专利名称：鹅免疫球蛋白编码区及其恒定区特异性单克隆抗体与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鹅免疫球蛋白编码区及其单克隆抗体和应用，特别涉及鹅免疫球蛋白λ链、α链、μ链、U链恒定区及其单克隆抗体，以及所述单克隆抗体在制备检测或纯化鹅免疫球蛋白试剂中的应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术：
我国是世界养禽大国，更是世界主要鹅类养殖地和消费国，鹅类养殖业的持续、稳定、健康发展不仅直接关系到我国新农村建设中畜牧业的健康稳定发展，而且关系到人们的生活方式和健康水平。免疫球蛋白IgM、IgG和IgA是体液免疫的重要效应分子，其含量的变化可以作为 检验机体免疫状况和感染情况的指标之一。IgM、IgG分别是感染早期和机体抗感染的重要抗体类型，血清中抗体水平的测定可作为免疫或感染的重要指征。IgA是黏膜免疫的主要因子，其水平的测定可作为黏膜免疫的重要指征。抗免疫球蛋白抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体，可用于检测机体内免疫球蛋白的含量，进而作为疾病诊断与免疫防治的重要工具。王君伟等(2006，CN1817005A)用无水硫酸钠和Sephadex G-200纯化的鸭卵黄免疫球蛋白作为免疫原，制得兔抗鸭IgY+IgY(AFc) (H+L)多克隆抗体，经辣根过氧化物酶标记后用于检测鸭机体受到刺激后所产生的特异性抗体，并应用于鸭类疾病的检测。王君伟等(2006，CN1818651)用无水硫酸钠和Sephadex G-200纯化的鹅卵黄免疫球蛋白作为免疫原，制得兔抗鹅IgY+IgY( Λ Fe) (H+L)多克隆抗体，经辣根过氧化物酶标记后用于检测鹅机体受到刺激后所产生的特异性抗体,并应用于鹅类疾病的检测。但多克隆抗体主要来源于动物免疫血清，是多种不同抗原表位特异性抗体的混合，特异性不高，常出现交叉反应，其应用受到一定的限制。McAb具有高度的特异性，已被广泛应用于人类和动物医学方面生物活性物质的鉴定和纯化、病原微生物的鉴定、特定抗原成分的定位功能分析以及疾病的快速诊断和动物免疫水平检测，可与标记物直接偶联制备的单克隆二抗，直接用于临床检测，并有利于实际操作技术的标准化和简便化。抗免疫球蛋白单克隆抗体的研究在人疾病的诊断及应用方面比较系统成熟，哺乳类动物在此方面的研究相对比较成熟，而禽类在此方面的研究相对比较滞后。Van Zaane，D等(1987年)制备和鉴定了针对猪不同免疫球蛋白类和型的单抗，所制备的单抗已成功用于检测猪各种病毒所产生同种型的抗体；赵莉(2006年)用原核表达的鸡IgMy链蛋白作为免疫原，采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠，四免后进行融合，采用真核表达的鸡、猪、牛IgMy链蛋白来筛选单克隆抗体，制备出与鸡、猪、牛IgMy链有交叉反应性的抗鸡IgMy链单克隆抗体；张红等(2008年)用真核表达的带有信号肽的鸡IgA轻链作为免疫原，制备出抗鸡IgX轻链单克隆抗体；王文强等(2010年)以新鲜的鸡胆汁为材料，采用硫酸铵盐析法从鸡胆汁中粗提纯鸡SIgA，SDS-PAGE纯化的SIgA重链为抗原，制备抗SIgA重链的免疫球蛋白；KothloW，S等(2005年)制备了一系列与鸭白细胞表面抗原反应的单克隆抗体，包括一株与鸭免疫球蛋白轻链反应的单克隆抗体，并用制备的单克隆抗体建立了 B型鸭肝炎病毒的替代感染模型；KothloW，S等(2011年)用抗鸭免疫球蛋白轻链单克隆抗体建立了一种检测水禽NDV的免疫学方法，而有关抗鹅免疫球蛋白单克隆抗体的研究国内外尚未见报道。制备抗免疫球蛋白的单克隆抗体，抗原多用但不仅限于从血清、卵黄等原料中纯化出天然的免疫球蛋白。常见的免疫球蛋白纯化方法为先将原料利用盐析法初步提取，得到粗提物后再经非亲合层析的方法进行纯化。贺云霞等(2005年)采用三氯甲烷去脂、无水Na2SO4盐析、DEAE23纤维素层析相结合的方法纯化鹅卵黄IgY，SDS-PAGE检测表明，所得的鹅卵黄IgG纯度可达93% ;贾晓伟等(2010年)以新鲜的鹅血为原料通过饱和硫酸铵盐析的方法对鹅血清中的IgG进行分离提取，得到IgG粗提物，然后经过s印hadexG-50凝胶层析和DEAE-52阴离子交换层析等纯化方法，将制备的IgG进一步纯化，得到纯度95%以上的IgG ;浙江大学(2010，CN101899110A)发明了一种从鹅血中分离免疫球蛋白IgY(AFc)的方法，先制备出脱脂血浆，辛酸沉淀，然后用填充有混合模式吸附剂的层析柱分离上清液，最 后脱盐和干燥，得到纯度大于95%的免疫球蛋白IgY(AFc) ;D.A. Higgins等(1994年)采用Protein A和Protein G亲和层析的方法纯化鸭血清免疫球蛋白，得出Protein A的纯化效果优于Protein G，但均不如哺乳动物理想，并推测亲和层析的结合原理可能和其特定的氨基酸组成有关，目前未见有亲和层析的方法应用于鹅免疫球蛋白的纯化的研究。抗免疫球蛋白单克隆抗体的鉴定，可用天然免疫球蛋白或外源表达的免疫球蛋白片段进行。免疫球蛋白基因的克隆和应用，人和小鼠的研究比较完善，而鸟纲类的研究报道相对较少。Reynaud，C A和Dahan，A等(1983年)从脾cDNA文库中分别筛选出编码鸡λ型轻链免疫球蛋白和μ型重链免疫球蛋白恒定区的cDNA全序列；Parvari，R等(1988年)从脾cDNA文库中筛选出编码鸡u型重链免疫球蛋白的cDNA全序列；Magor，K E等于1994年克隆得出编码鸭轻链和u链免疫球蛋白的编码序列又于1998年克隆得出编码鸭免疫球蛋白α链和μ链的编码序列。目前有关鹅免疫球蛋白基因方面的研究报道除了吕雪峰(2011,CN 102161993Α)采用RACE方法扩增出整条鹅轻链IgX基因外，国内外尚未见其它相关报道，这也给开展鹅基础免疫方面的研究工作带来一定的困难。

发明内容
本发明的目的之一在于提供鹅免疫球蛋白λ链的前导区、可变区、J片段和恒定区，重链的可变区、D片段和J片段，μ链、α链、U链的恒定区氨基酸序列及其编码核苷酸序列；本发明的目的之二在于提供所述的鹅免疫球蛋白λ链的前导区、可变区、J片段和恒定区，重链的可变区、D片段和J片段，μ链、α链、U链的恒定区在制备检测抗鹅免疫球蛋白抗体试剂中的应用；本发明的目的之三在于提供免疫球蛋白λ链、μ链、α链、υ链恒定区在制备检测抗鹅免疫球蛋白抗体试剂中的应用，及在制备抗鹅免疫球蛋白或鹅免疫球蛋白λ链、μ链、α链、U链恒定区抗体中的应用及其在鉴别与抗鹅免疫球蛋白单克隆抗体所结合的鹅免疫球蛋白的类和型中的应用。本发明的目的之四在于提供一种利用本发明的鹅免疫球蛋白λ链、μ链、α链、u链恒定区制备抗鹅免疫球蛋白恒定区的单克隆抗体的方法。本发明的目的之五在于提供一种由本发明方法制备得到的抗鹅免疫球蛋白恒定区的单克隆抗体，及分泌该抗体的杂交瘤细胞株。本发明的目的是通过以下技术方案实现的本发明的鹅免疫球蛋白编码区，其特征在于所述的鹅免疫球蛋白编码区为鹅免疫球蛋白λ链的前导区、鹅免疫球蛋白λ链可变区、鹅免疫球蛋白λ链J片段、鹅免疫球蛋白λ链恒定区、鹅免疫球蛋白重链可变区、鹅免疫球蛋白重链D片段、鹅免疫球蛋白重链J片段、鹅免疫球蛋白α链恒定区 、鹅免疫球蛋白μ链恒定区或鹅免疫球蛋白υ链恒定区。其中，所述的鹅免疫球蛋白λ链前导区具有如SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列；其中，所述的鹅免疫球蛋白λ链可变区具有如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；其中，所述的鹅免疫球蛋白λ链J片段具有如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列；其中，所述的鹅免疫球蛋白λ链恒定区具有如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列；其中，所述的鹅免疫球蛋白重链的可变区具有如SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列；其中，所述的鹅免疫球蛋白重链的D片段具有如SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列；其中，所述的鹅免疫球蛋白重链的J片段具有如SEQ ID NO. 7所示的氨基酸序列；其中，所述的鹅免疫球蛋白α链恒定区具有如SEQ ID NO. 8所示的氨基酸序列；其中，所述的鹅免疫球蛋白μ链恒定区具有如SEQ ID NO. 9所示的氨基酸序列；其中，所述的鹅免疫球蛋白υ链恒定区具有如SEQ ID NO. 10所示的氨基酸序列。