专利名称：凝胶粒子测定装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种凝胶粒子测定装置，该装置用于通过凝胶化反应使作为测定对象的试样中的内毒素和/或β -D-葡聚糖等目的物质粒子化之后再对其进行测定，特别是涉及一种试图高灵敏度地测定凝胶粒子开始出现的时间点的凝胶粒子测定装置。
背景技术：
所谓的内毒素，主要是不被采用革兰氏染色法染色的(革兰氏阴性)细菌类菌体的膜成分的一部分，其成分是被称为脂多糖的脂质多糖类。具体地，是由被称作脂质A(LipidA)的脂质和多糖链通过2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)结合而成的脂多糖(LPS)，其中含有的被称为脂质A (Lipid A)的脂质结构部分通过感染进入人体时，与细胞的受体相结合而引起炎症，在大多数情况下会引起各种各样的重度的临床症状。这样，内毒素是一种成为人类 中所谓败血症或菌血症等致死率非常高的临床症状的原因的物质，因此，对进入到体内的内毒素进行评估在临床上的要求很高。另外，药品(注射剂等)和医疗用具(血管导管等)等不被内毒素污染(无热原)是非常重要的，在使用细菌制备的药品(在重组蛋白质、基因治疗中使用的DNA等)和/或食品添加剂、化妆品等中，适宜除去或控制内毒素是不可缺少的。这种内毒素的除去确认或者急救医学中的计测，不仅要求测定的试样数多，而且还要求以救命治疗为目的的迅速性。为了治疗败血症等，测量内毒素值的研究很早就开始了，人们发现鲎(Limulus)的阿米巴样血细胞成分中所含的基因组与内毒素发生特异性反应而成为凝集块堵塞伤口，并据此尝试使用该鲎的水解物(Limulus Amebocyte Lysate (鲎的变形细胞溶解物)；LAL试剂或者鲎试剂)对内毒素进行定量测定。最初的使用鲎试剂的测定法，仅仅是将其与作为试样的患者血浆混合后静置，在一定时间后倒转过来，通过溶液的凝固来确认混合溶液是否凝胶化，根据引起凝胶化的最大稀释率来推算内毒素量，这就是被称为所谓凝胶化法的半定量的测定方法。随后，人们着眼于在凝胶化反应过程中浊度的增加，用采用光学测量方法的浊度计，根据伴随静置后的混合溶液的凝胶化反应的浊度变化来定量测定内毒素浓度，这是已知的比浊时间分析法。而且，还已知有发色合成底物法，该方法是将鲎试剂反应过程的最终阶段的凝固蛋白原(Coagulogen)转换为凝固素(凝固素)的凝胶化反应置换为合成底物的发色反应。该方法是通过加入发色合成底物(Boc-Leu-Bly-Arg-对硝基苯胺)来代替凝固过程中的凝固前体物质(凝固蛋白原)，在其水解中使对硝基苯胺游离，利用其黄色发色的比色测定内毒素浓度。进而，作为以往的凝胶化反应测定装置或者与其相关的测定装置，可举出例如专利文献I 3所示的装置。专利文献I虽然与凝胶化反应测定装置无关，但是能够随着血中的血小板凝集成块的长大过程，测定血小板凝块的大小和数目，从激光光源向试样池内的试样照射光，用光检测器检测在血小板上向90度侧方散射的散射光的一部分，基于该检测结果，测定血小板凝块的大小和数目。
另外，专利文献2涉及采用比浊时间分析法的凝胶化反应测定装置，测定由检品(试样)与鲎试剂混合而成的混合液的透射光强度的经时变化，根据规定时间内的变化量测定检品的内毒素浓度。而且，专利文献3涉及一种测定通过凝胶化反应测定的内毒素等的物质的浓度的凝胶化测定装置，其具有接受在试样池中生成的各个凝胶粒子的激光光束引起的散射光的受光元件、和基于上述受光元件的散射光检测输出，按时间系列计测凝胶粒子的直径和数量的计测装置。专利文献I 3均如下所述进行测定在来自激光光源的照射光中的试样池内散射的光中，检测与激光光源设置的侧不同的侧、例如向与激光光源相反侧的前方透射的前方散射光、或对激光光源向侧方散射的侧方散射光，基于该检测结果测定作为测定对象的血小板的凝块或内毒素浓度。进而，利用凝胶化反应的测定技术，不仅可以用于上述的内毒素的测定，而且也可以用于β-D-葡聚糖(β-D-glucan)等的测定。β-D-葡聚糖为构成具有真菌特征的细胞膜的多糖(多糖体)。通过测定该β -D-葡聚糖，不仅是诸如念珠菌、曲霉、或隐球菌这类的一般在临床上常见的真菌，而且在含有稀有真菌的广大范围内对真菌感染症的筛分等有效。在该β-D-葡聚糖的测定中，利用β-D-葡聚糖来使鲎的血细胞提取成分凝胶化，然后采用上述的凝胶化法、和/或比浊时间分析法、发色合成底物法来进行测定。内毒素和β-D-葡聚糖的测定方法具有共同点，例如，使用大致相同的测定硬件，通过从鲎的血细胞提取成分中除去与β-D-葡聚糖发生特异性反应的G因子(Factor G)成分，能够对内毒素选择性地测定凝胶化反应和/或发色反应，而且由于通过前处理使试样中的内毒素失活，因此能够对β -D-葡聚糖选择性地测定凝胶化反应和/或发色反应。现有技术文献专利文献专利文献I:日本专利第3199850号公报(实施例，图I)专利文献2:日本特开2004-93536号公报(发明的实施方式，图3)专利文献3:国际公开W02008/038329号(具体实施方式
部分，图I)

发明内容
