专利名称：一种细菌内毒素定量检测的新方法——动态终点法的制作方法
技术领域：
本发明涉及细菌内毒素定量检测方法。
背景技术：
细菌内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结构中的脂多糖成分，具有多种生物活性，是一种主要的热原物质。
细菌内毒素检测所使用的试剂是鲎试剂(TAL或LAL)。TAL中含有能被极微量细菌内毒素激活的因子C、因子B、凝固酶原以及凝固蛋白原。在适宜条件下(温度、PH值以及无干扰物质等)，细菌内毒素能使TAL产生凝集反应。
细菌内毒素检测的方法学分类如下 细菌内毒素定量检测法的原理是使用光电检测仪，把内毒素与TAL凝集反应所产生的浊度/色度变化转变为光度值的变化，建立内毒素浓度与光度值及相关参数关系的数学模型，从而定量测定样品的内毒素含量。
终点法检测原理是根据鲎试验反应在到达预设的反应时间(终点)时的光度值与细菌内毒素浓度建立数学模型(标准曲线)，然后进行定量检测。
动态法检测原理是根据鲎试验反应的光度变化到达预设值时所需要的反应时间与细菌内毒素浓度建立数学模型(标准曲线)，然后进行定量检测。
终点法的内毒素检测范围一般为1个数量级，其特点是反应时间短。动态法反应时间一般较长，其特点为内毒素检测范围大，可达3到4个数量级。终点法与动态法的检测灵敏度比凝胶法有近10倍的提高。
已有的终点法的内毒素检测技术介绍如下取一支(瓶)标准内毒素，按标示效价用细菌内毒素检查用水把它稀释成至少三个等比浓度C1、C2及C3，分别与TAL在37℃±1℃恒温条件下反应一定时间T，此时间即为终点时间。通过光电仪读取各反应物的光度值或终止反应后再读取光度值OD1、OD2及OD3。将参数C1-OD1、C2-OD2及C3-OD3作回归分析，得到一条标准曲线，并求得其相关系数(r)。若相关系数|r|≥0.98，则可使用此标准曲线来定量检测样品中未知的内毒素含量。
已有终点法技术的缺陷在于对重要参数终点时间的选择有盲目性，其选择主要依据相关系数。根据已有的终点法，在确定终点时间T时，如果在终点时间T1得到的相关系数|r|＜0.98，必须更换另一终点时间T2重做试验，直到相关系数|r|≥0.98。

发明内容
本发明要解决的问题是现有终点法技术存在对重要参数终点时间的选择有盲目性的缺陷，提供一种细菌内毒素定量检测的新方法——动态终点法。
本发明的细菌内毒素定量检测的新方法——动态终点法，其方法步骤如下①使用凝胶法、终点法、动态比浊法或动态比色法鲎试剂做动态终点法检测细菌内毒素；②确定建立标准曲线所需的标准内毒素浓度，制备至少三个浓度的标准内毒素浓度，分别与鲎试剂在光电检测仪上反应，光电检测仪采集反应数据，通过计算机记录并描绘出各反应的动态曲线；③计算机根据反应动态曲线，自动确定合理的反应终点时间段，并在此时间段内自动搜索出最佳终点时间T0；④利用最佳终点时间T0建立标准曲线，在光电检测仪上进行终点法定量检测样品的内毒素含量。
每批号鲎试剂与特定的系列浓度标准内毒素反应，其最佳终点时间T0是一个固定的值。
阴性对照的内毒素含量要小于标准曲线的最低点浓度。
所述细菌内毒素定量检测方法的计算机程序，包括记录试验试管的序号、名称、样品批号、稀释倍数、标准内毒素五项参数及光电检测仪读取的透光强度；以数据文件形式将记录的数据保存；
打开数据文件，将试验中每个试管的序号、名称、样品批号、稀释倍数及标准内毒素五项参数写入表格前五列；每一个试管的透光强度在对应的二维数组datak[i，j]{试管序号i＝1，2，……，96，采样数据j＝1，2，……，}中，进行数据分析；数据分析的方法选择；搜索最佳终点时间；利用最佳终点时间进行样品细菌内毒素含量的终点法检测试验。
搜索最佳终点时间包括①终点法分析方法选择A、光密度法(OD)——Is/Ie，随着试验时间的增加，OD值逐渐增大，变化范围在1～1.7之间。
OD法的回归方程是Lg(Is/Ie)＝a+bC，C为内毒素浓度，a，b为回归方程系数。
B、透光度法(RT)——Ie/Is，随着试验时间的增加，RT值逐渐减小，变化范围在0.3～1之间。
RT法的回归方程是Ie/Is＝a+bC，C为内毒素浓度，a，b为回归方程系数。
