弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌细胞生长和转移的影响研究方法
【专利摘要】本发明涉及一种弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌A549细胞生长和转移的影响研究方法，具体包括以下步骤：(1)MTT法检测细胞的增殖；(2)A549细胞克隆形成能力检测；(3)Hochest33342／PI双染法检测细胞凋亡；(4)单层细胞迁移实验(wound?healing)；(5)Transwell侵袭实验；(6)Western?blot检测细胞迁移相关蛋白表达水平；(7)酶联免疫吸附试验；(8)统计分析。本发明通过研究弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌A549细胞生长和转移的影响，可以更好地利用Furin抑制剂a1-PDX抑制Furin在肺腺癌A549细胞中表达，从而有效地为癌症治疗提供依据。
【专利说明】弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌细胞生长和转移的影响研究方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌A549细胞生长和转移的影响研究方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]肺癌是当今世界上严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤，且发病率也正逐年上升，肺癌发病率和死亡率在许多国家均居恶性肿瘤之首。据估计，一年中死于肺癌的患者人数超过前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌总人数。大约85%肺癌患者为非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)，其按病理组织学分为腺癌、鳞癌、大细胞癌等。大多数患者在诊断时已局部进展或远处转移。转移和复发是肺癌患者死亡的主要原因，大约90%的肺癌患者死于肿瘤转移。因而进行深入研肺腺癌浸润、转移的分子机制很有必要。
[0003]Furin是蛋白前体加工酶家族中的重要成员，许多重要的生理过程需要Furin的参与，如多肽与蛋白质激素的合成与分泌、膜受体的成熟、血浆蛋白前体的激活等；同时多种疾病的发生也与Furin密切相关，如病毒外壳蛋白和细菌外毒素的加工活化以及肿瘤的转移等。这些蛋白质在发挥活性之前需要经过蛋白转化酶对蛋白前体切割，然后才能成为有功能的蛋白质。包括Notch、Wnt、MTl-MMP、VEGF等在内的许多与肿瘤发生发展密切相关的蛋白质在体内成熟过程中，必须经过Furin等蛋白转化酶对其前体进行剪切，才能发挥生物学活性。而这些蛋白质中部分成员与肿瘤的发生、发展密切相关，Furin在多种肿瘤中高表达，可以作为肿瘤进展过程中的Marker，在某种程度上可以作为肿瘤预后的指标。

【发明内容】

[0004]本发明的目的在于提供一种弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌A549细胞生长和转移的影响研究方法，以便更好地利用Furin抑制剂al-PDX抑制Furin在肺腺癌A549细胞中表达，从而有效地为癌症治疗提供依据。
[0005]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。
[0006]一种弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌A549细胞生长和转移的影响研究方法，具体包括以下步骤:
[0007](I)MTT法检测细胞的增殖:
[0008]对数生长期A549细胞接种到96孔板中(每孔5 X 103)，24h后开始加入不同浓度的al-PDX (200nM、400nM)继续培养24h_96h ;每孔加入20 μ I MTT试剂(5毫克/毫升)溶液，并于37°C温育4小时。每孔加入150 μ L的DMSO溶解甲臜晶体，震荡溶解后检测490nm处的光密度。
[0009](2) A549细胞克隆形成能力检测:
[0010]取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化吹打成单个细胞，把细胞悬浮在含10%胎牛血清的1640培养液中，以1X103 / ml的细胞密度接种于培养皿中；力口入不同浓度的al-PDX(200nM、400nM)置37°C、5% C02的饱和湿度环境下，静置培养2周。弃去上清液，PBS小心浸洗2次；甲醇固定15min。去除固定液，吉姆萨染液染色lOmin，流水缓慢冲洗后空气干燥后，肉眼直接计数克隆并统计分析。
[0011](3)Hochest33342 / PI双染法检测细胞凋亡:
[0012]对数生长期细胞4549按1父104个/ ml浓度接种于提前用多聚赖氨酸处理的盖片上。不同浓度的al-PDX处理48h后，倾去培养液，加入预冷PBS洗涤细胞2次；调整Hocchst33342 / PI染液浓度至终浓度5 μ g / ml，37°C避光染色15min ;弃去染液，加入4%多聚甲醒4°C固定5min。在突光显微镜下观察拍摄。
[0013](4)单层细胞迁移实验(wound healing):
[0014]A549细胞接种在6孔板，待生长至汇合度达100%时，用无菌的200 μ I的Tip头尖制成划痕(wound)，并用PBS洗涤细胞碎片。细胞处理同前。在指定的时间用倒置显微镜配备的数码相机拍摄受伤区域的细胞迁移情况。
[0015](5) Transwell 侵袭实验:
[0016]不同浓度al-PDX处理的A549细胞(1X105)接种于Transwell小室的上部腔室，含有200 μ I的RPMI1640培养基，但不含10% FBS0 Transwell小室下部腔室被填充有500 μ I的完整的RPMI1640培养基，含10% FBS0使细胞迁移48小时，然后用4%甲醛将细胞固定，室温下孵育15分钟。去离子水洗涤后，0.1%结晶紫染色。在光学显微镜下拍摄迁移的克隆。
[0017](6) Western blot检测细胞迁移相关蛋白表达水平:
[0018]收集细胞加入RIPA缓冲液(50mM的Tris ρΗ7.4，150mM氯化钠，I %的Tri tonX-100,0.1%SDS, I %脱氧胆酸钠，5mMEDTA，IOOmM的氟化钠)及蛋白酶抑制剂，冰上孵育30分钟，13200rpm离心30min。收集上清并BCA法(Pierce，USA)测定蛋白浓度。细胞总蛋白经12% SDS-PAGE凝胶电泳后转移到PVDF膜，室温下5%脱脂牛奶封闭lh。在4°C下孵育MT 1-MMP, VEGF-C, VEGF-D和GAPDH(1:1000)的抗体过夜。PBST洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠二抗，室温下孵育lh，PBST洗涤后，超敏发光液(Pierce公司，美国)孵育后，LAS3000成像仪(富士，日本)拍照。
[0019](7)酶联免疫吸附试验:
[0020]A549细胞处理同前所述，收集细胞培养上清并根据MMP-9、MMP-2、VEGF-c ELISA检测试剂盒说明书进行后续的检测。每个样品重复5次。
[0021](8)统计分析:
[0022]应用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料采用配对t检验及单因素方差分析，计数资料采用卡方检验，P < 0.05具有统计学意义。
[0023]该发明的有益效果在于:本发明通过研究弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌A549细胞生长和转移的影响，可以更好地利用Furin抑制剂al-PDX抑制Furin在肺腺癌A549细胞中表达，从而有效地为癌症治疗提供依据。
【专利附图】

【附图说明】
[0024]图1是本发明实施例中al-PDX对A549细胞的增殖影响图。
[0025]图2是本发明实施例中al-PDX对A549细胞的集落形成影响图。[0026]图3是本发明实施例中al-PDX对A549细胞凋亡的影响图(对照组)。
[0027]图4是本发明实施例中al-PDX对A549细胞凋亡的影响图(200nM al_PDX处理组)。
[0028]图5是本发明实施例中al-PDX对A549细胞凋亡的影响图(400nM al-PDX处理组)。
[0029]图6是本发明实施例中al-PDX对A549细胞凋亡的影响图(三次独立实验细胞凋亡率统计分析)。