本发明还提供了编码以上所述的鹅免疫球蛋白编码区的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列为编码鹅免疫球蛋白λ链前导区的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白λ链可变区的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白λ链J片段的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白λ链恒定区的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白重链可变区的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白重链D片段的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白重链J片段的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白α链恒定区的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白μ链恒定区的核苷酸序列或编码鹅免疫球蛋白υ链恒定区的核苷酸序列。优选的，所述的编码鹅免疫球蛋白λ链前导区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示；所述的编码鹅免疫球蛋白λ链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示；所述的编码鹅免疫球蛋白λ链J片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13所示；所述的编码鹅免疫球蛋白λ链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 14所示；所述的编码鹅免疫球蛋白重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15所示；所述的编码鹅免疫球蛋白重链D片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示；所述的编码鹅免疫球蛋白重链J片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示；所述的编码鹅免疫球蛋白α链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示；所述的编码鹅免疫球蛋白μ链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 19所示；所述的编码鹅免疫球蛋白υ链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示。本发明还提供了以上所述的鹅免疫球蛋白编码区在制备检测抗鹅免疫球蛋白抗体试剂中的应用。当然，含有以上所述的任一条核苷酸序列表达载体以及含有所述的表达载体的宿主菌也应在本发明保护的范围之内。进一步的，本发明提供了抗所述的鹅免疫球蛋白编码区的抗体，所述抗体包括抗鹅免疫球蛋白λ链恒定区的单克隆抗体或多克隆抗体、抗鹅免疫球蛋白α链恒定区的单克隆抗体或多克隆抗体、抗鹅免疫球蛋白μ链恒定区的单克隆抗体或多克隆抗体、抗鹅免疫球蛋白υ链恒定区的单克隆抗体或多克隆抗体。再进一步的，本发明提供了所述的鹅免疫球蛋白编码区在制备检测抗鹅免疫球蛋白抗体试剂中的应用；及\或在鉴别与单克隆抗体所结合的鹅免疫球蛋白类和型中的应用；及\或在制备抗鹅免疫球蛋白抗体中的应用，优选的所述的抗体为单克隆抗体。本发明还提供了一种制备抗鹅免疫球蛋白编码区的单克隆抗体的方法，其特征在于包括以下步骤 (I)免疫原的制备采用Protein A进行亲和层析纯化鹅血清免疫球蛋白，SDS-PAGE检测蛋白纯化效果，并于4°C透析，得到纯化的鹅血清免疫球蛋白；(2)杂交瘤细胞株的制备将纯化的鹅血清免疫球蛋白作为免疫原用于BALB/c小鼠的免疫,然后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞株；(3)单克隆抗体结合类型的鉴定分别用原核表达纯化的鹅免疫球蛋白λ链、α链、μ链、U链恒定区作为抗原包被酶标板，以阳性杂交瘤细胞株在培养上清中分泌产生的单克隆抗体为一抗，采用间接ELISA方法，鉴别出针对不同类和型鹅免疫球蛋白所筛选出的阳性杂交瘤细胞株，继而得到由该种杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体；其中，所述的鹅免疫球蛋白λ链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；其中，所述的鹅免疫球蛋白α链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 14所示；其中，所述的鹅免疫球蛋白μ链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 15所示；其中，所述的鹅免疫球蛋白υ链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 16所示。具体的，本发明以Protein A亲和层析一步法纯化鹅血清免疫球蛋白制得免疫原，采用短程免疫方式(一免21d后加强免疫)制备抗鹅免疫球蛋白单克隆抗体，经原核表达的免疫球蛋白λ链、μ链、α链、υ链恒定区作为抗原，用间接ELISA方法对所制得的抗鹅免疫球蛋白单克隆抗体进行分类筛选，分类后的单克隆抗体经Western blot进一步鉴定后，制备腹水并经Protein G亲和层析纯化，超滤离心柱浓缩。按照以上所述的方法制备得到了两株能够分泌抗鹅免疫球蛋白λ链恒定区单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合产生，分别命名为1B11、3G9，其中IBll株杂交瘤细胞保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 6005，分类命名为杂交瘤细胞，保藏日期为2012年4月16日；由所述的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。本发明采用亲和层析方法纯化的鹅血清免疫球蛋白作为免疫原，制备抗鹅免疫球蛋白单克隆抗体，并且制备的特异性单克隆抗体可进行如下应用抗鹅免疫球蛋白恒定区单抗可与亲和层析介质藕联，用于鹅相应免疫球蛋白的纯化；应用酶联免疫方法，以鹅免疫球蛋白恒定区的重组蛋白作为包被抗原，以ProteinA亲和层析纯化的鹅免疫球蛋白作为标准品，建立定量检测特异性免疫球蛋白含量的ELISA方法；抗鹅免疫球蛋白恒定区的单克隆抗体分别经HRP和FITC标记后，可用于鹅相应免疫球蛋白检测的相关研究，如鹅免疫球蛋白的个体发育、鹅免疫抗体的消长规律、免疫应答水平监测及病原诊断等。以制备的抗鹅免疫球蛋白λ链恒定区单克隆抗体为例，可进行如下应用制得的抗鹅免疫球蛋白λ链恒定区单克隆抗体，与NHS活化的填料螯合，并用乙醇胺封闭单克隆抗体未螯合的结合位点，然后平衡制得的单克隆抗体亲和层析柱，将鹅血清免疫球蛋白用制得的单克隆抗体亲和层析柱纯化，取得了较理想的纯化效果；将原核表达纯化后的鹅免疫球蛋白λ链恒定区重组蛋白rGoCL作为抗原包被酶标板，同时将亲和层析制得的鹅免疫球蛋白以一定的浓度倍比稀释后与制得的特异性单克隆抗体(稀释至工作浓度)等体积混合，于4°C孵育过夜，作为一抗使用，采用间接ELISA方 法建立一种定量测定免疫球蛋白含量的方法；制备的抗鹅免疫球蛋白λ链恒定区单克隆抗体，经HRP标记后，可作为二级试剂，用于检测鹅免疫BSA后机体产生的特异性抗体及其消长规律，并可用于监测机体的免疫状态；经FITC标记后，可与表达鹅免疫球蛋白λ链恒定区的ΒΗΚ-21细胞结合，可用于特异性抗体在组织器官内的免疫学分析。与现有技术相比，本发明的有益效果在于I、本发明首次采用Protein A亲和层析一步法纯化的鹅血清免疫球蛋白作为免疫原制备抗鹅免疫球蛋白单克隆抗体，同时采用原核表达的免疫球蛋白恒定区重组蛋白筛选出针对不同类别免疫球蛋白的单克隆抗体，最终采用Western blot方法进一步验证所得的鹅免疫球蛋白单克隆抗体，结果确实可靠。2、本发明所制备的抗鹅免疫球蛋白恒定区单克隆抗体可作为机体受到刺激后免疫状态的整体监测及特异性抗体的的检测，与IgA特异性结合的抗鹅免疫球蛋白α链恒定区单克隆抗体可用于鹅机体黏膜免疫的基础研究，与IgM特异性结合的抗鹅免疫球蛋白μ链恒定区单克隆抗体可用于鹅机体感染后的早期诊断，与IgY特异性结合的抗鹅免疫球蛋白υ链恒定区单克隆抗体可以用作鹅机体感染后的主要检测试剂。总之，所制得的抗鹅免疫球蛋白恒定区单克隆抗体经标记物偶联后，可用于特异性抗体的检测，对鹅传染病的感染作出早期诊断，以及应用同一套试剂能快速检出多种传染病；同时，还可作为基础试剂研究黏膜免疫的发生机制以及评价黏膜疫苗的免疫效果。另夕卜，针对鹅免疫球蛋白的一整套单抗将促进并有利于鹅免疫系统更深入的研究。3、本发明用单克隆抗体制备的亲和层析柱纯化鹅免疫球蛋白的方法，具有简便，纯化效率高，特异性好等优点，可纯化出不同类别的免疫球蛋白。4、本发明建立的定量测定鹅免疫球蛋白含量的方法，可简单快速的测定出不同类别免疫球蛋白的含量，以了解鹅机体的体液免疫状态，更好的监测群体免疫状态。5、本发明采用RT-PCR和巢式PCR结合的方法，克隆出了鹅免疫球蛋白λ链、α链、μ链、υ链恒定区的编码序列，填补了鹅免疫球蛋白基因水平研究的空白。构建鹅免疫球蛋白λ链、μ链、α链、U链恒定区的表达载体，表达并纯化出鹅免疫球蛋白CA、Ca、CU、Cu的重组蛋白，具有来源简单、背景清楚、成本低、表达产物容易纯化、稳定性好的特点，并且用原核表达的蛋白作为抗原提供了一种鉴别抗不同类和型的鹅免疫球蛋白单克隆抗体的方法，同时制备了与其它禽类血清有抗原抗体反应的多克隆抗体，探测了禽类免疫球蛋白上B细胞抗原表位的存在情况。