发明要解决的课题但是，在以往的凝胶化法、比浊时间分析法及发色合成底物法中，存在下述缺点。凝胶化法及比浊时间分析法虽然均生成凝胶，但是在低浓度下，则需要约90分钟以上的长时间。即，反应溶液的凝胶化时间虽然与作为测定对象的试样中的目的物质的浓度呈比例，但由于凝胶化法及比浊时间分析法均由于灵敏度的问题而不能检测出准确的凝胶化开始时间等，因此，由至只能依据某种程度的凝胶化进行的时间来计算反应量，以该凝胶化时间作为基准。
例如以比浊时间分析法为例进行说明，比浊时间分析法是这样一种定量法，虽然通过制备试剂，变化开始时的最初浓度水平的浊度和变化达到目的时的浓度水平的浊度是知道的，但各种变化的开始时间和结束时间却很难知道，通过测定最初和最终的浓度水平之间的一定的浓度变化(浊度的增加)，转变为对凝胶化全体的变化观察，以此进行定量。但是，如果变成低浓度的内毒素，体系全体的凝胶化就会推迟，由此，所观测到的浊度变化也随之变慢，以致于难以测定。在此情况下，灵敏度必然变得迟钝。因此，很难说凝胶化法和比浊时间分析法都是适合于需要急救的情况或者可测定许多检品的方法。此外，在比浊时间分析法中往往产生与内毒素无关的非特异性的混浊，因此，有可能欠缺测定精度。而且，凝胶化法的测定界限浓度为3pg/ml，比浊时间分析法的测定界限浓度为lpg/ml。予以说明，作为适用于凝胶化反应测定装置的比浊时间分析法，即使假定适合采用专利文献I所示的散射测光法，但作为替换为凝胶化全体的变化观察的定量法，仍然不
能解决上述的问题。另一方面，虽然发色合成底物法与凝胶化法和比浊时间分析法相比，测定时间为约30分钟左右的较短时间，但是在临床试样等天然物的测定中，有时存在由混在的非特异性蛋白分解酶引起的伪阳性反应，难以进行特异度较高的测定，而且，测定准备工作繁杂，测定界限浓度也为3pg/ml，与比浊时间分析法相比更差。本发明提供一种凝胶粒子测定装置，当利用凝胶化反应测定试样中的目的物质时，该装置能够高灵敏度地测定凝胶粒子的生成开始时间点，并在产生该现象的溶剂中将光裳减抑制在最小限。解决课题的手段第一方面的发明为一种凝胶粒子测定装置，该装置通过凝胶化反应使试样中的目的物质发生粒子化来测定，其特征在于，该装置具备试样池、搅拌装置、入射光源、后方散射光检测装置、散射光变动计测装置、和凝胶粒子生成判别装置，所述试样池的至少一部分具有使光入射的入射部，用于收纳含有作为测定对象的目的物质的试样和含有用于使所述目的物质发生凝胶化的试剂的溶液；所述搅拌装置用于搅拌该试样池内的含有试样和试剂溶液的混合溶液，以便抑制所述混合溶液全体发生凝胶化；所述入射光源设置在所述试样池的入射部的外部，用于对所述试样池内的含有试样和试剂溶液的混合溶液照射相干光；所述后方散射光检测装置设置在所述试样池的入射部的外部并与与所述入射光源处在相同侧，用于检测在所述试样池内的含有试样和试剂溶液的混合溶液中散射的光中返回到所述入射光源侧方向的后方散射光成分；所述散射光变动计测装置基于该后方散射光检测装置的检测输出来计测散射光的变动成分；所述凝胶粒子生成判别装置基于该散射光变动计测装置的计测结果判别凝胶粒子的生成状态，所述凝胶粒子的生成状态至少包括与所述混合溶液从溶胶相向凝胶相的相转变的时间(时间点)有关的所述混合溶液内的凝胶粒子的生成开始时间点。第二方面的发明为一种凝胶粒子测定装置，其特征在于，在第一方面的凝胶粒子测定装置中，入射光源为激光光源。第三方面的发明为一种凝胶粒子测定装置，其特征在于，在第一方面的凝胶粒子测定装置中，试样池在池容器内内置可直接搅拌试样和试剂溶液的搅拌装置。第四方面的发明为一种凝胶粒子测定装置，其特征在于，在第一方面的凝胶粒子测定装置中，试样池设置在恒温槽内。第五方面的发明为一种凝胶粒子测定装置，其特征在于，在第一方面的凝胶粒子测定装置中，试样池本身或在其周围具备用于除去来自入射光源的照射光中的杂散光成分的杂散光除去装置，所述杂散光成分由在所述混合溶液中返回到入射光源侧方向的后方散射光成分以外的透射或散射产生。第六方面的发明为一种凝胶粒子测定装置，其特征在于，在第一方面的凝胶粒子测定装置中，具备显示由凝胶粒子生成判别装置作出的判别结果的显示装置。第七方面的发明为一种凝胶粒子测定装置，其特征在于，在第一方面的凝胶粒子 测定装置中，后方散射光检测装置具有围绕从入射光源入射到试样池的入射光的环状检测面。第八方面的发明为一种凝胶粒子测定装置，其特征在于，在第一方面的凝胶粒子测定装置中，后方散射光检测装置具有由围绕从入射光源入射到试样池的入射光的光透射性纤维束构成的导光部件，将该导光部件的一端作为光导入面起作用，同时，与所述导光部件的另一端对应而配置检测面。第九方面的发明为一种凝胶粒子测定装置，其特征在于，在第一方面的凝胶粒子测定装置中，具有作为检测在所述混合溶液内散射的光中返回到入射光源侧方向的后方散射光成分的后方散射光检测装置的第I散射光检测装置、检测在所述混合溶液内散射的光中返回到入射光源侧方向的后方散射光成分以外的散射光成分的第2散射光检测装置、和基于这些后方散射光检测装置的检测输出计测各自的散射光的变动成分的散射光变动计测装置，所述凝胶粒子生成判别装置基于第I散射光检测装置的检测输出的变动成分的计测结果判别所述混合溶液内的凝胶粒子的生成开始时间点，基于第I散射光检测装置和第2散射光检测装置的检测输出或第2散射光检测装置的检测输出的变动成分的计测结果，判别所述混合溶液内的凝胶粒子的生成开始时间点以外的凝胶粒子的生成状态信息。