②从表格中取出标准管的序号后，建立标准管数组；③标准管中内毒素浓度值存放在数组X[I]中，计算Lxx＝∑Xi2-(∑Xi)2/n；n为标准管数目，I＝1，2，……，n④从5分钟开始，每增加1分钟取一组标准管的透光强度数据，计算OD值或RT值到数组Y[i]{OD法Y＝Lg(Is/Ie)，RT法Y＝Ie/Is}中其中Is——初始光强，取稳定期wdq(一般为12个采样周期)之后的三个光强平均值作为初始光强；Ie——态光强，任意采样时间下的透光强度；Dt——采样间隔，5秒或10秒；从数据文件头中取得；⑤计算Lyy＝∑Yi2-(∑Yi)2/n；Lxy＝∑Xi*Yi-(∑Xi)*(∑Yi)/n；n为标准管数目，I＝1，2，……，n；相关系数R＝Lxy/(sqrt(Lxx)*sqrt(Lyy))⑥当相关系数R＞0.9999时，跳出循环，取得此时间为最佳终点时间的参考值；否则取相关系数绝对值最大时的时间作为最佳终点时间的参考值。
确定终点时间
①标准管的内毒素浓度在一个数量级，浓度个数在三个及以上；②最小浓度管的动态曲线已与阴性对照管的动态曲线分开；③最大浓度管的动态曲线尚未进入平坦期。
动态终点法的优点1.与已有终点法比较；重要参数终点时间的选择更合理，标准曲线的线性更好。
动态终点法以反应动态曲线作为参考，确定合理的终点时间段，利用计算机搜索出最佳的终点时间。图1中，Ea、Eb、Ec及Ed是标准内毒素与TAL的反应动态曲线，NC是检查用水与TAL的反应动态曲线，即阴性对照的动态曲线。如果选择终点时间为24分钟，此时Ea、Eb、Ec及Ed的光度值(OD)分别为1.09195、1.03826、1.02041及1.01485，通过Ea-ODa、Eb-ODb、Ec-ODc及Ed-ODd作回归分析，得到一条标准曲线，此标准曲线的相关系数|r|＝0.9895＞0.98，但从图1中可以看到，24分钟时最低浓度Ed及Ec的动态曲线与阴性对照NC的动态曲线几乎重合，说明此时Ed、Ec及NC的光度值非常接近，以此终点时间建立的标准曲线显然不合理。动态终点法利用反应曲线，搜索并选择出合理的、最佳的终点时间(T0)来建立标准曲线。
2.与动态法比较缩短试验时间，提高检测灵敏度。
动态终点法具有试验时间短的特点，提高细菌内毒素检测的效率。其试验时间的长短与试剂及内毒素浓度有关。通常动态终点法的试验时间都明显比动态法要短。
动态终点法可以提高检测灵敏度。以图1的内毒素浓度Ed为例，反应动态曲线在60分钟内不与预设的92％的OD值(粗横线)相交，表明此动态法试验的检测灵敏度达不到Ed，但如果改为动态终点法，则可以使检测灵敏度达到Ed。
3.可以使用动态法试剂来做终点法检测。


图1是搜索最佳终点时间的标准内毒素的反应动态曲线图；图2是样品检测标准内毒素的反应动态曲线图；图3是供试品及供试品阳性对照的反应动态曲线图；图4是本发明计算机程序流程图。
具体实施例方式
本发明的细菌内毒素定量检测方法——动态终点法，包括动态终点比浊法和动态终点比色法。动态终点法是利用光电检测仪采集反应数据，利用计算机记录并描绘反应动态曲线，确定合理的终点时间段，搜索出最佳的终点时间，然后以此终点时间建立标准曲线，从而定量的测定样品的内毒素含量。
最佳终点时间的选择以动态终点浊度法为例来说明最佳终点时间的选择问题。最佳终点时间的选择必须依赖动态反应曲线，通过分析动态反应曲线，选择出合理的终点时间段，然后依据计算机搜索出最佳终点时间。如图1所示，应选择内毒素浓度最低点的动态曲线已明显下降，浓度最高点的动态曲线还未达最低点的区域，即34分钟至50分钟时间段，利用计算机在此时间段内搜索出最佳终点的时间T0为47分，相应的标准曲线相关系数|r|＝0.9977。
内毒素定量检测法有一项要求就是阴性对照的内毒素含量要小于标准曲线的最低点浓度，如果浓度最低点动态曲线没有明显下降，而是与阴性对照的动态曲线重合，如图1，试验时间小于20分钟，此时得到阴性对照的内毒素含量等于标准曲线的最低点浓度，就不符合定量检测法的要求。如果浓度最高点的动态曲线已经达到最低点，如图1，试验时间大于54分钟，此时，标准曲线的最高点浓度的光度值已达到最高值，不再变化，这样建立的标准曲线显然也不合理。
最佳终点时间(T0)的意义一批号的TAL与一批号的标准内毒素的一系列浓度(如Ea、Eb、Ec……)反应所获得的T0是一个固定值，这意味着如果再次使用这批号的TAL时，不必再依赖反应动态曲线去搜索T0，利用第一次试验的T0就可以直接做终点法检查。这使得试验极为方便，也可以用动态法试剂做终点法检测。
