专利名称：用于检测莱克多巴胺的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于检测分析和免疫学技术领域，具体涉及ー种用于检测莱克多巴胺的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒。
背景技术：
莱克多巴胺属于双苯烷胺类的P —受体兴奋剂，具有广泛的生理效应，常被用于支气管哮喘、支气管痉挛和产科疾病的治疗。它同时又是良好的营养重分配剂和生长促进齐U，因此被广泛用于饲料添加剤。莱克多巴胺在动物机体内的残留一旦通过食物链进入人体，会产生极大的危害，特别对心脏病、糖尿病、高血压、甲亢等病人危害更大，甚至会导致 死亡。目前，欧盟、日本等许多国家都将其列为违禁药物，禁止在畜禽生产上使用。我国农业部2002年3月农牧发[2002] I号文“关于发布《食品动物禁用的兽药及其化合物清単》的通知”中明确规定禁止使用莱克多巴胺，农业部、卫生部、国家药品监瞀管理局2002年第176号公告也明令禁止在饲料和动物饮用水中使用莱克多巴胺。现有的检测莱克多巴胺的方法主要有仪器分析方法和免疫化学分析方法等。仪器分析方法的样品前处理复杂，成本高，操作繁琐，适用于样品的确证分析，而不适用于大批量样品的筛选及现场检測。免疫化学分析法特别是酶联免疫方法(ELISA)具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合高通量样品筛选。因此对于快速检测3 —受体兴奋剂在动物组织中的残留，ELISA方法更具优势。Li等(2007)将莱克多巴胺与人血清白蛋白结合制备完全抗原，得到单克隆抗体，其IC5tl为21. 25叩/111し最低检测限为1.5 ng/mL。Weilin等(2000)研究建立了莱克多巴胺残留检测的ELISA方法，分别以Rac-hemiglutarate-血蓝蛋白和Rac-hemiglutarate-卵清蛋白为免疫原和包被原，制备多克隆抗体，检测莱克多巴胺IC5tl值为4. 2ng/mL。可见，半抗原的化学结构的细小差异，连接到载体蛋白上的化学位点的不同，交联臂化学性质的不同均是影响小分子化合物抗体性质的决定性因素。上述研究中多克隆抗体的灵敏度较高，但不利于标准化；单克隆抗体利于标准化生产，但是灵敏度又不够。因此，制备ー种灵敏度高的能用于检测莱克多巴胺的单克隆抗体和酶联免疫试剂盒，并建立相应的ELISA检测方法具有重要意义。

发明内容
本发明的目的是提供一种能识别莱克多巴胺的单克隆抗体和检测莱克多巴胺的酶联免疫方法与试剂盒。本发明还提供所述单克隆抗体在制备检测莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒中的应用以及酶联免疫方法和试剂盒在莱克多巴胺检测中的应用。上述目的是通过以下技术方案实现的一种能识别莱克多巴胺的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO: C201186的杂交瘤细胞Rac所分泌的。
所述的杂交瘤细胞Rac，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCN0:C201186o所用的免疫原是由半抗原琥珀酸酐莱克多巴胺(RAC-SA)与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备的。所述的单克隆抗体在制备检测莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒中的应用。
包含所述的单克隆抗体的试剂盒。所述试剂盒是用于检测莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒。所述的试剂盒在莱克多巴胺检测中的应用。ー种检测莱克多巴胺的酶联免疫方法，包括以下步骤(I)将半抗原琥珀酸酐莱克多巴胺(RAC-SA)与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原(RAC-SA-BSA)；(2)将半抗原(RAC-SA)与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原(RAC-SA-OVA)；(3)利用步骤(I)的免疫原制备保藏号为CCTCC N0:C201186的杂交瘤细胞Rac ；(4)利用保藏号为CCTCC N0:C201186的杂交瘤细胞Rac制备单克隆抗体；(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)样品前处理猪尿样品加こ腈处理离心后取上清；猪肉样品经酸处理后用こ酸こ酯反萃，再取こ酸こ酯层氮气吹干，残渣复溶后离心取上清，得待测物； (7)对步骤(6)的待测物进行检测。所述的酶联免疫方法在莱克多巴胺检测中的应用。本发明的有益效果是I.本发明制备的单克隆抗体能够特异性识别莱克多巴胺；2.本发明制备的单克隆抗体、酶联免疫试剂盒以及提供的酶联免疫方法灵敏度高，能检测更低浓度的莱克多巴胺残留，同时具有精密度高、灵敏度好的特点。


