专利名称：水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株的特异性检测用引物探针组合和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种采用荧光PCR技术，特异性检测样品中水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株核酸存在的寡核苷酸序列组合，以及包括该组合的试剂盒。
背景技术：
水痘是由水痘-带状疱疹病毒初次感染所引起的一种急性传染病，以皮肤、粘膜分批出现斑、丘、疱疹及结痂为主要临床特征，冬春季节好发于婴幼儿，易感儿发病率可达95%以上，学龄前儿童多见。该病为自限性疾病，病后可获得终身免疫，也可在多年后感染复发而出现带状疱疹。水痘患者是唯一的传染源，主要通过空气飞沫经呼吸道和直接接触疱疹的疱浆而 传染。任何年龄均可感染，以婴幼儿和学龄前、学龄期儿童发病较多。本病全年均可发生，以冬、春季较多见。水痘-带状疱疫病毒属于疱疫病毒科水痘病毒属,遗传物质为双链DNA,基因全长约为125kb,是目前最小的疱疫病毒。Loparev等人通过对全世界各地分离的水痘-带状疱疹病毒的第22个开放阅读框进行核苷酸序列分析，将水痘-带状疱疹病毒分为3个基因型，包括European (E)、Japanese (J)和mosaic (Μ)。其中，M基因型又进一步可分为MI和M2两个亚型。杨吉星等人报导了上海3例水痘病例是由J型水痘-带状疱疹病毒引起的，Loparev等人报道从中国南方收集到的3份临床标本全为M基因型，而从中国北方收集到的3份临床标本全为E基因型。张铁钢等人报导北京地区水痘病例主要是由J型水痘-带状疱疫病毒引起的。目前，实验室可通过电子显微镜检查，取新鲜疱疹内液体，直接在电镜下观察疱疹病毒颗粒进行实验室确诊。或者利用水痘-带状疱疹病毒敏感细胞系，进行病毒分离。也可以通过ELISA方法，检测特异性水痘病毒IgM抗体。本发明针对水痘-带状疱疹病毒特异的靶序列设计引物和Taqman-MGB探针，利用real-time PCR的方法，用来鉴别检测样品中水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株核酸,可以快速获得特异性检测结果。

发明内容
为了更加准确地检测样品水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株核酸存在，本发明提供一种特异性检测样品中水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株的寡核苷酸序列组合和包含该组合的试剂盒，其特征在于序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于核酸扩增的引物为PI : 5'-ACGACGGCCTGGGCGTC-3'，P2 :5' -GTATCTAGGCTCGCGGTTGG-3'，Pl和P2为针对水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性引物。本发明的特征还在于，序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为Probel :5'-X-ATCCCTGGGCCACC-Y-3'，Probe2 5'-X-ATCCCCGGGCCAC-Y-3'。。X1和X2为荧光报告基团，Y1和Y2为荧光淬灭基团。Probel为针对水痘-带状疱疹病毒野病毒基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，Probe2为针对水痘-带状疱疹病毒疫苗株基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性探针。本发明的特征还在于，试剂盒包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控
品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为去离子水，阳性质控品为含有检测靶序列的核酸。本发明的一优选实施方案为序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于突光信号监测的寡核苷酸探针的荧光基团分，其中Probel荧光报告基团X1为Fam，Y1为荧光淬灭基团Eclipse, Probe2 突光报告基团 X2 为 Vic, Y2 为 Minor Groove Binder (MGB)复合物。本发明的另一优选实施方案为试剂盒的包含上述一对特异性引物和两条特异性探针，属于实时荧光双重PCR检测，可在同一个反应体系中对水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株核酸进行检测和鉴别。本发明的另一优选实施方案为试剂盒的PCR反应循环参数为95°C，2min ;进入循环阶段95°C变性10s，60°C退火延伸lmin，共反应40个循环。本发明的另一优选实施方案，试剂盒选用的PCR反应体系为20 μ 1，包括2XPCR缓冲液 10 μ lUOmmol/L dNTP I. O μ l、25ymol/L 引物各 0. 5 μ I、10 μ mol/L 探针各 O. 2 μ I、热启动Taq酶混合液O. 4 μ I、样品DNA 2μ I，加灭菌水至终体系20 μ I。本发明提供的试剂盒对水痘-带状疱疹病毒野病毒核酸的检测下限为20个拷贝每反应体系；对疫苗株核酸的检测下限均为20个拷贝每反应体系。本发明分别根据水痘-带状疱疹病毒野病毒或疫苗株基因组保守区分别设计特异性引物和探针，提供的试剂盒可以检出水痘-带状疱疹病毒野病毒或疫苗株的核酸，但不能检出非水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株病原体的核酸，说明试剂盒具有很好的特异性。本发明提供的试剂盒3小时内即可完成检测，双重检测可节省50%的检测费用，可为水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株的疾病监测和临床诊断提供实验依据。