第十方面的发明为一种凝胶粒子测定装置，其特征在于，在第一方面的凝胶粒子测定装置中，作为测定对象的目的物质为内毒素，用于使其凝胶化的试剂为鲎试剂。发明效果根据第一方面的发明，在通过凝胶化反应测定试样中的目的物质时，基于在含有试样和试剂溶液的混合溶液中散射的散射光中返回到入射光源侧方向的后方散射光的变动成分，高灵敏度地测定与所述混合溶液从溶胶相向凝胶相的相转变的时间(时间点)有关的凝胶粒子的生成开始时间点，并在产生该现象的溶剂中将光衰减抑制在最小限。根据第二方面的发明，可以简单地提供入射光源。根据第三方面的发明，可以更可靠地搅拌试样和试剂溶液，使凝胶粒子的生成条件一致。根据第四方面的发明，可以在恒温环境下使凝胶化反应稳定地进行。根据第五方面的发明，可有效避免在后方散射光检测装置中错误检测由后方散射光成分以外的透射或散射产生的杂散光成分的情况。根据第六方面的发明，可目测凝胶粒子生成判别装置的判别结果。根据第七方面的发明，可进一步提高后方散射光检测装置的后方散射成分的检测精度。根据第八方面的发明，可以用简单构成的后方散射光检测装置有效地检测后方散射光成分。根据第九方面的发明，与不使用第2散射光检测装置的方式相比，除了后方散射 光的变动成分以外，还可以计测后方散射光以外的散射光的变动成分，由此可以更准确地判别除了混合溶液内的凝胶粒子的生成开始时间点以外的其它凝胶粒子的生成状态信息。根据第十方面的发明，可以适用于内毒素的定量。


图I为示出本发明所使用的实施方式的凝胶粒子测定装置的概要说明图。图2中，(a)为示意性示出凝胶化反应的说明图；(b)为示出凝胶化反应的进行工序I III的说明图；(C)为示出在凝胶化反应的进行工序中反应时间与散射光强度的关系的说明图。图3为示意性示出使用鲎试剂时内毒素的凝胶化反应过程的说明图。图4 Ca)是表示对凝胶粒子照射相干光时的散射光的散射方向的说明图，(b)是表示伴有凝胶粒子的粒径变化的散射光的光度分布的说明图。图5是表示实施方式I的凝胶粒子测定装置的说明图。图6 Ca)是表示实施方式I中使用的激光光源、后方散射光检测器的构成例的说明图，(b)是(a)的一部分剖面平面说明图。图7 (a)是表示实施方式I中使用的试样池的分解立体图，(b)是其剖面说明图。图8是表示实施方式I的凝胶粒子测定装置的数据分析处理的一例的流程图。图9 (a)是表示对已知的内毒素浓度的试样进行后方散射测光的凝胶粒子的检测例的说明图，(b)是表示使用(a)的结果的标准曲线制作例的说明图。图10 (a) (b)是表示实施方式I的凝胶粒子测定装置的变形方式的说明图。图11是表示实施方式2的凝胶粒子测定装置的说明图。图12 (a)是表示对添加有标准品内毒素的水试样，使用实施例I的凝胶粒子测定装置进行后方散射测光的实测数据例的说明图，(b)是表示对添加有与(a)相同的标准品内毒素的水试样，使用比较例I的凝胶粒子测定装置与后方散射测光同时进行前方散射测光的实测数据例的说明图，(C)是表示对添加有与(a)相同的标准品内毒素的水试样，使用比较例2的凝胶粒子测定装置与后方散射测光同时进行前方透射光的实测数据例的说明图。图13 (a)是表示对在临床的全血溶血试样中添加有标准品内毒素的试样，使用实施例I的凝胶粒子测定装置进行后方散射测光的实测数据例的说明图，(b)是表示对在与
(a)相同的临床的全血溶血试样中添加有标准品内毒素的试样，使用比较例I的凝胶粒子测定装置与后方散射测光同时进行前方散射测光的实测数据例的说明图，(C)是表示对在与(a)相同的临床的全血溶血试样中添加有标准品内毒素的试样，使用比较例2的凝胶粒子测定装置与后方散射测光同时进行前方透射光测定的实测数据例的说明图。图14 (a)是表示对临床的全血溶血试样，使用实施例I的凝胶粒子测定装置进行后方散射测光的实测数据例的说明 图，(b)是表示对与(a)相同的临床的全血溶血试样，使用比较例I的凝胶粒子测定装置与后方散射测光同时进行前方散射测光的实测数据例的说明图，(C)是表示对与(a)相同的临床的全血溶血试样，使用比较例2的凝胶粒子测定装置与后方散射测光同时进行前方透射光测定的实测数据例的说明图。图15 Ca)是表示使用实施例I的凝胶粒子测定装置进行后方散射测光的实测数据例的说明图，(b)是表示对(a)实测数据每3个数据进行平滑处理的数据例的说明图，(C)是表示对(a)的实测数据每5个数据进行平滑处理的数据例的说明图。图16是表示血液凝固反应中的本发明的适用例的说明图。图17 (a) (b)是表示抗原抗体反应中的本发明的适用例的说明图。