图I为Ig-L 5'端基因的克隆； 1-5为梯度PCR (目的片段大小为703bp)图2为Ig-L 3'端基因的克隆；1-5为梯度PCR (目的片段大小为365bp)图3为鹅免疫球蛋白λ链恒定区的PCR扩增(目的片段大小为308bp)；图4为原核表达的鹅免疫球蛋白λ链恒定区重组蛋白rGoCL的SDS-PAGE分析；标号说明1、非预染Marker ;2、全菌体蛋白；3、菌体超声后上清；4、菌体超声后沉淀；5、纯化后蛋白；6、空载体诱导；图5为IgA中间部分基因的克隆；1-5为梯度PCR (目的片段大小为646bp)图6为IgA3'端部分基因的克隆；1-5为梯度PCR (目的片段大小为803bp)图7为IgA恒定区5'端基因的克隆；1-5为梯度PCR (目的片段大小为457bp)图8为IgA 5'端部分基因的克隆；1-5为梯度PCR (目的片段大小为564bp)图9为IgM中间部分基因的克隆；1-5梯度PCR (目的片段大小为609bp)图10为IgM 3'端部分基因的克隆；1-5为梯度PCR (目的片段大小为401bp)图11为IgY中间部分基因的克隆；1-5为梯度PCR (目的片段大小为489bp)图12为IgY 3'端部分基因的克隆；1-5为梯度PCR (目的片段大小为801bp)图13为Protein A亲和层析纯化鹅血清免疫球蛋白；图14为制备的抗鹅免疫球蛋白单克隆抗体的特异性鉴定；图15为抗鹅免疫球蛋白λ链恒定区单克隆抗体的Western分析；标号说明1、Western Marker ;2、鹅血清；3、重组蛋白rGoCL全菌体；4、鹅胆汁；图16为HRP标记的抗鹅免疫球蛋白λ链恒定区单克隆抗体测定鹅特异性抗体消长规律；标号说明a为免疫BSA后机体内特异性抗体的消长规律；b为免疫小鹅瘟病毒病毒样粒子后机体内特异性抗体的产生；图17为FITC标记的抗鹅免疫球蛋白λ链恒定区单克隆抗体与表达鹅免疫球蛋白λ链恒定区细胞结合的鉴定；
标号说明A. pcDNA3. I-IgQ转染BHK-21细胞与IBll株杂交瘤细胞培养上清；B.pcDNA3. I-IgCL 转染的 BHK-21 细胞与 FITC 标记的 IBll 株单抗;C. pcDNA3. l_IgCL 转染ΒΗΚ-21细胞与鼠阳性血清；F. pcDNA3. I-IgQ转染BHK-21细胞与鼠阴性血清；G. pcDNA3. I空质粒pcDNA3. I-IgCL转染的BHK-21细胞与IBll株杂交瘤细胞培养上清图18为抗鹅免疫球蛋白λ链恒定区单克隆抗体制备的亲和层析柱纯化鹅血清免疫球蛋白；
标号说明I、非预染Marker ;2、鹅血清；3、流出液；4_8、洗涤液洗涤；9_13、洗脱液洗脱；图19为使用抗鹅免疫球蛋白λ链恒定区单克隆抗体定量测定免疫球蛋白含量的标准曲线；图20为抗鹅免疫球蛋白λ链恒定区多克隆抗体Western鉴定；M> Western Marker ;1、鹅血清；2、纯化后的重组蛋白rGoCL ;3、鹅胆汁；图21为抗鹅免疫球蛋白λ链恒定区多克隆抗体的反应性的ELISA分析；图22为抗鹅免疫球蛋白λ链恒定区多克隆抗体的反应性的Western blot分析；标号说明M.蛋白分子质量标准；1、鸡血清；2、鸭血清；3、鹅血清；4、火鸡血清；5、乌鸡血清；6、绿头鸭血清；7、丹顶鹤血清；8、rGo-CL全菌体
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例I鹅免疫球蛋白λ链、α链、μ链、υ链及其恒定区cDNA序列的克隆I.鹅脾总RNA的提取取新鲜鹅脾,立即在液氮中研碎,使用Trizol试剂(invitrogen)提取RNA。具体操作如下每IOOmg组织加入Iml Trizol试剂,室温放置IOmin ;每使用Iml TRIzol加入O. 2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置15min,4°C以12000rpm离心15min ;转移水相至新管中，并用2. 5倍体积的异丙醇于-20°C沉淀水相中的RNA，然后4°C以12000rpm离心15min ；用Iml的75%乙醇(每使用Iml TRIzol至少加Iml 75%乙醇)洗涤RNA沉淀，4°C以IOOOOrpm离心5分钟，弃上清；室温放置干燥5 lOmin。用50 μ I的无RNase的水溶解沉淀，并测定 RNA 含量。取 50μ g 提取的总 RNA，加入 5μ I 的 IOXDNase I Buffer，2 μ I 的 DNase I(RNase-free,5U/y 1),0. 5μ I 的 RNase Inhibitor (40U/y I )，DEPC 处理水加至 50 μ I 体系,37°C处理30min后,用50 μ I RNase Free dH20定容至100 μ I后加入等体积的苯酹/氯仿/异戍醇(25 24 I)混勻；室温，12000rpm离心5min,取上清；加入等体积的氯仿/异戊醇(24 I)混匀；室温，12000rpm 5min离心，取上清；加入10 μ I 3Μ醋酸钠，Iyl的核酸助沉剂，250 μ I冷乙醇，冰上放置IOmin ；4°C, 12000rpm 15min离心，弃上清；加入70%冷乙醇洗净，4°C, 12000rpm 5min离心,弃上清,干燥沉淀,用适量的无RNase水溶解沉淀。2.鹅免疫球蛋白λ链及其恒定区编码序列的克隆和蛋白表达纯化a.鹅免疫球蛋白λ链cDNA序列的5'端克隆参考GenBank 上已发表的鸡 λ IgL (Μ33050. I)和鸭 λ IgL (Χ82069. I)编码序列，应用软件Primer Premier 5. O在保守区分别设计引物SL1(5' -TTGGTACC十,ATGGCCTGGGCCCCTCT-3')和 ALl (5' - GGCTAGCACTCGGATTTGTTCA-3')，并以鹅脾总 RNA 为模板，特异性引物ALl为反转录引物，按照RTase M-MLV (RNase H-)试剂盒说明书进行反转录合成cDNA第一链，然后以cDNA第一链为PCR扩增模板，SLl和ALl为扩增引物，采用Pfu高保真性DNA聚合酶(天根，北京)进行PCR扩增，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测(图I)。切取目的大小相符的条带，并参照试剂盒说明书进行DNA的纯化和回收。回收产物经过加“A”处理后克隆至pMDlS-T载体中，重组子经PCR和酶切鉴定正确后测序，获得的序列在 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上经 Blast 比对分析。b.鹅免疫球蛋白λ链cDNA序列的3'端克隆利用NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上的 Blast 软件在线分析测序得到的鹅免疫球蛋白λ链的5'端cDNA片段，发现其与鸭免疫球蛋白λ链cDNA序列的同源性最高，符合预期结果。根据已经测得的序列设计2条特异性上游引物SL31 (5 ' -TCTCCCAGCATCTACCTC-3 ')和 SL32 (5 ' -GAGGCAGAGCAACAACCAGTA-3 ')，同时利用mRNA 3'端具有PloyA尾的特点设计一对用于扩增鹅免疫球蛋白3'端编码序列的通用锚定引物 AR3-1 (5 ' -ATTAGCGGCCGCGATATCEcoE v TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')和 AR3-2 (5; -ATTAGCGGCCGCGATATq^pT-3')作为下游引物，以鹅脾总RNA为模板，大连宝生物的Oligo d(T) 18引物为反转录引物，按照RTase M-MLV(RNase H-)试剂盒说明书进行反转录合成的用于扩增鹅免疫球蛋白3'端编码序列的通用模板，以SL31和AR3-1为引物，采用Pfu高保真性DNA聚合酶进行巢式PCR第一步扩增，然后取扩增的PCR产物作为模板，SL32和AR3-2为引物，同样用Pfu高保真性DNA聚合酶进行巢式PCR第二步扩增，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测(图2)。