图I为双重实时荧光PCR检测水痘-带状疱疹病毒野病毒核酸灵敏度的扩增曲线图。从左至右的5条曲线分别为水痘-带状疱疹病毒野病毒特异性PCR片段构建质粒梯度稀释(IO5-IO1)后扩增结果。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的Λ Rn 值。图2为双重实时荧光PCR检测水痘-带状疱疹病毒疫苗株灵敏度的扩增曲线图。从左至右的5条曲线分别为水痘-带状疱疹病毒疫苗株特异性PCR片段构建质粒梯度稀释(IO5-IO1)后扩增结果。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的ARn值。图3为实时荧光双重PCR检测体系对水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株DNA的检测特异性扩增曲线。水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株均出现S型扩增曲线，而其他病原微生物质控均未 出现S型扩增曲线。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的Λ Rn值。
具体实施例方式下面结合具体实施例详细说明本发明的优选实施方式。需要指出的是，这里列出的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。I、引物和TaqMan探针的设计与合成利用Blast工具对Genbank和国内外文献中的所有的水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株基因组序列进行分析，分别选择其稳定的保守区域作为检测靶序列，并针对这两个检测靶序列设计和合成引物和探针(见表I)。引物由TaKaRa大连宝生物公司合成，探针由ABI公司合成，其中水痘-带状疱疹病毒野病毒的检测探针5’端标记FAM荧光基团，3’端为荧光淬灭基团Eclipse，疫苗株的检测探针5’端标记Vic荧光基团，3’端为MGB复合物。2、检测菌种的准备本实施例中所使用的本实施例中所使用的水痘-带状疱疹病毒野病毒、其他质控病毒(单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和EB病毒)为朝阳医院检验科分离惠赠，水痘疫苗株为长春祈健胜痘士疫苗株。。3、菌株DNA的抽提选用Qiagen公司QIAamp DNA Mini Kit (货号51306)提取菌株DNA。具体步骤试剂盒参考操作说明书。4、引物和探针的筛选采用设计的多套引物和探针分别检测提取的水痘-带状疱疹病毒野病毒、疫苗株和阴性对照毒株的基因组DNA，经反复实验，筛选出灵敏度、特异性和重复性最佳的引物探针组合。(见序列表，水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株正向引物PU反向引物P2，水痘-带状疱疹病毒野病毒探针为probel ;疫苗株探针为probe2)5、标准品的构建与制备分别利用pi和P 2引物，PCR扩增水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株特异性基因片段，将PCR产物克隆至PMD-18T载体，转化DH 5α大肠杆菌，利用碱裂解法提取阳性克隆质粒，利用紫外可见分光光度计分别测定在波长260nm处、280nm处DNA的吸光率，然后计算质粒浓度与纯度。然后10倍梯度稀释至10个拷贝每微升。6、反应条件优化对引物、探针、酶等要素逐一优化，确定的反应体系为2XPCR缓冲液10 I、IOmmoI/L dNTP I. O l、25mol/L 引物各 O. 5 I、10mol/L 探针各 O. 21、Takara 聚合酶混合物0.4 I、模板2ul，加灭菌水至终体系20 I。
根据扩增片段长、引物和探针的退火温度以及酶的特性，主要对反应退火温度和延伸时间进行了优化，最终确定的循环参数为预变性95°C，2min ;扩增和检测95°C变性10s，60°C退火延伸lmin，40个循环，每个循环在退火及延伸阶段采集荧光信号。在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的Ct值。7、检测限的评价以上述5中的标准品评价本发明的提供的试剂盒的检测限，阳性标准品浓度为I X IO5Copies/ μ I，I X IO4Copies/ μ I, I X IO3Copies/ μ I, I X IO2Copies/ μ I，
IX IO5Copies/ μ I, I X IO5Copies/ μ I,本发明提供的试剂盒对水痘_带状疱疫病毒野病毒核酸的检测下限为20个拷贝每反应体系；对疫苗株核酸的检测下限为20个拷贝每反应体
系O