具体实施例方式◎实施方式的概要图I是表示本发明所使用的实施方式的凝胶粒子测定装置的概要说明图。在图I中，凝胶粒子测定装置为通过凝胶化反应将试样S中的目的物质粒子化而进行测定的装置，其具备试样池I、搅拌装置2、入射光源3、后方散射光检测装置4、散射光变动计测装置5、和凝胶粒子生成判别装置6，所述试样池I的至少一部分具有使光入射的入射部，用于收纳含有作为测定对象的目的物质的试样S和含有用于使所述目的物质发生凝胶化的试剂R的溶液；所述搅拌装置2用于搅拌该试样池I内的含有试样S和试剂R溶液的混合溶液W，以便抑制所述混合溶液W全体发生凝胶化；所述入射光源3设置在所述试样池I的入射部的外部,用于对所述试样池I内的含有试样S和试剂R溶液的混合溶液W照射相干光Bm ;所述后方散射光检测装置4设置在所述试样池I的入射部的外部并与与所述入射光源3处在相同侧，用于检测在所述试样池I内的含有试样S和试剂R溶液的混合溶液W中散射的光中返回到所述入射光源3侧方向的后方散射光成分；所述散射光变动计测装置5基于该后方散射光检测装置4的检测输出来计测散射光的变动成分；所述凝胶粒子生成判别装置6基于该散射光变动计测装置5的计测结果判别凝胶粒子的生成状态，所述凝胶粒子的生成状态至少包括与所述混合溶液W从溶胶相向凝胶相的相转变的时间(时间点)有关的所述混合溶液W内的凝胶粒子G的生成开始时间点。在这样的技术装置中，只要本发明的目的物质是一种可与规定的试剂之间发生凝胶化反应，生成凝胶粒子的物质，就可以广泛地包括各种目标物质。例如可举出，内毒素和β-D-葡聚糖，作为此时的规定试剂，可举出鲎试剂。另外，试样池I可在至少一部分具有使光入射的入射部，其形状不限于具有园筒状周壁的形状，也可以具有多边形形状周壁。另外，从入射部入射的光中返回到后方散射光检测装置4侧的方向的后方散射光以外的散射光、透射光等光在试样池I的内壁上进行反射散射时，担心其反射散射光的一部分作为杂散光被后方散射光检测装置4错误地捕捉，因此，优选采用不产生对这种检测有影响的杂散光的构成。另外，从将测定条件保持一定的观点考虑，优选该试样池I设置在恒温槽7内的方式。进而，作为搅拌装置2，只要能对含有试样S和试剂R溶液的混合溶液W赋予搅拌作用，就可以广泛地包括各种搅拌装置，不近可以采用内置并直接搅拌的方式，而且可以适当选定赋予利用空气的搅拌 作用、赋予振荡引起的搅拌作用等。在此，搅拌装置2的搅拌程度需要抑制试样池I内的含有试样S和试剂R溶液的混合溶液W全体发生凝胶化。从可靠地进行利用搅拌装置2的搅拌操作的观点考虑，特别优选试样池I在其池容器内内置可直接搅拌含有试样S和试剂R溶液的混合溶液W的搅拌装置2。进而，入射光源3只要是能照射相干光，不限于利用激光光源的激光，通过例如使钠灯的光那样的单色光通入针孔也可以制作，此外，可以使用高亮度LED和过滤器构成。另外，作为后方散射光检测装置4，只要用从入射光源3入射到试样池I内的光Bm检测在试样S和试剂R溶液中散射的光中返回到入射光源3侧方向的后方散射光成分的装置即可。此时，作为后方散射光检测装置4，可以为在来自入射光源3的入射光的周围直接检测上述后方散射光成分的方式，或者可以为聚集来自入射光源3的入射光周围的光、用玻璃纤维等导光部件导入至任意场所而检测的方式。另外，优选采用杂散光除去装置8(在试样池I的周壁内或外部设置光吸收材料，或进行试样漫反射的结构)，所述杂散光除去装置8用由入射光源3入射的光，以在混合溶液W中没有返回到入射光源3侧的方向的透射光或散射光成分作为杂散光不被后方散射光检测装置4检出的方式除去杂散光成分。而且，作为散射光变动计测装置5，只要能够基于后方散射光检测装置4的检测输出来计测散射光的变动成分即可，例如可举出在将检测输出平均化或平稳化的同时进行过滤化的方法。而且，作为凝胶粒子生成判别装置6，广泛地包括判别凝胶粒子的生成状态的装置，所述凝胶粒子的生成状态至少包括与上述混合溶液W从溶胶相向凝胶相的相转变的时间(时间点)有关的上述混合溶液W内的凝胶粒子的生成开始时间点。而且，所谓“判别凝胶粒子的生成状态”是指，不但包括能够直接判别与凝胶粒子的生成状态有关的信息，也包括基于凝胶粒子的生成状态判别可判别的信息(例如目的物质的定量信息)。在此，凝胶粒子的生成状态是指广泛地包括凝胶粒子的生成开始(出现)时间点、生成过程的变化、生成结束时间点、生成量等，因此，在本发明中，只要至少包括上述混合溶液W从溶胶相向凝胶相的相转变的时间即可，也可以包括其它事项。进而，从可通过目测读出由散射光变动计测装置5得到的计测结果的观点考虑，优选具备能够显示由散射光变动计测装置5得到的计测结果的显示装置9。而且，在本实施方式中，将上述的后方散射光检测装置4设定为第I散射光检测装置，而且，具有检测在上述混合溶液W内散射的光中返回到入射光源3侧方向的后方散射光成分以外的散射光成分的第2散射光检测装置10和基于由这些后方散射光检测装置4、10的检测输出计测各自的散射光的变动成分的散射光变动计测装置5，上述凝胶粒子生成判别装置6可以基于第I散射光检测装置4的检测输出的变动成分的计测结果判别上述混合溶液内的凝胶粒子G的生成开始时间点，基于第I散射光检测装置4和第2散射光检测装置10的检测输出或第2散射光检测装置10的检测输出的变动成分的计测结果判别上述混合溶液W内的凝胶粒子G的生成开始时间点以外的凝胶粒子G的生成状态信息。下面，说明图I所示的凝胶粒子测定装置的工作情况。首先,凝胶化反应示意性地示于图2 (a)。在该图中，当存在对试样S的目的物质St具有特异性反应的试剂R时，就会按照依赖于试样S中的目的物质St的浓度的比例，引起该目的物质St与试剂R发生特异性反应的现象。在该反应过程中，试剂R受到目的物质St的刺激，使规定的因子活化，作为其起因，是在规定的酶发生活化时，例如水溶性的蛋白质由于酶的作用而引起分解反应时，就会转变成不溶性的蛋白质，从而引起凝胶粒子G出现。更具体地，以内毒素为例，如要示意性示出内毒素的凝胶化反应过程，可见图3。 