切取与目的大小相符的条带，并参照回收试剂盒说明书进行DNA的纯化和回收。回收产物经过加“A”处理后克隆至pMD18-T载体中，经PCR及酶切鉴定正确后测序，获得的序列在NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上经Blast比对分析。将得到的鹅免疫球蛋白λ链5'端和3'端编码序列片段分别比对分析，并进行序列拼接，得到鹅免疫球蛋白λ链cDNA全序列，同时运用生物学相关软件对拼接所得的序列进行生物学分析用Lasergene软件进行序列比对分析、相似性分析及B细胞抗原表位预测；用Clustal X和MEGA 5. O软件进行进化树的构建分析；同时通过在线分析软件进行信号肽预测分析、糖基化分析、3D结构分析。分析得出克隆的鹅免疫球蛋白λ链cDNA全序列包括鹅免疫球蛋白λ链的3’UTR区以及前导区、可变区、J片段和恒定区编码序列，其前导区、可变区、J片段和恒定区的cDNA序列分别如SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12, SEQ IDNO. 13,SEQ ID NO. 14所示，其编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQ IDNO. 3、SEQ ID NO. 4 所示。c.鹅免疫球蛋白λ链恒定区的原核表达与纯化参考克隆得到的鹅免疫球蛋白λ链cDNA全序列设计一对用于表达鹅免疫球蛋白λ 链恒定区的引物 SLC (5' -ACGGATCCBamHITCTCCCAGCATCTACCTC-3')和 ALC (5' -CTAAAGCTTni^mGTTCAGGGTCTTCTCGGTG-3;)，并以鹅脾总 RNA 为模板，大连宝生物的 Oligo cKT) 18引物为反转录引物，按照RTase M-MLV (RNase H-)试剂盒说明书进行反转录合成cDNA第一链，并以cDNA第一链为PCR扩增模板，以表达引物SLC和ALC为扩增引物，采用Pfu高保真性DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测(图3)。切取与目的大小相符的条带，并参照回收试剂盒说明书进行DNA的纯化和回收。将纯化回收产物和pET30a(+)质粒分别经BamH I和Hind III双酶切后，参照回收试剂盒说明书进行DNA的纯化和回收，回收产物经T4DNA连接酶(NEB)于16°C连接过夜，转入大肠杆菌感受态TGl中，重组子经PCR和酶切鉴定分析正确后测序，得到鹅免疫球蛋白λ链恒定区cDNA序列的编码序列，如SEQ ID NO. 14所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，并将测序获得的序列用DNAMAN生物学软件进行比对分析，同时将鉴定正确的重组子转化到大肠杆菌感受态R0SettaTM(DE3)plySS中，挑取单个菌落接种于LB液体培养基中，37°C培养过夜。以1%的比例分别将含有重组子质粒pET30a-IgQ和质粒pET-30a(+)的菌液接种于20ml含有卡那霉素的LB培养基中，37°C培养。待菌液浓度分别到OD6tltol为O. 6左右时，加入IPTG (浓度O. 2 I. Ommol/L),分别经16°C诱导表达24h，28°C诱导表达8h和37°C诱导表达6h ;经分光光度计测得OD6tltlnm后，培养物离心后用其O. 05 X OD600nm倍体积的PBS重悬，超声破碎后 收集上清和沉淀，经12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，结果表明经过一系列的优化表达，在20kDa处得到了大量以可溶形式表达的目的蛋白(图4)。参照前面优化后的诱导表达方法对重组蛋白rGoCL进行大量诱导，诱导后的菌液4°C，5000rpm，离心20min，收集菌体沉淀，每毫升菌液沉淀用O. 05 X OD600nm倍体积LEBuffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl7PH 8. O)悬浮，反复冻融三次后在冰浴条件下超声波裂解，方法同上。超声后的产物于4°C，IOOOOrpm离心20min，吸取上清用O. 45 μ m滤膜过滤，用于蛋白的纯化，具体方法如下I)将过滤后的菌体裂解产物加入到Ni-NTA柱中，室温下旋转晃动30 60min，收集少量流出液。2)用 I 倍体积 Wash Buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，IOmM 咪唑，ΡΗ8· O)洗涤
柱子4 6次，收集少量的流出液。3)分别用 I 倍体积的 Elution Buffer A(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，IOOmM 咪唑，ΡΗ8· 0)和 Elution Buffer B (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，200mM 咪唑，PH8. 0)洗脱目的蛋
白4 6次，收集全部的洗脱液。4)处理所收集的全部溶液，SDS-PAGE分析蛋白纯化效果。结果表明，经过Ni-NTA亲和纯化，得到单一条带的目的蛋白(图6)。纯化后的目的蛋白装入透析袋中，放于TGE透析液(50mMTris-HCl，0. 5mM EDTA,50mM NaCl, 5%甘油)中4°C透析72h，换液数次。透析后取少量样品用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，其余的放于_20°C备用。3.鹅免疫球蛋白α链恒定区以及重链的可变区、D片段和J片段编码序列的克隆a.鹅免疫球蛋白α链恒定区部分片段的克隆参考GenBank 上已发表的鸡 IgA (S40610. I)和鸭 IgA (U27222. I)α链编码序列，应用软件Primer Premier 5. O在保守区分别设计引物SAl(5' -CAACGTCACCATCGGCTGCCT-3')和 AAl (5 ' -CGGGGGGAAGACGTAGACGGA-3')，并以鹅脾总RNA为模板，特异性引物AAl为反转录引物，按照RTase M-MLV (RNase H-)试剂盒说明书进行反转录合成的cDNA第一链，然后以cDNA第一链为PCR扩增模板，以SAl和AAl为扩增引物，采用Pfu高保真性DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测(图5)。切取与目的大小相符的条带，并参照回收试剂盒说明书进行DNA的纯化和回收。回收产物经过加“A”处理后克隆至pMD18-T载体中，重组子经PCR和酶切鉴定正确后测序，获得的序列在NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上经Blast比对分析。b.鹅α链免疫球蛋白cDNA的:V端克隆利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上 Blast 软件在线分析测序得到的鹅免疫球蛋白α链的恒定区的部分cDNA序列，发现其与鸭免疫球蛋白α链cDNA序列的同源性最高，符合预期结果。根据已经测得的序列设计特异性引物SA31(5' -GCTACCCGACCCAAGAAGA-3 ')和 SA32 (5 ' -CTCAAGGAGCCCATCGTCAAGT-3 ')，同时利用通用锚定引物作为下游引物AR3-1和AR3-2，并以扩增鹅免疫球蛋白3'端编码序列的通用模板为扩增模板，SA31和AR3-1为引物，采用Pfu高保真性DNA聚合酶进行巢式PCR第一步扩增，然后取扩增的PCR产物作为模板，SA32和AR3-2为引物，同样用Pfu高保真性DNA聚合酶进行巢式PCR第二步扩增，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测(图6)。切取与目的大小相符的条带，并参照回收试剂盒说明书进行DNA的纯 化和回收。回收产物经过加“A”处理后克隆至pMD18-T载体中，经引物SA32和鉴定引物AA3 (5丨-ATTAGCGGCCGCGATATCT-3丨)PCR鉴定分析及酶切鉴定正确后测序，获得的序列在NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上经 Blast 比对分析。c.鹅免疫球蛋白α链恒定区cDNA序列的5'端克隆利用NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上 Blast 软件在线分析测序得到的鹅免疫球蛋白α链的恒定区cDNA的部分片段和3'端编码序列，拼接后发现其与鸭免疫球蛋白α链cDNA的同源性最高，符合预期目标。