实施例1.试验材料标准内毒素(CSE)，鲎试剂(TAL)，细菌内毒素检查用水(W)；待测样品即供试品(S)；光电检测仪。
2.试验方法及步骤2.1确定建立标准曲线所需要的标准内毒素浓度。如0.3、0.15、0.075、0.03Eu/ml，分别记为E0.3、E0.15、E0.075、E0.03；2.2取1支(瓶)CSE，按标示效价用W稀释成所需浓度，分别与TAL在光电检测仪上进行60分钟反应；光电检测仪在反应过程动态的采集反应数据(光强度值)。
2.3分析由光电检测仪通过计算机记录并描绘出的反应动态曲线，确定合理的终点时间段，利用计算机搜索出终点时间段内的最佳的终点时间T0；
2.4利用最佳终点时间T0，在光电检测仪上进行终点法定量检测样品的内毒素含量2.4.1取CSE1支，按说明书溶解及稀释至所需浓度，如E0.3、E0.15、E0.075及E0.03；2.4.2稀释S至检测浓度。如S检测浓度为1∶4稀释(记为S4)；2.4.3制备S4的阳性对照(PPC)，使S4含有0.075Eu/ml标准内毒素，记为S4E0.075；2.4.4取TAL分别与制备好的CSE稀释系列溶液、S4及S4E0.075在光电检测仪上进行以T0为反应终点时间的终点法检测。
3.试验结果3.1标准内毒素的反应动态曲线见图2。
3.2供试品(S4)及供试品阳性对照(S4E0.075)的反应动态曲线见图3。
3.3检测报告见表1。
4.结果分析4.1内毒素定量检测法要求标准曲线的相关系数|r|＞0.98；阳性对照回收率在50％-200％内；NC(阴性对照)的内毒素含量小于标准曲线的最低点浓度。
4.2本试验标准曲线的相关系数|r|＝0.9976，由检测报告表1可看出，阳性对照S4E0.075的回收率为114.93％，NC的内毒素含量为0.0216Eu/ml，小于标准曲线的最低点浓度0.03Eu/ml，本试验有效。
本发明是利用光电检测仪及计算机进行细菌内毒素定量检测。
本计算机程序记录试验试管的序号、名称、样品批号、稀释倍数、标准内毒素等五项参数及光电检测仪读取的透光强度，以数据文件形式保存。
程序打开数据文件后，将试验中每个试管的序号、名称、样品批号、稀释倍数、标准内毒素等五个参数写入表格前五列。每一个试管的透光强度在对应的二维数组datak[i，j]{试管序号i＝1，2，……，96，采样数据j＝1，2，……，}中，进行数据分析。搜索最佳终点时间，利用最佳终点时间进行样品内毒素含量的终点法检测试验。其主要流程图4。
搜索最佳终点时间1.终点法分析方法选择①光密度法(OD)——Is/Ie，随着试验时间的增加，OD值逐渐增大，变化范围在1～1.7之间。
OD法的回归方程是Lg(Is/Ie)＝a+bC，C为内毒素浓度，a，b为回归方程系数。
②透光度法(RT)——Ie/Is，随着试验时间的增加，RT值逐渐减小，变化范围在0.3～1之间。
RT法的回归方程是Ie/Is＝a+bC，C为内毒素浓度，a，b为回归方程系数。
2.从表格中取出标准管的序号后，建立标准管数组；3.标准管中内毒素浓度值存放在数组X[I]中，计算Lxx＝∑Xi2-(∑Xi)2/n；n为标准管数目，I＝1，2，……，n；4.从5分钟开始，每增加1分钟取一组标准管的透光强度数据，计算OD值或RT值到数组Y[i]{OD法Y＝Lg(Is/Ie)，RT法Y＝Ie/Is}中，其中Is——初始光强，取稳定期wdq(一般为12个采样周期)之后的三个光强平均值作为初始光强；Ie——动态光强，任意采样时间下的透光强度；Dt——采样间隔，5秒或10秒；从数据文件头中取得；5.计算Lyy＝∑Yi2-(∑Yi)2/n；Lxy＝∑Xi*Yi-(∑Xi)*(∑Yi)/n；n为标准管数目，I＝1，2，……，n；相关系数R＝Lxy/(sqrt(Lxx)*sqrt(Lyy))6.当相关系数R＞0.9999时，跳出循环，取得此时间为最佳终点时间的参考值；否则取相关系数绝对值最大时的时间作为最佳终点时间的参考值。
注上述算法获得的终点时间仅供参考，实际上应当按标准管的浓度范围和动态曲线形态选择最佳终点时间；确定终点时间的具体要求是①标准管的内毒素浓度在一个数量级，浓度个数应在三个及以上；②最小浓度管的动态曲线已与阴性对照管的动态曲线分开；③最大浓度管的动态曲线尚未进入平坦期；如果不满足上述要求，终点法分析不适用。
