专利名称：一种制备微胶囊pH传感器的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备微胶囊pH传感器的方法。尤其是利用荧光染料分子共价标记到内层囊壁实现PH传感的方法。
背景技术：
H+离子对生物体的生命活动起着重要的调控作用，一些生命现象的发生常伴随着细胞内H+离子浓度的变化，如细胞分化以及程序化的细胞死亡。因此单细胞水平上pH的测量对生命机理的解释以及疾病病变的预测具有非常重要的意义。微胶囊是通过成膜物质将囊内空间与囊外空间隔离开以形成特定几何结构的物 质。微胶囊的制备方法很多，其中，以胶体微粒为模板，利用层层自组装技术在模板微粒上组装聚合物超薄膜，去除模板后制备的微胶囊具有结构和性能可控、易赋予各种独特功能等特点。微胶囊的形状以球形结构为主，也可为卵圆形、正方形或长方形、多角形及各种不规则形状。微胶囊在食品、药物、化妆品、生物工程和组织工程中都有十分重要的应用。微胶囊做为pH传感器有很多优点一方面由于微胶囊的囊壁具有半透膜性质，小分子的分析物可以自由透过，而大分子物质(如蛋白质)则不能透过；因此可以保护染料分子，避免细胞内的蛋白粘附影响其荧光性能，同时也可以降低染料分子对细胞的毒害。另一方面，PH敏感的荧光染料和pH惰性的荧光染料可同时包埋到微胶囊内部或共价标记到囊壁上，从而实现比率荧光测量，避免实验中一些不确定因素(荧光染料包埋和标记的不均匀性，荧光染料浓度的不确定性，激发光源的波动)的影响，使测量更加准确。通常的微胶囊pH传感器的制备方法是首先将荧光染料分子标记的葡聚糖包埋到模板微粒中，并在其表面组装多层膜后去除模板，从而将单种pH敏感的染料分子包埋在微胶囊内部。但是该制备方法存在原料昂贵，利用效率低且PH动态测试范围较窄的缺点，这些缺点限制了其推广和应用。

发明内容
本发明的目的是提供一种简便快速的利用荧光染料分子直接标记到内层囊壁制备微胶囊PH传感器的方法。本发明的制备微胶囊pH传感器的方法，包括以下步骤
1)在浓度为O.33M的Ca(NO3)2水溶液中加入侧链带有氨基的聚电解质，聚电解质的浓度为2mg/mL，搅拌使其混合均匀；搅拌下再加入O. 33M的Na2CO3水溶液，Na2CO3水溶液与Ca(NO3)2水溶液的体积比为I :1，持续搅拌45 60s，然后静置反应，收集所得微粒，洗涤，得到掺杂有氨基聚电解质的CaCO3胶体微粒，冻干；
2)取50mg步骤I)所得的CaCO3胶体微粒，分散在pH9. 4的NaHC03/Na2C03缓冲液中，加入PH敏感的荧光染料和作为参比的pH惰性的荧光染料；搅拌均匀，离心水洗，得到掺杂有荧光标记聚电解质的CaCO3胶体微粒；
3)在O.5M的NaCl溶液中，将浓度为O. 2 10mg/mL的带负电的聚电解质与步骤2)得到的CaCO3胶体微粒混合10 15min后，用水反复洗涤去除未吸附的带负电的聚电解质，得到外层包覆有带负电的聚电解质的CaCO3胶体微粒；
4)在O.5M的NaCl溶液中，将浓度为O. 2 10mg/mL的带正电的聚电解质与步骤3)的CaCO3胶体微粒混合10 15min后，用水反复洗涤去除未吸附的带正电的聚电解质，得到外层包覆有带正电的聚电解质的CaCO3胶体微粒；
5)交替重复步骤3)和4)，得到组装有聚电解质多层膜的CaCO3胶体微粒；