在该图中，一旦(I)所示的内毒素的刺激传递到鲎试剂，首先，如(2)所示，因子C(Factor C)被活化,成为活化因子C (Activated Factor C),接着，由于活化因子C的作用，如(3)所示，因子B (Factor B)被活化,成为活化因子B (ActivatedFactor B)。然后，由于活化因子B的作用，如(4)所示，凝固酶原变成凝固酶，如(5)所示，该凝固酶将凝固蛋白原(水溶性蛋白质)分解，生成凝固素(不溶性蛋白质)。该凝固素(不溶性蛋白质)一旦在该条件下进行搅拌，全体的凝胶化被抑制，就会作为凝胶粒子G出现，一旦静置，则如(6)所示，溶液类全体发生聚合化/凝胶化。总之，可以理解，其反应过程如下在试样S的目的物质St为内毒素的情况下，通过向混合溶液W赋予一定的搅拌状态,既可以抑制混合溶液W全体的凝胶化，同时在该状态下，当内毒素的刺激一旦传递给鲎试剂R时，就可能在凝固酶的周围，产出凝固素(不溶性蛋白质)的凝胶粒子G，凝固素(不溶性蛋白质)作为凝胶粒子G生成后，凝胶粒子G就逐渐生成。另外还发现，内毒素的刺激传递给鲎试剂R的反应流(级联反应)的速度(鲎反应速度)依赖于内毒素浓度，内毒素浓度越高，鲎反应速度越快，含有凝固素(不溶性蛋白质)的凝胶粒子G的出现时间越快。因此，只要能够精度良好地检测散射光变化，就可以把握作为凝胶粒子G的生成开始时间点的含有上述凝固素(不溶性蛋白质)的凝胶粒子G的出现时间，这是本实施方式的凝胶粒子测定装置的测定原理的基础。这种凝胶粒子测定装置的测定原理，与例如现有的凝胶化法或比浊时间分析法的测定原理(在利用鲎试剂R的反应过程中，在静置的条件下，在被活化的凝血酶的影响下最终达到凝胶化，利用浊度来定量测定该凝胶化的过程的方案)完全不同。此处，凝胶粒子测定装置的测定原理示意性地示于图2 (b)。本实施方式的凝胶粒子测定装置中，如图2 (b)的工序I所示，在试样S和试剂R溶液的混合溶液W中没有凝胶粒子的情况(相当于混合溶液W为溶胶相的情况)下，从图中未示出的入射光源发出的照射光Bm1没有被凝胶粒子遮住，因此，该照射光Bm1没有被凝胶粒子散射，理所当然，不存在返回到入射光源3侧后方的后方散射光成分。因此，由后方散射光检测装置4检出的散射光强度大致保持在O (参照图2 (c) I工序P1X而且，如图2 (b)的工序II所示，在试样S和试剂R溶液的混合溶液W中开始生成凝胶粒子G的情况(相当于混合溶液W从溶胶相向凝胶相开始相转变的情况)，例如内毒素的情况的凝固素(不溶性蛋白质)的凝胶粒子G开始产生时，由从未图示的入射光源发出的照射光Bm2被产生的含有凝固素(不溶性蛋白质)的凝胶粒子G的存在部分遮挡，因此，该照射光Bm2被散射，该散射光中返回到入射光源侧方向的后方散射光成分在后方散射光检测装置4中被检测。因此，利用后方散射光检测装置4的检测输出从稳定区域的O水平上升且变化(参照图2 (c) II工序P2)。此时，入射光照射的试样池I之后的后方散射光在几乎不受到溶剂引起的衰减的情况下被检测。其后，如图2 (b)的工序III所示，在试样S和试剂R溶液的混合溶液W中逐渐生成凝胶粒子G的情况下，通过从未图示的入射光源产生的照射光Bm3由于逐渐生成的大量凝胶粒子G的存在，散射程度逐渐增加，在后方散射光检测装置4中被检测出的返回到入射光源侧后方的后方散射光成分也逐渐增加。因此，由后方散射光检测装置4得到的检测输出依次增加，在后方散射光检测装置4中被检测出的散射光强度以变化点P2为界线依次上升且逐渐变化(参照图2 (C)III工序P3)。另一方面，如果某种程度上强度增加，则强度上升至溶剂引起的衰减以上，前方或侧方散射也被检测。但是，初期的散射因衰减而未被检出，试样池I之后的后方散射检测延迟。 在上述的实施方式中，显示如下方式基于照射到混合溶液W中的照射光Bm的后方散射光的变动成分，与其它方向的散射相比，显著快地判别与混合溶液W从溶胶相向凝胶相的相转变的时间(时间点)有关的凝胶粒子的生成开始时间点(相当于图2 (b) II工序P2)。—般而言，临床试样中的内毒素测定的要求特别是在救命救急的目的下，简便而快的计测为第一要求的原因。作为以现有方法的比浊时间法成为问题的事项的‘灵敏度的恶化引起的测定降低’和‘测定时间的长度引起的不方便’，在上述的测定方式中更可靠地被解除。S卩，本实施方式的凝胶粒子测定装置从原理上均匀地搅拌含有试样和鲎试剂的混合溶液W，由此，在均匀的反应下，不是作为混合溶液类全体，而是在局部产生微小的凝胶粒子，通过对其照射激光那样的相干的均匀的光而引起散射，通过对其进行检测，检测与通过添加内毒素而引起凝胶粒子出现这样的溶胶相向凝胶相的相转变有关的相转变点，通过计测至达到该相转变点的时间，可以推测鲎试剂中的内毒素的量。如果简要地说，本实施方式的凝胶粒子测定装置在不追求混合溶液系全体的变化(凝胶化)的情况下，着眼于直至引起相转变的时间(凝胶粒子的生成开始时间点)为依赖于内毒素的反应而构成的，由此，成为与作为现有方法的比浊时间法相比，可以更快地检测出内毒素的原因。特别是在本实施方式中，着眼于散射光中返回到入射光源侧后方的后方散射光成分，该理由如下所述。一般而言，如图4 (a)所示，假设对粒子照射例如激光等相干的均匀的光(相干光)的模型时，已知由于相干光因粒子的存在而散射广。在这样的散射现象中，对粒子的大小和散射光的关系进行了研究，结果，通过单一光的入射产生的散射光的强度及方向性例如如图4 (b)所示的关系中看到的。