根据已经测得的序列设计特异性引物AA12(5; -AGGTTCTGGACCACCCCGTTCAC3')，并参考鸭免疫球蛋白α链恒定区编码序列设计一条上游引物SA12 (5' -TAATGTCTCCGCCACCCGCCCCA-3')，同时以特异性引物AAl为反转录引物反转录的cDNA第一链为PCR扩增模板，以SA12和AA12为扩增引物，采用Pfu高保真性DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测(图7)。切取与目的大小相符的条带，并参照回收试剂盒说明书进行DNA的纯化和回收。回收产物经过加“A”处理后克隆至PMD18-T载体中，重组子经以SAl和AA12为引物的PCR鉴定和酶切鉴定正确后测序，获得的序列在NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上经Blast比对分析。d.鹅免疫球蛋白α链cDNA序列的5'端克隆利用DNAMAN软件比对拼接所得的鹅免疫球蛋白α链cDNA序列的3个片段，并将拼接后的结果比对分析，为得到完整的鹅免疫球蛋白α链恒定区编码序列，根据已测的恒定区5 '端序列设计2条特异性下游弓I物GSP0-AA51(5' -TCTTCTTGGGTCGGGTAGCT-3')和 GSPI-AA52 (5' -TTGACCTTGCACTCGAAGGAGTTG-3')，鉴于鹅免疫球蛋白 mRNA 5'端含有复杂的二级结构的特点，设计合成一对用于扩增鹅免疫球蛋白编码序列的通用锚定引物SR5-1(5' -ACGGATGCTGCTGCGAATTq』,CCCCCCCCCCCCCCC-3')和 SR5_2(5' -ACGGATGCTGCTGCGAATTC“。, -3')，扩增鹅免疫球蛋白α链的5'端序列。具体方法如下I)将以ΑΑ12为引物反转录合成的鹅脾cDNA为模板，按照说明书用RNase H于30°C水浴处理lh，加入1/10体积的3M NaOAC(PH5. 2)，1/100体积的核酸助沉剂(BioTeck)以及2. 5倍体积的冷无水乙醇，-20°C放置60min。离心回收沉淀，用70%的无水乙醇洗涤一次，真空干燥，无菌去离子水溶解。
2) cDNA加尾反应，步骤如下依次在无菌微量离心管管中加入DNA5g、5XTdT Buffer 10 μ 1,0. 1%BSA 5μ1、IOmM dGTP (终浓度0. 5mM)2. 5μ l、TdT 15U，最后用去离子水补足50 μ I体系，然后于37°C水浴中反应30min，加入50 μ I的苯酚/氯仿/异戊醇(25 24 I )，充分混匀，离心，取上层移至另一微量离心管中，加入50μ I的氯仿/异戊醇(24 1)，充分混匀，离心，取上层移至另一微量离心管中，加入5 μ I的3Μ NaOAC (ΡΗ5. 2)，O. 5 μ I的核酸助沉剂和125 μ I的冷无水乙醇，_20°C放置60min。离心回收沉淀,用70%的无水乙醇洗漆一次,真空干燥,无菌去离子水溶解。3)以上述cDNA加尾产物为模板，SR5-1和GSP0-AA51为引物进行巢式PCR第一步，取PCR扩增产物作为模板，SR5-2和GSPI-AA52为引物进行巢式PCR第二步，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测(图8)。切取与目的大小相符的条带，并参照回收试剂盒说明书进行DNA的纯化和回收。回收产物经过加“A”处理后克隆至pMD18-T载体中，经SA12和GS PI-AA52为扩增引物PCR鉴定以及酶切鉴定正确后测序，获得的序列在NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上经 Blast 比对分析。 将分段得到的鹅免疫球蛋白α链cDNA序列比对分析，并进行序列拼接，得到鹅免疫球蛋白α链cDNA序列，同时运用生物学相关软件对拼接所得的序列进行生物学分析用Lasergene软件进行序列比对分析、相似性分析及B细胞抗原表位预测；用Clustal X和MEGA 5. O软件进行进化树的构建分析；同时通过在线分析软件进行糖基化分析、3D结构分析。分析得出克隆的鹅免疫球蛋白α链cDNA序列包括鹅免疫球蛋白α链的3’UTR区和恒定区编码序列以及重链的可变区、D片段和J片段编码序列，其中α链恒定区的cDNA序列如SEQ ID NO. 18，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8 ;重链的可变区、D片段和J片段的cDNA序列分别如SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 17所示，其所编码的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6 和 SEQ ID NO. 7 所示。4.鹅免疫球蛋白μ链恒定区编码序列的克隆a.鹅免疫球蛋白μ链恒定区部分cDNA序列的克隆参考GenBank上已发表的鸡IgM(X01613. I)和鸭IgM(U27213. I) μ链编码序列，应用软件Primer Premier 5. O 在保守区分别设计引物 SM1(5' -CGTCCCGCGAGGACTTCGA-3')和AMl (5; -GGAGGAGGGGGGAAGACGTAGA-3')，并以鹅脾总RNA为模板，特异性引物AMl为反转录引物，按照RTase M-MLV(RNase H-)试剂盒说明书进行反转录合成的cDNA第一链，然后以cDNA第一链为PCR扩增模板，同时用引物SMl和AMl，采用Pfu高保真性DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测(图9)。切取与目的大小相符的条带，并参照回收试剂盒说明书进行DNA的纯化和回收。回收产物经过加“A”处理后克隆至pMD18-T载体中，重组子经PCR和酶切鉴定正确后测序，获得的序列在NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上经 Blast 比对分析。b.鹅免疫球蛋白μ链cDNA序列的3'端克隆利用NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上 Blast 软件在线分析测序得到的鹅免疫球蛋白α链恒定区的部分cDNA序列，发现其与鸭免疫球蛋白μ链cDNA序列的同源性最高，符合预期目标。根据已经测得的序列设计特异性引物SM31(5' -CGCCGACGAGTGGAACAAGG-3')和 SM32(5' -AAGCCCCCCGCCCTCTACGTCT-3')，同时以通用锚定引物作为下游引物AR3-1和AR3-2，并以扩增鹅免疫球蛋白3'端编码序列的通用模板为扩增模板，SM31和AR3-1为扩增引物，采用Pfu高保真性DNA聚合酶进行巢式PCR第一步扩增，然后取扩增的PCR产物作为模板，SM32和AR3-2为扩增引物，同样用Pfu高保真性DNA聚合酶进行巢式PCR第二步扩增，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测(图10)。切取与目的大小相符的条带，并参照回收试剂盒说明书进行DNA的纯化和回收。回收产物经过加“A”处理后克隆至pMD18-T载体中，经引物SM32和鉴定引物AM3^ -TTAATAGCAGGAGCTGGCGGTGT-3丨)PCR扩增及酶切鉴定正确后测序，获得的序列在NCBI (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/)上经 Blast 比对分析。将分段得到的鹅免疫球蛋白μ链编码序列比对分析，并进行序列拼接，同时运用生物学相关软件对拼接所得的序列进行生物学分析用Lasergene软件进行序列比对分析、相似性分析及B细胞抗原表位预测；用Clustal X和MEGA 5. O软件进行进化树的构建分析；同时通过在线分析软件进行糖基化分析、3D结构分析。分析得出克隆的鹅免疫球蛋白μ链序列中包括μ链的部分恒定区和3' UTR区，其恒定区的cDNA序列如SEQ ID NO. 19所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示。 5.鹅免疫球蛋白υ链恒定区编码序列的克隆a.鹅免疫球蛋白υ链恒定区cDNA序列的部分克隆参考GenBank 上已发表的鸡 IgY (X07174. I)和鸭 IgY (X65219. 1;AJ517505. I)υ链编码序列，应用软件Primer Premier 5. O在保守区分别设计引物SYl(5' -CAGAGCTGCAGCCCCATCCA-3')和 AY I (5' -TGGGGTGGTGACGAATTCGG-3')，并以鹅脾总RNA为模板，特异性引物AYl为反转录引物，按照RTase M-MLV(RNase H-)试剂盒说明书进行反转录合成的cDNA第一链，然后以cDNA第一链为PCR扩增模板，同时以引物SYl和AYl为扩增引物，采用Pfu高保真性DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测(图11)。切取与目的大小相符的条带，并参照回收试剂盒说明书进行DNA的纯化和回收。