6)将步骤5)所得的CaCO3胶体微粒分散到pH=7、0.2M的乙二胺四乙酸钠溶液中，去除CaCO3胶体微粒，得到微胶囊pH传感器。本发明中，所述的侧链带有氨基的聚电解质是聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)、聚赖氨酸(PLL)或聚乙烯亚胺(PEI);所述的pH敏感的荧光染料是异硫氰酸荧光素(FITC)和异硫氰酸俄勒冈绿(OGITC)中的一种或二种；pH惰性的荧光染料是异硫氰酸四甲基罗丹明(RITC);所述的带负电的聚电解质是聚苯乙烯磺酸钠(PSS)或硫酸葡聚糖酸钠(DS);所述的 带正电的聚电解质是聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)或壳聚糖盐酸盐(CS)。本发明的原理是在掺杂氨基聚电解质的碳酸钙胶体微粒的缓冲液中加入带异硫氰酸酯基的荧光染料，通过氨基和异硫氰酸酯基的反应将PH敏感的荧光染料及pH惰性的荧光染料同时标记到掺杂在碳酸钙微粒中的氨基聚电解质上，然后通过静电相互作用在微粒表面组装聚电解质多层膜，再用乙二胺四乙酸(EDTA)络合去除碳酸钙微粒，在此过程中，碳酸钙内部荧光标记的聚电解质释放出来并立即与微粒表面吸附的带负电聚电解质结合或被包埋在微胶囊内部。PH敏感的荧光染料及作为参比的pH惰性的荧光染料赋予微胶囊PH传感性能，能够准确反映周围环境的pH。本发明的有益效果在于
本发明工艺过程简单，制备速度快，可控性好，材料来源广泛，适于微胶囊的大量制备；利用带有活性基团的染料分子与模板微粒中掺杂的聚电解质原位反应，节省原料且不同荧光分子的比例可通过投料比控制，得到的微胶囊由于同时标记了 PH敏感的荧光染料和pH惰性的荧光染料，具有PH传感性能。其中两种pH敏感染料同时标记的微胶囊pH传感器通过比率荧光法测定pH值，准确率更高，具有更加广的线性pH响应范围。


图I a)为PAH掺杂的CaCO3微粒的扫描电镜照片，b)为PAH掺杂的CaCO3微粒的局部放大后的扫描电镜照片。图2是掺杂PAH的碳酸钙微粒标记了 FITC，OGITC和RITC三元荧光染料并在外层组装了 3. 5个PSS/PAH双层后去除碳酸钙得到的微胶囊(PAH-FITC-OGITC-RITC-(PSS/PAH)3PSS，以下缩写表示相同含义)干燥后的扫描电镜照片。图3 a)是 PAH-FITC-OGITC-RITC-(PSS/PAH)3PSS 微胶囊的荧光显微镜照片(FITC通道)，b)是PAH-FITC-OGITC-RITC-(PSS/PAH) 3PSS微胶囊的荧光显微镜照片(RITC通道)，微胶囊分散于水中。图4 a)是PAH-FITC-RITC_(PSS/PAH)3PSS微胶囊的荧光显微镜照片(FITC通道)，b)是PAH-FITC-RITC-(PSS/PAH) 3PSS微胶囊的荧光显微镜照片(RITC通道)，微胶囊分散于水中。
图5 a)是 PAH-OGITC-RITC-(PSS/PAH) 3PSS 微胶囊的荧光显微镜照片(OGITC 通道)，b)是PAH-OGITC-RITC- (PSS/PAH) 3PSS微胶囊的荧光显微镜照片(RITC通道)，微胶囊分散于水中。图6 a)是 PAH-FITC-OGITC-RITC-(PSS/PAH)3PSS 微胶囊在不同 pH 值缓冲液中的荧光光谱图，b)是PAH-FITC-RITC- (PSS/PAH) 3PSS微胶囊在不同pH值缓冲液中的荧光光谱图，c)是PAH-OGITC-RITC-(PSS/PAH)3PSS微胶囊在不同pH值缓冲液中的荧光光谱图。图 7 是 PAH-FITC-OGITC-RITC- (PSS/PAH) 3PSS，PAH-FITC-RITC- (PSS/
PAH) 3PSS，PAH-OGITC-RITC- (PSS/PAH) 3PSS微胶囊在不同pH值缓冲液中的pH校准曲线。
图8 a)是 PAH-FITC-OGITC-RITC-(DS/CS)3DS 微胶囊的荧光显微镜照片(FITC 通道)，b)是PAH-FITC-OGITC-RITC-(DS/CS)3DS微胶囊的荧光显微镜照片(RITC通道)，微胶囊分散于PH 5. O的缓冲液中。图9是PAH-FITC-OGITC-RITC-(DS/CS)3DS微胶囊在不同pH值缓冲液中的荧光光谱图。图10是PAH-FITC-OGITC-RITC- (DS/CS) 3DS微胶囊在不同pH值缓冲液中的pH校准曲线。