[0030]图7是本发明实施例中单层细胞划痕检测al-PDX对细胞迁移的影响图。
[0031]图8是本发明实施例中al-PDX对A549细胞迁移的影响的三次独立实验统计分析图。
[0032]图9是本发明实施例中a 1-PDX对A549浸润能力的影响图(对照组)。
[0033]图10是本发明实施例中al-PDX对A549浸润能力的影响图(200nM al-PDX处理组)。
[0034]图11是本发明实施例中al-PDX对A549浸润能力的影响图(400nM al-PDX处理组)。
[0035]图12是本发明实施例中al-PDX对A549三次独立实验细胞浸润能力统计分析图。
[0036]图13是本发明实施例中al-PDX对A549细胞迁移相关蛋白表达的影响图。
[0037]图14是本发明实施例中al-PDX对A549细胞MMP-9表达的影响图。
[0038]图15是本发明实施例中al-PDX对A549细胞MMP-2表达的影响图。
【具体实施方式】
[0039]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】进行描述，以便更好的理解本发明。
[0040]实施例
[0041]一种弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌A549细胞生长和转移的影响研究方法，具体包括如下方面:
[0042](I)细胞培养过程:人肺腺癌细胞系A549购自中国医学科学院协和细胞库。生长在含有10%胎牛血清(FBS)和100单位/ mL青霉素，100 μ g / mL链霉素的RPMI1640培养基(Gibco，USA)中，于37°C、5% C02、饱和湿度下培养。
[0043](2)所用主要试剂包括:Furin抑制剂a 1-PDX (Merck货号:126850-2.5MG)溶于DMSO 中，制成 5mM 母液。鼠抗人 VEGF-C，VEGF-D，MTl-MMP 和 GAPDH 抗体均购自 Santa Cruz公司(Santa Cruz,美国)。抗鼠IgG抗体-HRP和抗兔Ig6_HRP,购自西格玛公司(Siama,USA) ;MTT、Hochest33342、Transwell 购自美国 Promega 公司；MMP2、MMP9ELISA 检测试剂盒购自南京建成生物试剂公司。其它试剂均为国产分析纯。
[0044](3)具体实施过程及方法实验方法:
[0045](3a)MTT法检测细胞的增殖:
[0046]对数生长期A549细胞接种到96孔板中(每孔5 X 103)，24h后开始加入不同浓度的al-PDX (200nM、400nM)继续培养24h_96h。每孔加入20 μ I MTT试剂(5毫克/毫升)溶液，并于37°C温育4小时。每孔加入150 μ L的DMSO溶解甲臌晶体，震荡溶解后检测490nm处的光密度。[0047](3b) A549细胞克隆形成能力检测:
[0048]取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化吹打成单个细胞，把细胞悬浮在含10%胎牛血清的1640培养液中，以1X103 / ml的细胞密度接种于培养皿中。加入不同浓度的al-PDX(200nM、400nM)置37°C、5% C02的饱和湿度环境下，静置培养2周。弃去上清液，PBS小心浸洗2次。甲醇固定15min。去除固定液，吉姆萨染液染色lOmin，流水缓慢冲洗后空气干燥后，肉眼直接计数克隆并统计分析。
[0049](3c)Hochest33342 / PI双染法检测细胞凋亡:
[0050]对数生长期细胞4549按1父104个/ ml浓度接种于提前用多聚赖氨酸处理的盖片上。不同浓度的al-PDX处理48h后，倾去培养液，加入预冷PBS洗涤细胞2次；调整Hoechst33342 / PI染液浓度至终浓度5 μ g / ml，37°C避光染色15min ;弃去染液，加入4%多聚甲醒4°C固定5min。在突光显微镜下观察拍摄。
[0051](3d)单层细胞迁移实验(wound healing):
[0052]A549细胞接种在6孔板，待生长至汇合度达100%时，用无菌的200 μ I的Tip头尖制成划痕(wound)，并用PBS洗涤细胞碎片。细胞处理同前。在指定的时间用倒置显微镜配备的数码相机拍摄受伤区域的细胞迁移情况。
[0053](3e) Transwell 侵袭实验:
[0054]不同浓度al-PDX处理的A549细胞(1X105)接种于Transwell小室的上部腔室，含有200 μ I的RPMI1640培养基，但不含10% FBS0 Transwell小室下部腔室被填充有500 μ I的完整的RPMI1640培养基，含10% FBS0使细胞迁移48小时，然后用4%甲醛将细胞固定，室温下孵育15分钟。去离子水洗涤后，0.1%结晶紫染色。在光学显微镜下拍摄迁移的克隆。
[0055](3f) Western blot检测细胞迁移相关蛋白表达水平:
[0056]A549细胞培养及处理同前。收集细胞加入RIPA缓冲液(50mM的Tris pH7.4,150mM氯化钠，1%的Triton X-100,0.1% SDS，I %脱氧胆酸钠，5mM EDTA, IOOmM的氟化钠)及蛋白酶抑制剂，冰上孵育30分钟，13200rpm离心30min。收集上清并BCA法(Pierce，USA)测定蛋白浓度。细胞总蛋白经12% SDS-PAGE凝胶电泳后转移到PVDF膜，室温下5%脱脂牛奶封闭 lh。在 4°C下孵育 MT1-MMP、VEGF-C、VEGF-D 和 GAPDH(1:1000)的抗体过夜。PBST 洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠二抗，室温下孵育lh，PBST洗涤后，超敏发光液(Pierce公司，美国)孵育后，LAS3000成像仪(富士，日本)拍照。
[0057](3g)酶联免疫吸附试验:
[0058]A549细胞处理同前所述，收集细胞培养上清并根据MMP-9、MMP-2、VEGF_cELISA检测试剂盒说明书进行后续的检测。每个样品重复5次。
[0059](4)统计分析:
[0060]应用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料采用配对t检验及单因素方差分析，计数资料采用卡方检验，P < 0.05具有统计学意义。
[0061](5)实施结果:
[0062](5a) al-PDX对A549细胞的增殖和集落形成的影响:
[0063]不同浓度的al-PDX作用A549不同时间后，MTT法检测细胞的存活，如图1所示。结果显示，al-PDX作用A549细胞48h以上时，细胞的生长受到显著抑制。集落形成法检测A549细胞的克隆形成。结果表明，与对照组相比，al-PDX处理的A549细胞的集落形成能力显著降低，如图2所示。
[0064](5b) al-PDX对A549细胞凋亡的影响:
[0065]为探讨al-PDX对A549细胞生长抑制的机制，首先使用Hochest33342 / PI双染检测A549细胞凋亡。结果表明，al-PDX能诱导A549细胞凋亡的发生，如图3、图4、图5、图6所示。
[0066](5c) al-PDX对A549细胞迁移和侵袭的影响:
[0067]为检测al-PDX是否对A549细胞的迁移和侵袭有调节作用，用wound Heal ing和Transwell实验进一步检测了 A549细胞迁移的情况。两种实验结果均表明al-PDX显著降低了 A549细胞迁移和侵袭能力，如图7、图8、图9、图10、图11、图12所示。
[0068](5d) al-PDX对细胞迁移相关蛋白的表达的影响:
[0069]许多蛋白质在体内参与肿瘤细胞迁移的调节。为充分了解al-PDX调节A549细胞迁移的分子机制，通过Western Blot和ELISA法检测了细胞MTl-MMP、MMP2、MMP9、VEGF_c、VEGF-d蛋白表达水平。如图13所示，al-PDX显著降低了细胞内MT-MMP、VEGF-c、VEGF_d的表达。同时细胞培养液上清中MMP2和MMP9浓度也明显低于对照组，如图14、图15所示。这些结果表明，al-PDX抑制A549细胞迁移可能与降低MT1-MMP，MMP2 / 9，VEGF-C / D的表达有关。
[0070]在本发明实施例中，Furin抑制剂al-PDX可诱导A549细胞增殖抑制和凋亡。此外，A549细胞经al-PDX孵育后，迁移能力显著降低。这些基质金属蛋白酶的表达水平，有效地反映肿瘤细胞的浸润能力。al-PDX不仅能抑制MMP2和MMP9的表达，而且能降低MTl-MMP的表达。al-PDX降低了 Furin酶活性，进而降低了 MTl-MMP成熟及激活，进一步抑制了 MMP2、MMP9的成熟。al-PDX处理的细胞VEGF-C和VEGF-D蛋白表达显著减少。下调Furin酶活性，从而抑制A549细胞的MMPs和VEGFs蛋白的表达可能是其抑制A549生长和迁移、浸润的机制。
