)7 槲皮素(quencetin)8 异鼠李素(isorhamnetin)IS 内标准品，1，3，5-三甲氧基苯BB 白果内酯(bilobalide)gA 银杏内酯A(ginkgolide A)gB 银杏内酯B(ginkgolide B)gC 银杏内酯C(ginkgolide C)gJ 银杏内酯J(ginkgolide J)K 山萘酚(kaempferol)Q 槲皮素(quencetin)I 异鼠李素(isorhamnetin)具体实施方式
本发明以市售银杏萃取物的定量分析做为实例说明。
1、制作检量线以不同浓度的各欲分析物标准品加入一定量的内标准品(1，3，5-三甲氧基苯)，加入390μL氘化甲醇及210μL氘化苯做为测试溶剂进行核磁共振光谱分析(图4)。仔细积分各标准物的特征质子吸收讯号及内标准品的特征吸收讯号。以各标准物的标的讯号与内标准品的标的讯号的积分值比对浓度作图，得到各欲分析物的检量线。
表1白果内酯(bilobalide)、银杏内酯A(ginkgolide A)、银杏内酯B(ginkgolide B)、银杏内酯C(ginkgolide C)、银杏内酯J(ginkgolideJ)、山萘酚(kaempferol)、槲皮素(quencetin)、异鼠李素(isorhamnetin)的检量线(Calibration curve)。

2、精确称取50mg的市售银杏萃取物A，以30mL 5％ HCl水溶液加热回流30分钟，温度120℃。
3、反应回到室温加入30mL环已烷进行分配萃取，保留水层。重复3次。
4、加入30mL甲乙酮与水进行分配萃取，收集甲乙酮层。重复3次。
5、将所收集得的甲乙酮层减压浓缩至干，加入390μL氘化甲醇及210μL氘化苯，及一定量的内标准品，进行核磁共振光谱分析(图5)。仔细积分各标准物的特征质子吸收讯号及内标准品的特征吸收讯号，求得各标准物的标的讯号与内标准品的标的讯号的积分值。藉由检量线就可得到各欲分析成分的含量。
表2藉由核磁共振光谱法所测定的白果内酯(Bilobalide(BB))、银杏内酯A(ginkgolide A(gA))、银杏内酯B(ginkgolide B(gB))、银杏内酯C(ginkgolide C(gC))、银杏内酯J(ginkgolide J(gJ))、山萘酚(kaempferol(K))、槲皮素(quercetin(Q))及异鼠李素(isorhamnetin(I))在各种不同市售银杏萃取物中的含量(测量3次取平均值)

6、回收率试验精确称取3mg的各标准品，以30mL 5％HCl水溶液加热回流30分钟，温度120℃。依照步骤3.4.5.求得各欲分析成分的含量，并推算回收率。
表3白果内酯(Bilobalide)(BB)、银杏内酯A(ginkgolide A)(gA)、银杏内酯B(ginkgolide B)(gB)、银杏内酯C(ginkgolide C)(gC)、银杏内酯J(ginkgolide J)(gJ)、山萘酚(kaempferol)(K)、槲皮素(quercetin)(Q)及异鼠李素(isorhamnetin)(I)经盐酸水溶液加热回流30分钟后以环己烷及甲乙酮分配萃取所得的回收率(recovery)

本方法同时定量银杏萃取物中所含的活性成分包括银杏内酯(白果内酯(bilobalide)、银杏内酯A(ginkgolide A)、银杏内酯B(ginkgolide B)、银杏内酯C(ginkgolide C)、银杏内酯J(ginkgolide J))及黄酮醇(山萘酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)及异鼠李素(isorhamnetin))化合物，而只需经过简单的水解步骤就可达成。检量线的线性极佳，线性相关系数值0.999以上。得到的分析结果再现性极佳，变异值均控制在3.2％以内。回收率实验显示欲分析成分并不因为水解及萃取过程而产生变化。避免管柱层析或固相萃取或超临界流析等等预纯化方法，产生在前置纯化过程中欲分析成分的流失、再现性不佳及回收率低的缺点。也不需经过衍生化反应导致产率不固定造成分析结果的不准确。并同时定量银杏萃取物所含的活性成分包括银杏内酯(白果内酯(bilobalide)、银杏内酯A(ginkgolide A)、银杏内酯B(ginkgolide B)、银杏内酯C(ginkgolide C)、银杏内酯J(ginkgolide J))及黄酮醇(山萘酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)及异鼠李素(isorhamnetin))化合物。
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权利要求
1.一种快速定性与定量分析银杏制品中所含的活性成份的方法，为针对银杏中所含银杏内酯及黄酮醇类化合物的定性与定量分析方法，其包含(a)以银杏内酯的H-12及黄酮醇的H-2’做为核磁共振光谱法测量银杏制品活性成分的标的讯号；(b)以芳香族溶剂具有明显溶剂效应的氘化溶剂及各种高极性溶剂混合的氘化溶剂系统做为核磁共振光谱法测量银杏制品的溶解与测试溶剂；(c)以苯取代化合物作为核磁共振光谱法测量银杏制品的内标准品；(d)以各种浓度及温度的组合的强酸水解后，以核磁共振光谱法同时定性与定量分析以测量银杏制品的银杏内酯及黄酮醇类化合物。
2.如权利要求1所述的快速定性与定量分析银杏制品中所含的活性成份的方法，其中，该芳香族溶剂为氘化苯、氘化甲苯及氘化吡啶。
3.如权利要求1所述的快速定性与定量分析银杏制品中所含的活性成份的方法，其中，该高极性溶剂为氘化甲醇、氘化丙酮、氘化二氧亚砜及氘化吡啶。
4.如权利要求1所述的快速定性与定量分析银杏制品中所含的活性成份的方法，其中，该苯取代化合物为1，3，5-三甲氧基苯。
全文摘要
本方法提供一种快速定性与定量分析银杏制品中所含的活性成分的方法，其藉由核磁共振光谱仪(NMR)定性与定量分析银杏制品中所含的活性成分，特别是针对银杏中所含银杏内酯(Ginkgo terpene trilactones)及黄酮醇类(flavonols)的定性与定量分析方法。现有技术无法同时定性与定量分析该两类活性成分，本方法将银杏萃取物与制品水解后经由简易处理，再利用核磁共振光谱仪分析，以不同氘化溶剂系统同时定性与定量分析银杏内酯及黄酮醇类。本方法可快速且准确性高的应用在银杏制品的质量控制中，特别是同时针对银杏内酯(Ginkgo terpene trilactones)及黄酮醇类(flavonols)的定性与定量分析。
文档编号G01N33/02GK1763514SQ20041008604
公开日2006年4月26日 申请日期2004年10月22日 优先权日2004年10月22日
发明者吴天赏, 李佳颖, 王玉杯 申请人:南光化学制药股份有限公司