8、检测特异性的评价以上述2中的菌株DNA为模板评价了本试剂盒的特异性。对水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株DNA进行检测时均可见明确的扩增曲线，对上述3种其他咽部常见质控病毒DNA检测时，未产生阳性扩增曲线，说明我们使用的探针和引物与我们选定的其他咽部常见的DNA病毒之间不存在交叉反应。尽管上文中以优选的方式，通过具体实施例示例性说明了本发明的某些实施方式，但是本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，而是可以根据本发明所属技术领域的知识对其进行修改，所作修改不会超出本发明要求保护的范围。例如，本发明所使用的荧光实时PCR也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧光基团和荧光淬灭基团以外的标记物质，如Tet、FAM、HEX、TAMRA, ROX, Cy3、TxRd、JOE等标记物；或使用Taqman技术之外的其他标记体系,例如MGB探针、分子信标MB探针、蝎形探针、荧光双杂交探针等荧光探针标记技术；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不饱和染料与LC Green等饱和染料，只要其使用了本发明所述的特异性引物序列，即可定性或定量检测目的基因的存在，进而特异性地检测水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株的存在。所以，这些本领域技术人员所了解的改变和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围应由所附的权利要求书所限定。
权利要求
1.一种用于特异性检测样品中水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株核酸的引物组合，这套序列组合特征在于包括下列引物Pl 5'-ACGACGGCCTGGGCGTC-3',P2 5'-GTATCTAGGCTCGCGGTTGG-3'。
2.一种用于特异性检测样品中水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株核酸的引物和寡核苷酸探针组合，其中引物为权利要求I所述的引物，寡核苷酸探针为Probei:5'-X1-AtccctgggccAcc-Y1-S'，Probe2 :5'-X2-ATCCCCGGGCCAC_Y2-3'。
X1和X2为荧光报告基团，Y1和Y2为荧光淬灭基团。
3.如权利要求2所述，这套序列组合特征还在于，其中Probel荧光报告基团X1为Fam, Y1为突光淬灭基团Eclipse, Probe2突光报告基团X2为Vic, Y2为Minor GrooveBinder (MGB)复合物。
4.如权利要求2所述，这套序列组合特征还在于，可用于双重实时荧光聚合酶链反应检测，即一个反应体系可同时检测和鉴别水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株核酸。
5.一种用于特异性检测样品中水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株核酸的试剂盒，其中包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其特征在于PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物序列如下Pl 5'-ACGACGGCCTGGGCGTC-3',P2 5'-GTATCTAGGCTCGCGGTTGG-3'。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于PCR反应液中用于突光信号监测的寡核苷酸探针的序列如下Probei:5'-X1-AtccctgggccAcc-Y1-S'，Probe2 :5'-X2-ATCCCCGGGCCAC_Y2-3'。
X1和X2为荧光报告基团，Y1和Y2为荧光淬灭基团。
7.如权利要求5所述的的试剂盒，其特征还在于PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针其中Probel荧光报告基团X1为Fam，Y1为荧光淬灭基团Eclipse，Probe2荧光报告基团 X2 为 Vic, Y2 为 Minor Groove Binder (MGB)复合物。
8.如权利要求5所述的的试剂盒，其特征还在于PCR反应体系为20iil，包括2 X PCR缓冲液 IOu lUOmmol/L dNTP l.Ou l,25umol/L 引物各 0. 5 u I、10 y mol/L 探针各 0. 2u I,热启动Taq酶混合液0. 4iU、样品DNA 2 U I，加灭菌水至终体系20 yl。
9.如权利要求5所述的的试剂盒，其特征还在于PCR反应循环参数为 95°C，2min ;进入循环阶段95°C变性10s，60°C退火延伸lmin，共反应40个循环。
全文摘要
本发明涉及一种采用荧光PCR技术，特异性检测样品中水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株核酸存在的寡核苷酸序列组合，以及包括该组合的试剂盒。该试剂盒能够灵敏地检测并鉴别样品中存在的水痘-带状疱疹病毒野病毒和疫苗株核酸，其检测下限均为20拷贝每反应体系，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。
文档编号G01N21/64GK102660652SQ20121013703
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者其他发明人请求不公开姓名, 文锋 申请人:镇江和创生物科技有限公司