最佳终点时间搜索的核心源程序(Delphi语言)<pre listing-type="program-listing">procedure TForm3.BitBtn23Click(SenderTObject)；∥自动搜索终点时间“按钮”var∥……变量类型定义begin ∥……变量初始化等 for i＝1 to 96 do ∥Eustd＝’内毒素标准’ begin　　if(pos(EuStd，TubeHead[i，2])＝0)or(pos(′无效′，TubeHead[i，2])＞0)or　　 (Length(trim(TubeHead[i，5]))＝0)then continue；　　//非标准管、无效管、没有浓度的管均跳过　　tubm＝tubm+1；∥tubm标准管数目　　z[tubm]＝strTofloat(TubeHead[i，5])； ∥内毒素浓度　　num[tubm，1]＝i；∥num的1列为管号 end； k＝0； for i＝1 to 96 do x[i]＝0； fori＝1 to tubm do begin　　if num[i，2]＞0 then continue；　　k＝k+1； num[i，2]＝k； x[k]＝z[i]； ∥内毒素浓度在X[]数组中　　for j＝1 to tubm do　　if abs(z[j]-x[k])＜1e-4 then num[j，2]＝k ∥num的2列为组号 end； tubm1＝k； ∥浓度个数 if tubm1＞1 then begin　　xm＝0；for j＝1 to tubm1 do xm＝xm+x[j]；　　lxx＝0；forj＝1 to tubm1 do lxx＝lxx+x[j]*x[j]；lxx＝lxx-xm*xm/tubm1；　　rdmax＝0；kmax＝5；　　tk＝CTime(StrToInt(DataHead[9]))； ∥最大测试时间_分钟　　for k＝5 to tk do　　begin　　 for j＝1 to 96 do begin z[j]＝0；y[j]＝0；end；　　 m＝(k*60)div StrToInt(DataHead[9])；flag＝1；　　 for i＝1 to tubm do　　 begin　　ave＝0；&lt;dp n="d8"/&gt;　　 for j＝wdq+1 to wdq+3 do ave＝ave+datak[num[i，1]，j]；　　 ave＝Round(ave/3)；　　 if RadioButtonl.Checked then z[i]＝ave-datak[num[i，1]，m]　　 eise if ave＞0 then z[i]＝datak[num[i，1]，m]/ave else z[i]＝0；　　end；　　for i＝1 to tubm1 do　　begin　　 ym＝0；n＝0；　　 for j＝1 to tubm do　　 if(num[j，2]＝i)and(z[i]＞0)then begin n＝n+1；ym＝ym+z[j]；end；　　 if n＞1 then y[i]＝ym/n； ∥y[i]中放同一浓度下的平均OD或RT值　　end；　　for j＝1 to tubm1 do　　begin　　 if y[j]＜＝0 then begin flag＝0；break；end；　　 if RadioButtonl.Checked then y[j]＝log10(y[j])； ∥对OD取对数　　end；　　if flag＝0 then continue；　　ym＝0；for j＝1 to tubm1 do ym＝ym+y[j]；　　lxy＝0；for j＝1 to tubm1 do lxy＝lxy+x[j]*y[j]；lxy＝lxy-xm*ym/tubm1；　　lyy＝0；for j＝1 to tubm1 do lyy＝lyy+y[j]*y[j]；lyy＝lyy-ym*ym/tubm1；　　rd＝lxy/(sqrt(lxx)*sqrt(lyy))；　　if abs(rd)＞abs(rdmax)then begin rdmax＝rd；kmax＝k；end　　else if abs(rd)＞0.9999 then break； end；　　∥……写终点时间及相关系数到对应组件中　　messageDlg(′自动搜索时间仅供参考！