回收产物经过加“A”处理后克隆至pMD18-T载体中，重组子经PCR和酶切鉴定正确后测序，获得的序列在NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上经Blast比对分析。b.鹅免疫球蛋白υ链cDNA序列的3'端克隆利用NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上 Blast 软件在线分析测序得到的鹅免疫球蛋白α链的恒定区的部分cDNA序列，发现其与鸭免疫球蛋白υ链cDNA序列的同源性最高，符合预期目标。根据已经测得的序列设计特异性引物SY31(5/ -GCTTCCAGCCTGAGAACGTG-3')和 SY32(5' -AGCACTTCAACAGCACCTTCACG-3')，同时利用通用锚定引物作为下游引物AR3-1和AR3-2，并以扩增鹅免疫球蛋白3'端编码序列的通用模板为扩增模板，SY31和AR3-1为扩增引物，采用Pfu高保真性DNA聚合酶进行巢式PCR第一步扩增，然后取扩增的PCR产物作为模板，SY32和AR3-2为扩增引物，同样用Pfu高保真性DNA聚合酶进行巢式PCR第二步扩增，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测(图12)。切取与目的大小相符的条带，并参照回收试剂盒说明书进行DNA的纯化和回收。回收产物经过加“A”处理后克隆至pMDlS-T载体中，经PCR及酶切鉴定正确后测序，获得的序列在 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上经 Blast 比对分析。将分段得到的鹅免疫球蛋白U链编码序列比对分析，并进行序列拼接，同时运用生物学相关软件对拼接所得的序列进行生物学分析用Lasergene软件进行序列比对分析、相似性分析及B细胞抗原表位预测；用Clustal X和MEGA 5. O软件进行进化树的构建分析；同时通过在线分析软件进行糖基化分析、3D结构分析。分析得出克隆的鹅免疫球蛋白u链序列包括u链的部分恒定区和3' UTR区，其恒定区的cDNA序列如SEQ ID NO. 20所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示。实施例2抗鹅免疫球蛋白恒定区单克隆抗体的制备I、免疫原的制备 Protein A亲和层析纯化鹅血清免疫球蛋白的具体操作如下取出装Protein A填料(GenScript，南京)的柱子，将液体流去，去离子水洗涤2 3次(加入柱子内的液体均经 0.45 iim 的滤膜过滤)，并用 Wash Buffer (0. 15M NaCl,20mM Na2HPO4, PH 8.0)平衡柱子2 3次；加入用2倍Wash Buffer稀释的血清,不断转动柱子，使目的蛋白与填料充分结合，收集流出液；加入Wash Bufferlml,洗漆7 8次，收集流出液；加入ElutionBuffeH柠檬酸0. 1M, PH 2.8) lml，洗脱7 8次，收集流出液，并立即用IM Tris-base溶液中和至PH7. 4 ; SDS-PAGE检测蛋白纯化效果(图13)，并将目的蛋白用TGE透析缓冲液(50mMTris-HCl, 0. 5mM EDTA, 50mM NaCl，5% 甘油，PH 8. 0)于 4°C 中透析 72h，换液数次，分装保存。2、单克隆抗体的制备及性质鉴定动物免疫将0. 2mg亲和层析纯化后的鹅血清免疫球蛋白作为免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化均匀后，经背部皮下多点注射SPF级别的4 6周龄雌性BALB/c小鼠(50 Ug/只)。间隔三周后加强免疫，用免疫原(50 ii g/只)直接腹腔注射BALB/c小鼠，免疫3d后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，并分离其血清作为阳性血清。细胞融合取加强免疫后的BALB/c小鼠脾脏，制备单细胞悬液，离心后与对数生长期的SP2/0细胞分别计数后按照I : 5 I : 10的比例混合均匀，离心后弃去上清，使用PEG3350 (Sigma)溶液介导融合，通过加入含有HAT的RPMI 1640完全培养液筛选融合后的杂交瘤细胞，置于5%C02培养箱37°C培养。间接ELISA筛选方法的建立以纯化的鹅血清免疫球蛋白为抗原，分离的鼠阳性血清和阴性血清为一抗，采用矩阵法建立筛选阳性杂交瘤细胞株的间接ELISA方法，最终确定间接ELISA筛选条件为纯化的鹅血清免疫球蛋白(2. 46mg/mL)以0. OlM NaOHI 2000稀释后作为抗原4°C过夜包被酶标板，5%脱脂乳37°C封闭2h，阴、阳性血清以
I 800稀释后作为一抗37°C作用lh，HRP标记的羊抗鼠IgG I 10000稀释后作为二抗37°C作用 lh, TMB 显色，IM H2SO4 终止。杂交瘤细胞的筛选与克隆融合后的细胞5d后用HT选择培养液换出1/2培养液，7 IOd后用HT培养液培养，采用建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，第14d用含20%胎牛血清的完全1640培养液培养，再次用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株。将两次筛选均为阳性的杂交瘤细胞株，用有限稀释法进行细胞克隆培养，直至扩增的杂交瘤细胞均能稳定的增殖，并能大量分泌特异性抗体。将筛选出的阳性杂交瘤细胞株进行扩大培养，收集上清进行单克隆抗体亚类鉴定，结果显示3株杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体均属于IgGl亚类。将扩大培养的杂交瘤细胞液氮冻存，三个月后进行复苏鉴定，制备腹水，离心取上清，以0. 45 ii m的滤器过滤除菌,并采用Protein G亲和层析纯化制备的腹水。单抗的鉴定对获得的抗鹅免疫球蛋白单克隆抗体进行细胞染色体数分析、稳定性鉴定、腹水的效价测定、特异性鉴定。a、染色体数分析取对数生长期的杂交瘤细胞，经秋水仙素、0. 075mol/L的KCl溶液低渗处理，固定制片后染色，镜下观察染色体并计数。结果显示制备出的三株杂交瘤细胞1B1U2E3和3G9，染色体数目明显多于SP2/0细胞，大致为脾细胞和SP2/0细胞染色体数之和，符合杂交瘤细胞染色体分析结果。b、稳定性鉴定将冻存三个月后的阳性杂交瘤细胞株体外连续传代20次，并收集传代细胞上清，同时收集冻存前杂交瘤细胞的培养上清3 4代，并分别收集三3个月、12个月后复苏的杂交瘤细胞培养上清3 4代，间接ELISA检测检测收集的培养上清中的抗体效价，结果显示三株杂交瘤细胞在体外长期培养和冻存复苏后仍具有稳定分泌抗体的能力。C、腹水效价测定取制备好的单抗腹水，从I : 100开始倍比稀释，用建立的间接ELISA方法测定单抗IBll的腹水效价为I : 1638400 ;单抗2E3的腹水效价为I : 204800。
d、特异性鉴定将多种动物的血清(每种血清取4份，每份血清设3个重复孔)用0. OlM NaOHl 100倍稀释后包被酶标板，于4°C过夜孵育，PBST洗涤3次，加封闭液(5%脱脂乳)300 u L/孔，37°C封闭2h。PBST洗涤3次，将纯化后的腹水按工作浓度加入各反应孔中，IOOii L/孔，37°C作用lh, PBST洗涤3次，TMB显色，IM H2SO4终止。结果显示IBll和3G9株杂交瘤细胞株产生的抗体仅与鹅血清反应，与其他物种血清无任何反应性；2E3株杂交瘤细胞株产生的抗体能与鹅血清和鸭血清反应，而不与其他物种血清反应(图14)。3、单克隆抗体所结合的鹅Ig类、型鉴别方法ELISA鉴定分别采用原核表达纯化的鹅免疫球蛋白入链、a链、y链、u链恒定区重组蛋白作为抗原，阴阳性血清作为一抗,HRP标记山羊抗鼠IgG (I 10000)作为二抗，采用常规间接ELISA的矩阵方法确定单克隆抗体所结合的鹅免疫球蛋白Ig类和型鉴别方法的最佳抗原工作浓度及建立鉴别方法的最适工作浓度的阴阳性对照。然后分别用原核表达纯化的鹅免疫球蛋白、链、a链、ii链、u链恒定区以最适工作浓度分别作为抗原包被酶标板，以收集的阳性杂交瘤细胞株的上清为一抗，采用间接ELISA方法，鉴别出针对不同类、型的鹅免疫球蛋白所筛选出的阳性杂交瘤细胞株。Western blot分析同时将鹅血清、鹅胆汁和原核表达的的鹅免疫球蛋白恒定区全菌体经SDS-PAGE电泳后，用电转仪50mA电转印30 50min ;取下NC膜，放入5%脱脂乳中4°C封闭过夜；弃去封闭液，用PBST洗涤4 6次，每次5min，然后将其放入特异性单抗上清中，于37°C摇床60rpm孵育2h ;弃去单抗上清，PBST洗涤4 6次，每次5min，然后将其放入I : 2000倍稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG中，于37°C摇床上60rpm孵育Ih ;弃去二抗，用PBST洗涤4 6次，每次5min ;经4-CN底物显色液显色，出现反应条带后，立即用流水冲洗终止反应，观察结果(图15)。