[0071]以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌A549细胞生长和转移的影响研究方法，其特征在于:具体包括以下步骤: (1)MTT法检测细胞的增殖:对数生长期A549细胞接种到96孔板中(每孔5X103)，24h后开始加入不同浓度的al-PDX(200nM、400nM)继续培养24h_96h ;每孔加入20 μ I MTT试剂(5毫克/毫升)溶液，并于37°C温育4小时；每孔加入150 μ L的DMSO溶解甲臜晶体，震荡溶解后检测490nm处的光密度； (2)A549细胞克隆形成能力检测:取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化吹打成单个细胞，把细胞悬浮在含10%胎牛血清的1640培养液中，以1X103 / ml的细胞密度接种于培养皿中；加入不同浓度的al-PDX(200nM、400nM)置37°C、5% C02的饱和湿度环境下，静置培养2周；弃去上清液，PBS小心浸洗2次；甲醇固定15min ;去除固定液，吉姆萨染液染色lOmin，流水缓慢冲洗后空气干燥后，肉眼直接计数克隆并统计分析； (3)Hochest33342/ PI双染法检测细胞凋亡:对数生长期细胞A549按I X 104个/ ml浓度接种于提前用多聚赖氨酸处理的盖片上；不同浓度的al-PDX处理48h后，倾去培养液，加入预冷PBS洗涤细胞2次；调整H0echst33342 / PI染液浓度至终浓度5 μ g / ml, 37°C避光染色15min ;弃去染液,加入4%多聚甲醒4°C固定5min ;在突光显微镜下观察拍摄； (4)单层细胞迁移实验(woundhealing):A549细胞接种在6孔板,待生长至汇合度达100%时，用无菌的200 μ I的Tip头尖制成划痕(wound)，并用PBS洗涤细胞碎片；在指定的时间用倒置显微镜配备的数码相机拍摄受伤区域的细胞迁移情况； (5)Transwell侵袭实验:不同浓度al_PDX处理的A549细胞(I X 105)接种于Transwell小室的上部腔室，含有200 μ I的RPMI1640培养基，但不含10% FBS ；TranswelI小室下部腔室被填充有500 μ I的完整的RPMI1640培养基，含10% FBS ;使细胞迁移48小时，然后用4%甲醛将细胞固定，室温下孵育15分钟；去离子水洗涤后，0.1 %结晶紫染色；在光学显微镜下拍摄迁移的克隆； (6)Western blot检测细胞迁移相关蛋白表达水平:收集细胞加入RIPA缓冲液(50mM的 Tris pH7.4，150mM 氯化钠，1% 的 Triten X-100,0.1% SDS，I % 脱氧胆酸钠，5mMEDTA，IOOmM的氟化钠)及蛋白酶抑制剂，冰上孵育30分钟，13200rpm离心30min ;收集上清并BCA法(Pierce，USA)测定蛋白浓度；细胞总蛋白经12% SDS-PAGE凝胶电泳后转移到PVDF膜，室温下5%脱脂牛奶封闭Ih ;在4°C下孵育MT1-MMP、VEGF-C、VEGF-D和GAPDH(1:1000)的抗体过夜；PBST洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠二抗，室温下孵育lh，PBST洗涤后，超敏发光液孵育后采用LAS3000成像仪拍照； (7)酶联免疫吸附试验:A549细胞处理同前所述，收集细胞培养上清并根据MMP-9、MMP-2、VEGF-c ELISA检测试剂盒说明书进行后续的检测；每个样品重复5次； (8)统计分析:应用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料采用配对t检验及单因素方差分析，计数资料采用卡方检验，P < 0.05具有统计学意义。
【文档编号】G01N33/53GK103743909SQ201310653721
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】徐松涛, 马永超, 刘晓东, 范文娟, 郭小慧, 吴华, 李飞 申请人:漯河医学高等专科学校