具体实施例方式以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。实施例I
1)将NaCO3和Ca(NO3) 2分别配成O. 33M的水溶液；取20mL Ca (NO3) 2溶液，加入40mgPAH，搅拌使其混合均匀；在机械搅拌下迅速向其中加入20mL NaCO3溶液，持续搅拌I分钟，然后让其静置反应，直至生成的所有微粒完全沉淀；将所得微粒离心收集，水洗3次，得到直径约为4-6微米的CaCO3胶体微粒，冻干。其扫描电镜照片见图I ;
2)取步骤I)所得CaCO3胶体微粒50mg，置于50mL的离心管中，加入30mLpH=9. 4的NaHC03/Na2C03 缓冲液，加入 65μ L FITC (lmg/mL)，71 μ L OGITC (lmg/mL), 178 μ L RITC(lmg/mL)，然后将离心管置于振荡器上，震荡过夜；将微粒用纯水洗涤数次，去除未反应的荧光染料，得到掺杂有PAH-FITC-OGITC-RITC的CaCO3胶体微粒；
3)将步骤2)所得的掺杂有PAH-FITC-OGITC-RITC的CaCO3胶体微粒分散到6mL水中，加入3mL PSS (6mg/mL，0. 5M NaCl中)，孵化10分钟，水洗3次；将微粒重新分散到6mL水中，加入3mL PAH (6mg/mL,0. 5M NaCl中)，孵化10分钟，水洗三次，重复以上过程得到CaCO3 (PAH-FITC-OGITC-RITC)-
(PSS/PAH) 3PSS结构的胶体微粒；
4)将步骤3)所得的胶体微粒分散到大量的pH=7、0.2M的EDTA溶液中，反应30分钟，去除CaCO3胶体微粒，然后用大量水洗涤；干燥后的PAH-FITC-OGITC-RITC-(PSS/PAH)3PSS微胶囊PH传感器的扫描电镜照片见图2 ;水中分散的微胶囊pH传感器的荧光显微镜照片见图3。这种微胶囊pH传感器在不同pH值的缓冲溶液中的荧光光谱图见图6a ;根据荧光谱图中530nm处和590nm处荧光强度的比值计算得到的pH值校准曲线见图7。实施例2步骤同实例 1，但在步骤 2)中加入 65 μ L FITC (lmg/mL)，89 μ L RITC (lmg/mL),去核后得到的微胶囊pH传感器的荧光显微镜照片见图4。这种微胶囊pH传感器在不同pH值的缓冲溶液中的荧光光谱图见图6b ;根据荧光谱图中530nm处和590nm处荧光强度的比值计算得到的PH值校准曲线见图7。实施例3
步骤同实例 1，但在步骤 2)中加入 71 μ L 0GITC(lmg/mL),89yL RITC (lmg/mL),去核后得到的微胶囊pH传感器的荧光显微镜照片见图5。这种微胶囊pH传感器在不同pH值的缓冲溶液中的荧光光谱图见图6c ;根据荧光谱图中530nm处和590nm处荧光强度的比值计算得到的PH值校准曲线见图7。实施例4步骤同实例 1，但在步骤 2)中加入 48yL FITC (O. 68mg/mL), 36 μ L OGITC (lmg/mL)，126 μ L RITC (0. 68mg/mL),步骤3)中，将胶体微粒分散在5mL水中，加入5mLDS (lmg/mL, O. 5M NaCl中)，孵化10分钟，水洗3次；将微粒重新分散到5mL水中，加入5mL CS (lmg/mL, O. 5M NaCl中)，孵化10分钟，水洗三次，重复以上过程得到CaCO3 (PAH-FITC-OGITC-RITC) - (DS/CS) 3DS结构的微粒；去核后得到的微胶囊pH传感器的荧光显微镜照片见图8。这种微胶囊pH传感器在不同pH值缓冲液中的荧光光谱图见图9 ;根据荧光谱图中526nm处和587nm处荧光强度的比值计算得到的pH值校准曲线见图10。实施例5