结果表明IBll和3G9株杂交瘤细胞产生的抗体均能与鹅血清和鹅胆汁中的免疫球蛋白轻链、原核表达的重组蛋白rGoCL发生特异性的抗原抗体反应。其中IBll株杂交瘤细胞保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCCNo. 6005，保藏日期为2012年4月16日。实施例4酶标后的单克隆抗体检测特异性抗体HRP标记的抗鹅免疫球蛋白入链恒定区单克隆抗体(杂交瘤细胞株IBll分泌)检测特异性抗体取0. Img BSA作为免疫原以肌肉注射的方式免疫成年鹅，每4d采血一次，分离血清，采用常规间接ELISA方法检测鹅机体内产生的特异性抗体，以BSA作为抗原包被酶标板，5%脱脂乳作为封闭液，I 10的鹅血清作为一抗，HRP标记的IBll株单抗作为二抗测定鹅免疫BSA后机体内特异性抗体的消长规律(图16a)。同理，采用间接ELISA方法测定本实验室保存的免疫小鹅瘟病毒(GPV)病毒样粒子(VLP)后的鹅血清，以重组蛋白VP2表达的GPV病毒样粒子rVP2-VLPs作为抗原包被酶标板，1%鱼明胶作为封闭液，I 25的鹅血清作为一抗，HRP标记的IBll株单抗作为二抗测定鹅免疫rVP2-VLPs、rVP3-VLPs、GPV灭活苗及GPV弱毒苗后机体内特异性抗体的消长规律(图16b)。结果表明，HRP标记的IBll株单抗能够作为二抗用于鹅机体内特异性抗体消长规律的测定。另外，经HRP标记的抗鹅免疫球蛋白a链、U链、u链恒定区单克隆抗体可特异性的测定机体受到抗原刺激后产生特异性抗体的消长规律以及机体免疫状态的检测。FITC标记的抗鹅免疫球蛋白\链恒定区单克隆抗体检测特异性抗体根 据克隆得出的鹅免疫球蛋白X链恒定区编码序列，设计一对用于真核表达鹅免疫球蛋白入链恒定区的引物 SLC-CDNA (5 ' -AGCAAGCTTb-hiATGTCTCCCAGCATCTACCTCTTCCCG-3 ')和 ALC-CDNA (5 ' -CAGGATCCHindIIICTAGTTCAGGGTCTTCTCGGTGACAG-3 ')，并以Oligo d(T) 18引物为反转录引物合成的cDNA第一链为PCR扩增模板，同时用表达引物SLC-CDNA和ALC-CDNA，采用Pfu高保真性DNA聚合酶进行PCR扩增，构建重组真核表达载体口0)嫩3. I-GoIgLC,然后采用脂质体2000 (invitrogen)介导的方式将重组子和pcDNA3. I (+)分别转染处于对数生长期的BHK-21细胞，37°C作用5h后，补加含3%小牛血清的DMEM培养液，置5%C02，37°C培养48h，弃去培养液，用PBST洗涤3次；4%多聚甲醛固定20min，PBST洗涤3次；加入I 200倍稀释的FITC标记的抗鹅免疫球蛋白\链恒定区单克隆抗体，37 °C避光作用2h，PBST避光洗涤3次后于荧光显微镜下观察抗鹅免疫球蛋白入链恒定区单克隆抗体与表达鹅免疫球蛋白、链恒定区细胞的结合情况(图17)。结果表明IBll株杂交瘤细胞所产生的抗体可以与产生鹅免疫球蛋白\链恒定区的BHK-21细胞结合，经FITC标记后能直接用于检测表达鹅免疫球蛋白\链恒定区的BHK-21细胞。另外，经FITC标记的抗鹅免疫球蛋白\链、y链、a链、u链恒定区单克隆抗体还可以采用免疫组织化学法测定机体内特异性抗体分布情况以及检测机体内B细胞发育状态。实施例5以单克隆抗体作为配体制备亲和层析柱纯化鹅免疫球蛋白腹水的纯化及浓缩经Protein G亲和层析纯化后的抗鹅免疫球蛋白\链恒定区单抗腹水于4°C条件下用碳酸盐缓冲液透析，然后用100. OKDa的超滤离心柱浓缩。亲和层析柱的制备取lml NHS活化琼脂糖凝胶用ImM盐酸清洗3 4次后，再用
0.2M碳酸氢钠溶液平衡凝胶；取纯化浓缩后的2. 5mg/ml抗鹅免疫球蛋白\链恒定区的单克隆抗体2ml，加入偶联溶液中，4度震荡反应过夜，并留0. Iml以便测定偶联效率；将未耦合到填料的单克隆抗体溶液收集于收集管中，以测定偶联效率；洗干净填料得到偶联抗体的填料，然后用IOmM乙醇胺，pH8. 0,0. 2M碳酸钠缓冲液10ml，室温震荡4小时封闭未偶联的基团，并洗涤填料。鹅免疫球蛋白的纯化将制备的亲和层析柱用配制的Binding Buffer(Na2HP0420mM, NaCl 150mM, PH 7. 4)洗漆 3 4 遍,用 Binding Buffer 等体积稀释血清并经0. 45 Ii m滤器过滤后加入到层析柱中，转动结合30 60min,收集流出液,加入2ml的Binding Buffer洗漆柱子4 6次，收集洗漆液,然后用Iml的Elution Buffer (朽1檬酸100mM,PH 3.0)洗脱柱子8 10次，并立即用Tris-base (IOOmM PH 10. 0)中和洗脱液至PH为7. 4，SDS-PAGE检测蛋白纯化结果(图18)。结果表明用IBll株杂交瘤细胞所产生的抗体制得的亲和层析柱，可以纯化天然来源的鹅免疫球蛋白。实施例6定量测定鹅免疫球蛋白含量
以工作浓度的纯化透析后的重组蛋白rGoCL作为抗原4°C包被酶标板过夜，5%脱脂乳 37°C 封闭 2h,以 5000、2500、1250、625、312. 5、156. 25,78. 13,39. 06,19. 53,9. 77、4. 88,2. 44、0ng/ml的标准品(纯化的鹅免疫球蛋白)和样品，与最适工作浓度的抗鹅免疫球蛋白、链恒定区单克隆抗体等体积混合37°C孵育2h后作为一抗，37°C作用lh，以HRP标记山羊抗鼠IgG (I 10000倍稀释)作为二抗，37°C作用Ih TMB显色，IM H2SO4终止反应，测定0D45(tam。每个样品的4个平行孔，取平均值，以鹅免疫球蛋白标准品含量的对数为横坐标，以鹅免疫球蛋白对单抗的抑制率(B-BO)/BO(%) (B0为空白对照时的OD45tlnm, BO为鹅免疫球蛋白标准品为Ong/ml时的OD45tlnm)为纵坐标,拟合测定免疫球蛋白含量的标准曲线(图19)，并计算出所测样品中鹅免疫球蛋白的含量。实施例7抗鹅免疫球蛋白\链恒定区多克隆抗体的制备与鉴定将0. Img原核表达纯化的重组蛋白rGoCL作为免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化均匀后，经背部皮下多点注射2 2. 5kg重的新西兰大白兔。间隔三周后以同等量的免疫原与弗氏不完全佐剂乳化均匀后再次经皮下多点注射进行二次免疫，间隔两周后以同等量的免疫原与弗氏不完全佐剂乳化均匀后进行三次免疫，依次类推。每次免疫后第IOd后耳缘静脉采血用间接ELISA方法测定血清效价，待效价达到100000以上，心脏采血，收集血清，离心取上清，以0. 45 ii m的滤器过滤除菌,并采用Protein G亲和层析纯化制备的多抗血清。多抗效价的ELISA测定将纯化后的rGoCL作为抗原包被酶标板，免疫前血清作为阴性对照，最后一次免疫后的血清作为阳性血清，以I : 100开始倍比稀释作为一抗，间接ELISA法测得制备的抗鹅免疫球蛋白入链恒定区多克隆抗体效价达到I : 204800，说明经过三次免疫后，兔体内已产生高滴度的抗体。多抗的Western blot鉴定将纯化后的rGoCL、鹅血清及鹅胆汁经SDS-PAGE电泳后并转印到NC膜上，5%的脱脂乳4°C封闭过夜，以制得的多抗作为一抗(I : 1000)，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗(I 2000)，4-CN显色(图20)。结果表明制备的抗GoIgCL多克隆抗体可与鹅血清Ig和胆汁Ig在分子量约为26kDa处出现一条特异性的反应条带，与鹅免疫球蛋白轻链蛋白大小相符。多抗反应性的ELISA分析以纯化的鸡血清免疫球蛋白、鸭血清免疫球蛋白、鹅血清免疫球蛋白、火鸡血清免疫球蛋白、乌鸡血清免疫球蛋白绿头鸭血清免疫球蛋白、丹顶鹤血清免疫球蛋白作为抗原包被酶标板，I 1000稀释的多抗血清为一抗，测定所制得的抗鹅免疫球蛋白\链恒定区多克隆抗体的反应性(图21)。ELISA结果表明，所制备的抗鹅免疫球蛋白X链恒定区多克隆抗体与其他禽类血清免疫球蛋白有不同程度的反应性，其反应强弱依次为鹅、rGoCL、鸭、绿头鸭、火鸡、鸡、乌鸡、丹顶鹤，推测鹅免疫球蛋白\链恒定区上存在禽类免疫球蛋白共同的B细胞抗原表位。
多抗反应性的Western blot分析将鸡血清、鸭血清、鹅血清、火鸡血清、乌鸡血清、绿头鸭血清、丹顶鹤血清和原核表达的鹅免疫球蛋白\链恒定区重组蛋白经SDS-PAGE电泳后并转印到硝酸纤维素膜(NC膜)上，以纯化的抗鹅免疫球蛋白\链恒定区多抗作为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗(I : 2000),4-CN显色,Western blot进一步测定所制得的抗鹅免疫球蛋白\链恒定区多抗与其他禽类Ig有不同程度的反应性(图22)，鹅Ig和rGoCL与多抗的反应最强，其次为鸭Ig和绿头鸭Ig、火鸡Ig和乌鸡Ig的反应较弱，丹顶鹤Ig的 反应性最弱，进一步证实鹅免疫球蛋白、链恒定区上存在禽类免疫球蛋白轻链共同的B细胞抗原表位。以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