在该图中，作为散射现象，存在如下散射在与向粒子入射的光相同方向上产生的前方散射；在与入射的光成直角方向产生的侧方散射；以及，在与入射光相反方向上产生的后方散射。在这种散射现象中，产生的能量暂且不提，考虑粒子的大小和散射的方向时，粒子越大，前方散射越为主要的，粒子小时，观察到向包括后方散射在内的全方位的散射。由这种观察结果可以说，捕捉大的粒子对前方散射是有利的。另一方面，从无的状态产生、成长的现象下，为了较快地捕捉最初产生的小的粒子，可以说从哪个方向都可以，但考虑能量小时，和考虑到粒子所存在的溶剂中的散射光的衰减时，优选其衰减少(受溶剂影响引起的吸收少)的后方散射。尤其，本实施方式的凝胶粒子测定装置为了捕捉从无生成的粒子(所谓凝胶化的相变化)，以尽早检测出生成的微小的粒子为目的，据推测试样池之后的后方散射产生的凝胶粒子检测与其它任何方向的散射检测相比均优异。这样，以快且灵敏度好地检测通过鲎试剂引起的相转变而出现的微小粒子为目的，通过采用利用后方散射的检测方式，可以进一步计测上述相转变的时间。 总而言之，检测因微小粒子出现而产生的散射光中的后方散射光成分的方式具有可以较快地检测小的粒子、可以检测由漂浮有粒子的溶剂引起的没有衰减的散射光这2个优点。而且还有一个优点是，由于不需要基本上设定来自入射光源的入射光所通过的光程，因此，装置的结构也可以设定得更简单。以下，基于附图所示的实施方式，更详细地说明本发明。◎实施方式I本实施方式I的凝胶粒子测定装置具有注入含有内毒素的试样的试样池100，用使用鲎试剂的凝胶化反应测定例如作为试样的目的物质的内毒素的浓度。—凝胶粒子测定装置一在本实施方式中，凝胶粒子测定装置如图5所示构成。在该图中，试样池100设置在预先确定的测定台上，在本实施方式中，将配置在恒温槽115内的含有试样S和试剂(未图不)的混合溶液W置于一定的恒温环境(例如37°C )下，使测定条件为恒定。另外，符号120是为了搅拌试样池100内的混合溶液W而驱动试样池100内的磁性搅拌棒121的搅拌驱动装置，例如，对混合溶液W赋予一定的搅拌状态，一边均匀地搅拌混合溶液W，一边抑制混合溶液W的全体凝胶化。特别是在本例中，搅拌驱动装置120的构成为对由内置在试样池100内的底壁的磁性体构成的搅拌棒121，使磁力引起的搅拌力起作用的搅拌驱动源(磁性搅拌器)。而且，符号130为设置在试样池100的侧周壁的外侧且照射相干光的激光光源。在本例中，如图6 (a) (b)所不,来自激光光源130的相干光Bm沿横切试样池101的大致直径部分的经路照射，其光径d设定为相对于生成的凝胶粒径(例如O. 2 2 μ m左右)为充分大的值(例如5 2(^111左右)。进而，符号140在试样池100的外部设置在与激光光源130同侧，来自激光光源130的照射光Bm为检测由在试样池100内的混合溶液中生成的凝胶粒子散射的光中返回到激光光源130侧方向的后方散射光成分的后方散射光检测器。在本例中，后方散射光检测器140具有在中央部开设有通孔142的筒状的检测器主体141，在该检测器主体141的通孔142中，使从激光光源130照射到试样池100内的照射光通过，同时，与该检测器主体141的试样池100的侧周壁外面对向地设置环状检测面143，进而，在该检测器主体141内的一部分中组装入可以感知由环状检测面143检出的散射光的光二极管等受光元件(未图示)。在此，后方散射光检测器140的检测精度设定为在来自激光光源130的照射光Bm的通过面积内可以根据I或多个凝胶粒子的有无来检测后方散射光量变化的程度。另外，后方散射光检测器140的环状检测面143可以与试样池100的侧周壁外表面接触或非接触式地配置，但从良好地保持后方散射光成分的检出性的观点考虑，优选接触配置的方式。进而，在本实施方式中，在试样池100的外部夹持试样池100，在上述激光光源130的相反侧设置杂散光除去部件150。该杂散光除去部件150与从激光光源130照射到试样池100内的照射光Bm直接透射到达试样池100的相反侧周壁的区域及其周边区域对应配置光吸收材料。 这样，在试样池100的一部分设有杂散光除去部件150的理由如下所述。即，来自激光光源130的照射光例如返回到由凝胶粒子散射的光中的激光光源130侧的后方散射光成分以外的散射光成分、或者直接透过生成的凝胶粒子的围的透射光成分可以成为被试样池100的内壁等反射而朝向后方散射光检测器140的杂散光成分，其中，尤其是指向性高的杂散光成分为朝向与透射光成分及透射光成分相同的方向的散射光成分，因此，在与其对应的位置可以设置杂散光除去部件150。符号160为读取来自后方散射光检测器140的检测输出、实行例如图8所示的数据分析处理的数据分析装置，170为显示由数据分析装置160分析出的分析结果的显示器。该数据分析装置160由含有CPU、ROM、RAM、I/O接口等的计算机系统构成，例如在ROM内预先贮存图8所示的数据分析处理程序，基于来自后方散射光检测器140的检测输出，在CPU中实行数据分析处理程序。另外，来自后方散射光检测器140的检测输出利用例如未图示的增幅器进行电流电压变换之后，利用AD变换器进行AD变换，收集入数据分析装置160中。<试样池的构成例>下面，基于图7 (a) (b)，对本实施方式中使用的试样池100的构成例及向试样池100的搅拌棒121、试样S的导入例进行详述。