步骤同实例 4，但在步骤 2)中加入 48 μ L FITC (O. 68mg/mL), 126 μ L RITC (0. 68mg/mL)，最终得到 PAH-FITC-RITC- (DS/CS) 3DS 微胶囊 pH 传感器。实施例6
步骤同实例 4，但在步骤 2)中加入 36 μ L 0GITC(lmg/mL),126yL RITC (O. 68mg/mL),最终得到PAH-OGITC-RITC- (DS/CS) 3DS微胶囊pH传感器。
权利要求
1.一种制备微胶囊PH传感器的方法，包括以下步骤 1)在浓度为O.33M的Ca(NO3)2水溶液中加入侧链带有氨基的聚电解质，聚电解质的浓度为2mg/mL，搅拌使其混合均匀；搅拌下再加入O. 33M的Na2CO3水溶液，Na2CO3水溶液与Ca(NO3)2水溶液的体积比为I :1，持续搅拌45 60s，然后静置反应，收集所得微粒，洗涤，得到掺杂有氨基聚电解质的CaCO3胶体微粒，冻干； 2)取50mg步骤I)所得的CaCO3胶体微粒，分散在pH9. 4的NaHC03/Na2C03缓冲液中，加入PH敏感的荧光染料和作为参比的pH惰性的荧光染料；搅拌均匀，离心水洗，得到掺杂有荧光标记聚电解质的CaCO3胶体微粒； 3)在O.5M的NaCl溶液中，将浓度为O. 2 10mg/mL的带负电的聚电解质与步骤2)得到的CaCO3胶体微粒混合10 15min后，用水反复洗涤去除未吸附的带负电的聚电解质，得到外层包覆有带负电的聚电解质的CaCO3胶体微粒； 4)在O.5M的NaCl溶液中，将浓度为O. 2 10mg/mL的带正电的聚电解质与步骤3)的CaCO3胶体微粒混合10 15min后，用水反复洗涤去除未吸附的带正电的聚电解质，得到外层包覆有带正电的聚电解质的CaCO3胶体微粒； 5)交替重复步骤3)和4)，得到组装有聚电解质多层膜的CaCO3胶体微粒； 6)将步骤5)所得的CaCO3胶体微粒分散到pH=7、0.2M的乙二胺四乙酸钠溶液中，去除CaCO3胶体微粒，得到微胶囊pH传感器。
2.根据权利要求I所述的制备微胶囊pH传感器的方法，其特征在于所述的侧链带有氨基的聚电解质是聚烯丙基胺盐酸盐、聚赖氨酸或聚乙烯亚胺。
3.根据权利要求I所述的制备微胶囊pH传感器的方法，其特征在于所述的pH敏感的荧光染料是异硫氰酸荧光素和异硫氰酸俄勒R绿中的一种或二种；所说的PH惰性的荧光染料是异硫氰酸四甲基罗丹明。
4.根据权利要求I所述的制备微胶囊pH传感器的方法，其特征在于所说的带负电的聚电解质是聚苯乙烯磺酸钠或硫酸葡聚糖酸钠。
5.根据权利要求I所述的制备微胶囊pH传感器的方法，其特征在于所说的带正电的聚电解质是聚烯丙基胺盐酸盐或壳聚糖盐酸盐。
全文摘要
本发明公开了一种制备微胶囊pH传感器的方法。在侧链带有氨基的聚电解质存在下，通过含钙无机盐和含碳酸根无机盐的反应来制备正电荷聚电解质掺杂的多孔碳酸钙胶体微粒，将其分散在含异硫氰酸酯基的pH敏感荧光染料和作为参比的pH惰性荧光染料的缓冲液中；振荡或磁力搅拌一段时间后，染料分子标记到聚电解质上；离心清洗后，将带有相反电荷的聚电解质交替吸附到该胶体微粒上，再通过乙二胺四乙酸络合去除碳酸钙微粒，得到中空微胶囊。本发明制备方法简便快捷，材料来源广泛，生产效率高，得到的微胶囊由于同时标记有pH敏感的荧光染料和作为参比的pH惰性的荧光染料，具有对局部环境的pH产生响应的特点，有良好的应用前景。
文档编号G01N21/64GK102830104SQ201210311329
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月29日 优先权日2012年8月29日
发明者仝维鋆, 宋小雪, 高长有 申请人:浙江大学