权利要求
1.鹅免疫球蛋白编码区，其特征在于所述的鹅免疫球蛋白编码区为鹅免疫球蛋白入链的前导区、可变区、J片段和恒定区、鹅免疫球蛋白重链的可变区、D片段和J片段、鹅免疫球蛋白a链的恒定区、鹅免疫球蛋白U链的恒定区或鹅免疫球蛋白u链的恒定区； 其中，所述的鹅免疫球蛋白、链的前导区具有如SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列； 其中，所述的鹅免疫球蛋白、链的可变区具有如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列； 其中，所述的鹅免疫球蛋白、链的J片段具有如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列； 其中，所述的鹅免疫球蛋白、链的恒定区具有如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列； 其中，所述的鹅免疫球蛋白重链的可变区具有如SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列； 其中，所述的鹅免疫球蛋白重链的D片段具有如SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列； 其中，所述的鹅免疫球蛋白重链的J片段具有如SEQ ID NO. 7所示的氨基酸序列； 其中，所述的鹅免疫球蛋白a链的恒定区具有如SEQ ID NO. 8所示的氨基酸序列； 其中，所述的鹅免疫球蛋白U链的恒定区具有如SEQ ID NO. 9所示的氨基酸序列； 其中，所述的鹅免疫球蛋白u链的恒定区具有如SEQ ID NO. 10所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求I所述的鹅免疫球蛋白编码区的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列为编码鹅免疫球蛋白、链前导区的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白、链可变区的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白、链J片段的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白、链恒定区的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白重链可变区的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白重链D片段的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白重链J片段的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白a链恒定区的核苷酸序列、编码鹅免疫球蛋白U链恒定区的核苷酸序列或编码鹅免疫球蛋白u链恒定区的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的鹅免疫球蛋白编码区的核苷酸序列，其特征在于所述的编码鹅免疫球蛋白、链前导区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示；所述的编码鹅免疫球蛋白入链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示；所述的编码鹅免疫球蛋白\链J片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13所示；所述的编码鹅免疫球蛋白\链恒定区的核苷酸序列如SEQID NO. 14所示；所述的编码鹅免疫球蛋白重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15所示；所述的编码鹅免疫球蛋白重链D片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示；所述的编码鹅免疫球蛋白重链J片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示；所述的编码鹅免疫球蛋白a链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示；所述的编码鹅免疫球蛋白y链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 19所示；所述的编码鹅免疫球蛋白u链恒定区的核苷酸序列如SEQID NO. 20 所示。
4.权利要求I所述的鹅免疫球蛋白编码区在制备检测抗鹅免疫球蛋白抗体试剂中的应用。
5.抗权利要求I所述的鹅免疫球蛋白编码区的抗体，所述抗体包括抗鹅免疫球蛋白入链恒定区的单克隆抗体或多克隆抗体、抗鹅免疫球蛋白a链恒定区的单克隆抗体或多克隆抗体、抗鹅免疫球蛋白U链恒定区的单克隆抗体或多克隆抗体、抗鹅免疫球蛋白u链恒定区的单克隆抗体或多克隆抗体。
6.权利要求I所述的鹅免疫球蛋白编码区在制备检测抗鹅免疫球蛋白抗体试剂中的应用；及\或 在鉴别与单克隆抗体所结合的鹅免疫球蛋白类和型中的应用；及\或在制备抗鹅免疫球蛋白抗体中的应用，优选的所述的抗体为单克隆抗体。
7.一种制备抗权利要求I所述的鹅免疫球蛋白编码区的单克隆抗体的方法，其特征在于包括以下步骤； (1)免疫原的制备 采用Protein A进行亲和层析纯化鹅血清免疫球蛋白，SDS-PAGE检测蛋白纯化效果，并于4°C透析，得到纯化的鹅血清免疫球蛋白； (2)杂交瘤细胞株的制备 将纯化的鹅血清免疫球蛋白作为免疫原用于BALB/c小鼠的免疫,然后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞株； (3)单克隆抗体结合类型的鉴定 分别用原核表达纯化的鹅免疫球蛋白入链、a链、U链、u链恒定区作为抗原包被酶标板，以阳性杂交瘤细胞株在培养上清中分泌产生的单克隆抗体为一抗，采用间接ELISA方法，鉴别出针对不同类和型鹅免疫球蛋白所筛选出的阳性杂交瘤细胞株，继而得到由该种杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体； 其中，所述的鹅免疫球蛋白、链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示； 其中，所述的鹅免疫球蛋白a链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示； 其中，所述的鹅免疫球蛋白U链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示； 其中，所述的鹅免疫球蛋白u链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
8.按照权利要求7所述的方法制备得到的分泌抗鹅免疫球蛋白\链恒定区的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株1B11，所述的杂交瘤细胞保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 6005。
9.由权利要求8所述的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。
10.权利要求9所述的单克隆抗体在制备鹅免疫球蛋白检测试剂中的应用；及\或在制备鹅免疫球蛋白纯化试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了鹅免疫球蛋白编码区及其恒定区特异性单克隆抗体与应用。本发明提供的鹅免疫球蛋白编码区包含λ链的全部编码区序列，重链的可变区、D片段和J片段编码序列、α链的恒定区编码序列以及μ链、υ链恒定区的部分编码序列。本发明的免疫球蛋白恒定区可用于制备抗鹅免疫球蛋白λ链、μ链、α链、υ链恒定区抗体，还可用于鉴别与抗鹅免疫球蛋白单克隆抗体结合的鹅免疫球蛋白的类和型。本发明还提供了一种采用Protein A亲和层析方法纯化的鹅血清免疫球蛋白作为免疫原制备抗鹅免疫球蛋白单克隆抗体的方法及由该方法得到的单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株。本发明的抗鹅免疫球蛋白恒定区抗体能够用于检测或纯化鹅免疫球蛋白。
文档编号G01N33/68GK102731655SQ20121015498
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者王君伟, 郭永丽, 马波, 高明春 申请人:东北农业大学