图I为本发明的技术路线图。图2为本发明的以莱克多巴胺为标准品的间接竞争ELISA反应标准曲线，X轴为莱克多巴胺标准溶液浓度对数值，Y轴为莱克多巴胺标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B。)。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进ー步说明，但不限制本发明。实施例I免疫原和包被原的制备I. I莱克多巴胺半抗原(RAC-SA)的合成RAC-SA的合成7. 3g氢化钠溶于IOOmL无水N，N — ニ甲基甲酰胺(DMF)中，氮气保护状态下，逐滴加入20g溶于IOOmLDMF中的4-(4-苯羟基)-2- 丁酮，混合物室温搅拌反应lh。准确称取28. 5g 4-溴丁酸こ酯溶于50mLDMF中，将其加入上述混合溶液中，于60°C水浴中搅拌反应过夜。用薄层色谱检测原料药反应完全。加入200mL水、200mLこ酸こ酯萃取有机相，之后用无水硫酸钠干燥。已烷与こ酸こ酯4:1过柱纯化得到白色固体。
准确称取上述白色固体7g及章胺盐酸盐6g，溶于200mL甲醇中，加入6. 2g三こ胺和2g氰基硼氢化钠，50°C反应过夜。蒸干溶剂，加入60mL HCl (IN)和IOOmL水，こ醚洗涤萃取杂质。水相用氢氧化钠(6N)调pH值至12-13,用こ酸こ酯萃取,有机相用无水硫酸钠干燥后得到混合物。称取7g上述混合物溶于90mL甲醇中，加30mL氢氧化钠(2N)室温搅拌反应过夜。将甲醇蒸发掉，加水IOOmL,并用盐酸(IN)调pH值至3-4，有白色固体析出，过滤，水洗，后烘干，得到莱克多巴胺半抗原(RAC-SA)，其化学结构式为(I )，合成路线如下
权利要求
1.一种能识别莱克多巴胺的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCC NO:C201186的杂交瘤细胞Rac所分泌的。
2.权利要求I所述的杂交瘤细胞Rac，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:C201186。
3.权利要求I所述的单克隆抗体在制备检测莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒中的应用。
4.包含权利要求I所述的单克隆抗体的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒是用于检测莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒。
6.权利要求4或5所述的试剂盒在莱克多巴胺检测中的应用。
7.—种检测莱克多巴胺的酶联免疫方法，其特征在于包括以下步骤 (1)将半抗原琥珀酸酐莱克多巴胺与牛血清白蛋白偶联得到免疫原； (2)将半抗原与卵清蛋白偶联得到包被原；(3)利用步骤(I)的免疫原制备得到保藏号为CCTCCN0:C201186的杂交瘤细胞Rac ； (4)利用保藏号为CCTCCN0:C201186的杂交瘤细胞Rac制备单克隆抗体； (5)用步骤(2)的包被原包被固相载体； (6)样品前处理猪尿样品加こ腈处理离心后取上清；猪肉样品经酸处理后用こ酸こ酯反萃，再取こ酸こ酯层氮气吹干，残渣复溶后离心取上清，得待测物； (7)对步骤(6)的待测物进行检测。
8.权利要求7所述的酶联免疫方法在莱克多巴胺检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种能识别莱克多巴胺的单克隆抗体，所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞Rac所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201186。本发明还公开了用于检测莱克多巴胺的酶联免疫方法和试剂盒及其在莱克多巴胺检测中的应用。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体能够特异性识别莱克多巴胺，酶联免疫方法及试剂盒能检测更低浓度的莱克多巴胺残留，检测灵敏度、准确度高，精密度好。
文档编号G01N33/577GK102778564SQ201210176468
公开日2012年11月14日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者刘振利, 彭大鹏, 潘源虎, 王玉莲, 章玲燕, 袁宗辉, 陶燕飞 申请人:华中农业大学