在该图中，试样池100由例如由玻璃材料一体化成型且上部开口的横截面为圆形的有底的筒状容器101构成，在其上部形成凸缘部102，同时，在该凸缘部102的下部形成颈部103，在凸缘部102及颈部103上形成小径孔部104，在内部形成比该小径孔部104的直径大的大径空间部105。在该试样池100内，含有内毒素的试样和产生凝胶化反应的试剂106例如以冻干粉末状预先收纳于无菌且无内毒素的(一般称为“无内毒素”或“无热原的”)，同时，预先收纳使用磁性材料的搅拌棒121。进而，在该试样池100的小径孔部104上嵌入由橡胶等弹性材料构成的密封栓108。该密封栓108成形为剖面大致T字状，其头部108a载置于试样池100的凸缘部102上，其脚部108b以密接于小径孔部104的状态被插入。另外，在密封栓108的脚部108b的一部分上设有凹槽108c。
进一步地，试样池100的凸缘部102及密封栓108的头部108a用例如铝制的盖状的保持盖109覆盖，该保持盖109嵌入于试样池100的凸缘部102的周壁，从外侧包围保持密封栓108。另外，在该保持盖109的例如中央部，面向密封栓108的头部108a形成孔部109ao另外，如图7 (a) (b)所示，试样池100在筒状容器101的小径孔部104开放的状态下收纳试剂106和搅拌棒121，在该状态下，用密封栓108密封筒状容器101的小径孔部104，同时，用保持盖109覆盖该密封栓108。这种试样池100作为凝胶粒子测定装置的附属品或测定试剂盒供给用户。另外，作为向本实施方式的试样池100的筒状容器101导入试样S的导入法,例如可举出利用保持盖109的孔部109a在密封栓108中用注射针等穿孔具(未图示)穿孔，通过该穿孔用注入器(未图示)注入试样S的方法。进而，为了容易地进行试样S的导入，以使筒状容器101内相对于大气压保持规定负压水平的方式设定密封栓108的密封方法。 下面，对本实施方式的凝胶粒子测定装置的工作情况进行说明。在本实施方式中，如图5所不,在试样池100中注入含有内毒素的试样S后,将未图示的启动开关进行打开操作时，开始利用凝胶粒子测定装置的测定顺序。就该测定顺序而言，用搅拌驱动装置120旋转搅拌棒121，搅拌试样池100内的含有试样S和鲎试剂的混合溶液W。由此，使得混合溶液W全体被均匀地搅拌，同时，抑制混合溶液W全体发生凝胶化。另外，就测定顺序而言，从激光光源130向试样池100内的混合溶液W照射相干光Bm，用后方散射光检测器140检测在混合溶液W中散射的光中朝向激光光源130侧方向的后方散射光成分，同时，将后方散射光检测器140的检测输出采集入数据分析装置160。另一方面，在试样池100内的混合溶液W中，内毒素的刺激传递到鲎试剂,产生图3所示的鲎反应，在抑制混合溶液W全体凝胶化的状态下，依次生成凝胶粒子G。在本实施方式中，在来自激光光源130的相干光Bm的通过面积内例如生成I个凝胶粒子G时，将其作为与混合溶液W从溶胶相转变为凝胶相的相转变点的时间(时间点)有关的凝胶粒子G的生成开始时间点。在这种反应过程中，例如如图8所示，数据分析装置160在将来自后方散射光检测器140的检测输出作为散射光量数据(数字数据)读取之后，进行平均化、过滤化处理，由此计测散射光量数据的变动成分。接着，基于散射光量数据的变动成分，提取出由后方散射光检测器140检出的散射光量数据的增加变化点(相当于图2 (c) II工序P2),通过参照预先规定的标准曲线，确定试样S的内毒素浓度(ETX浓度)，显示在显示器170上。在本例中，标准曲线表示内毒素浓度(ETX浓度)和至达到散射光量数据的增加变化点的时间阈值之间的关系，基于达到散射光量数据的增加变化点的时间和标准曲线的相关性，确定内毒素浓度(ETX浓度)。另外，在显示器170中，除了内毒素浓度(ETX浓度)以夕卜,还切换显示散射光量数据的时序数据、散射光量数据的变动成分的时序计测数据等数据。<标准曲线的制作例>在此，对本实施方式中采用的标准曲线的制作例进行说明。
使用本实施方式I的凝胶粒子测定装置，例如如下确定预先确定的实验条件，对添加有各种内毒素浓度(例如10、1、0. lpg/ml)的样品试样时的鲎试剂，用凝胶粒子测定装置研究利用后方散射光检测器140的散射光度(散射光量数据)的变化。本例中使用的实验条件如下所述。·激光光源130 :红色光或蓝色光·后方散射光检测器140 :光二极管·搅拌棒121的转速IOOOrpm 恒温条件37°C
图9 Ca)是相对于内毒素浓度10pg/ml、lpg/ml、0. lpg/ml的样品试样,对散射光强度追随各自的时间经过而描绘的图。予以说明，图9 (a)的纵轴表示散射光强度U (用Uy表示图中的最大散射光强度刻度)，横轴表示反应时间(用tx[例如IOOmin]表示图中的最大反应时间刻度)。在该图中，各条件的散射光强度的变化均显示达到维持大致O的恒定水平的部分的时间并增加的倾向。该散射光强度的增加变化点相当于凝胶粒子的生成开始时间点(含有内毒素的样品试样从溶胶相向凝胶相的相转变的时间)，推测是指由凝胶化开始时产生的增光。为了求出该凝胶化的开始时间，在本实施方式中，在图9 (a)的图中，手动求出近似于恒定散射光度的部分的直线(通常为O)与近似于散射光强度逐渐倾斜增加的变化部分的直线的交点，求出各自的凝胶化开始时间(反应时间)t (10),t (l)、t (0.1)。进而，在本实施方式中，使用由图9 (a)的图求出的凝胶化开始时间t (10)、t (I)、t (O. I)的值制作标准曲线(参照图9 (b))。在图9(b )中，标准曲线是通过将X轴设为作为内毒素浓度的ETX浓度(log变换)、将Y轴设为凝胶化开始时间，描绘各凝胶化开始时间的值并对这些值利用最小二乘法绘制直线而求出的。此时，凝胶化开始时间的值相对于各内毒素浓度的样品试样呈直线关系，表示相关系数高的相关性。予以说明，例示本实施方式中求出的标准曲线的一例时，如下所述。内毒素浓度(pg/ml)凝胶化开始时间(min.)10pg/ml t (10) = 12 (min.)lpg/ml t (I) = 20 (min.)0. lpg/ml t (0. I) = 27 (min.)与此相比，使用采用和光纯药工业株式会社制的比浊时间分析法的内毒素试剂盒
(凝胶化反应测定装置)，研究内毒素浓度和凝胶化时间，结果，可得到如下的结果。
权利要求
1.一种凝胶粒子测定装置，该装置通过凝胶化反应使试样中的目的物质发生粒子化来测定，其特征在于，该装置具备试样池、搅拌装置、入射光源、后方散射光检测装置、散射光变动计测装置、和凝胶粒子生成判别装置， 所述试样池的至少一部分具有使光入射的入射部，用于收纳含有作为测定对象的目的物质的试样和含有用于使所述目的物质发生凝胶化的试剂的溶液； 所述搅拌装置用于搅拌该试样池内的含有试样和试剂溶液的混合溶液，以便抑制所述混合溶液全体发生凝胶化； 所述入射光源设置在所述试样池的入射部的外部，用于对所述试样池内的含有试样和试剂溶液的混合溶液照射相干光； 所述后方散射光检测装置设置在所述试样池的入射部的外部并与与所述入射光源处在相同侧，用于检测在所述试样池内的含有试样和试剂溶液的混合溶液中散射的光中返回到所述入射光源侧方向的后方散射光成分； 所述散射光变动计测装置基于该后方散射光检测装置的检测输出来计测散射光的变动成分； 所述凝胶粒子生成判别装置基于该散射光变动计测装置的计测结果判别凝胶粒子的生成状态，所述凝胶粒子的生成状态至少包括与所述混合溶液从溶胶相向凝胶相的相转变的时间有关的所述混合溶液内的凝胶粒子的生成开始时间点。
2.权利要求I所述的凝胶粒子测定装置，其特征在于，入射光源为激光光源。
3.权利要求I所述的凝胶粒子测定装置，其特征在于，试样池在其池容器内内置可直接搅拌试样和试剂溶液的搅拌装置。
4.权利要求I所述的凝胶粒子测定装置，其特征在于，试样池设置在恒温槽内。
5.权利要求I所述的凝胶粒子测定装置，其特征在于，试样池本身或在其周围具备用于除去来自入射光源的照射光中的杂散光成分的杂散光除去装置，所述杂散光成分由在所述混合溶液中返回到入射光源侧方向的后方散射光成分以外的透射或散射产生。
6.权利要求I所述的凝胶粒子测定装置，其特征在于，具备用于显示由凝胶粒子生成判别装置作出的判别结果的显示装置。
7.权利要求I所述的凝胶粒子测定装置，其特征在于，后方散射光检测装置具有围绕从入射光源入射到试样池的入射光的环状检测面。
8.权利要求I所述的凝胶粒子测定装置，其特征在于，后方散射光检测装置具有由围绕从入射光源入射到试样池的入射光的光透射性纤维束构成的导光部件，将该导光部件的一端作为光导入面起作用，同时，与所述导光部件的另一端对应而配置检测面。
9.权利要求I所述的凝胶粒子测定装置，其特征在于，具有 作为检测在所述混合溶液内散射的光中返回到入射光源侧方向的后方散射光成分的后方散射光检测装置的第I散射光检测装置、 检测在所述混合溶液内散射的光中返回到入射光源侧方向的后方散射光成分以外的散射光成分的第2散射光检测装置、和 基于这些后方散射光检测装置的检测输出来计测各自的散射光的变动成分的散射光变动计测装置， 所述凝胶粒子生成判别装置基于第I散射光检测装置的检测输出的变动成分的计测结果，判别所述混合溶液内的凝胶粒子的生成开始时间点， 基于第I散射光检测装置和第2散射光检测装置的检测输出或第2散射光检测装置的检测输出的变动成分的计测结果，判别所述混合溶液内的凝胶粒子的生成开始时间点以外的凝胶粒子的生成状态信息。
10.权利要求I所述的凝胶粒子测定装置，其特征在于，作为测定对象的目的物质为内毒素，用于使其凝胶化的试剂为鲎试剂。
全文摘要
通过凝胶化反应测定试样中的目的物质时，高灵敏度计测凝胶粒子的生成开始时间点并在产生现象的溶剂中抑制光衰减达最小限。具备收纳含有试样S和试剂R的溶液的试样池1，搅拌混合溶液W的搅拌装置2，对混合溶液W照射相干光Bm的入射光源3，设置在试样池1的外部且与入射光源3同侧、检测试样池1内混合溶液W中散射的光中返回到入射光源侧方向的后方散射光成分的后方散射光检测装置4，基于后方散射光检测装置4的检测输出计测后方散射光变动成分的散射光变动计测装置5，基于散射光变动计测装置5的计测结果判别至少包括与混合溶液W从溶胶相向凝胶相的相转变时间有关的凝胶粒子生成开始时间点的凝胶粒子生成状态的凝胶粒子生成判别装置6。
文档编号G01N33/579GK102869976SQ20118002169
公开日2013年1月9日 申请日期2011年5月23日 优先权日2010年6月4日
发明者小幡彻 申请人:小幡彻