′，mtInformation，[mbOK]，0)； end else messageDlg(′内毒素浓度少于2个，不能自动搜索！′，mtInformation，[mbOK]，0)；end；</pre>按终点时间计算每个试管的OD值(或RT值)1.按前述要求，参考自动搜索的最佳终点时间和标准管的动态曲线，指定终点时间；2.按“确定”按钮后，计算每个管的OD值(或RT值)写入表格第7列。计算OD值(或RT值)的核心源程序(Delphi语言)<pre listing-type="program-listing"> procedure TForm3.BitBtn20Click(SenderTObject)；∥终点法时间″确定″ var ∥……变量类型定义 begin　　 t0＝StrToInt(DataHead[9])；∥采集间隔——秒　　 t2＝StrToInt(SpinEdit5.Text)； ∥终点时间——分钟　　 k＝(t2*60)div t0；&lt;dp n="d9"/&gt;　　 Edit22.Text＝″；　　 Edit23.Text＝SpinEdit5.Text+′分′；　　 if RadioButtonl.Checked then StringGrid2.Cells[6，0]＝′光密度O.D.′　　 else StringGrid2.Cells[6，0]＝′透光度′；　　 for i＝1 to StringGrid2.RowCount do　　 begin　　ave＝0；　　for j＝wdq+1 to wdq+3 do ave＝ave+datak[i，j]；　　t0＝Round(ave/3)；∥Is　　t1＝datak[i，k]； ∥Ie　　if RadioButtonl.Checked then if t1＞0 then diff＝t0/t1 else diff＝0　　else if t0＞0 then diff＝t1/t0 else diff＝0；　　if diff＞0 then stringGrid2.Cells[6，i]＝FloatToStrF(diff，ffFixed，8，6)；　　 end；　　 ∥……按钮操作逻辑控制 end；</pre>标准曲线的回归分析1.从表格第5列取得标准管浓度存放在Xi数组中，从表格第7列取得标准管的OD值(或RT值)放在Yi组中；2.如果是平均回归，将同一浓度的标准管的OD值(或RT值)平均，有多少个浓度则认为有几个标准管。
3.计算Xm＝∑Xi2/n， Ym＝∑Yi2/n，Lxx＝∑Xi2-(∑Xi)2/nLyy＝∑Yi2-(∑Yi)2/n；Lxy＝∑Xi*Yi-(∑Xi)*(∑Yi)/n；n为标准管数目，i＝1，2，……，n；回归方程参数Aod＝Lxy/Lxx，Bod＝Ym-b*Xm；Rod＝Lxy/(sqrt(Lxx)*sqrt(Lyy)) 为相关系数4.根据回归方程计算各管的内毒素实测值及其它参数，如回收率、标准方差、变异系数，分别写到表格的对应列中。终点法回归分析的核心源程序(Delphi语言)<pre listing-type="program-listing">procedure Regress(ffInteger)； ∥终点法求回归ff＝0直接回归，ff＞0平均回归 “过程” var ∥……变量类型定义begin tubm＝0； for i＝1 to 96 do begin　　Eutmp[i]＝0；　　　if(pos(EuStd，TubeHead[i，2])＝0)or(pos(′无效′，TubeHead[i，2])＞0)or　　 (Length(trim(TubeHead[i，5]))＝0)then continue；　　∥非标准管、无效管、没有浓度的标准管均跳过　　 tubm＝tubm+1；　　 Eutmp[tubm]＝strToffoat(TubeHead[i，5])； ∥内毒素浓度 end；∥tubm标准管数目 j＝0；eu1＝0； for i＝1 to tubm do begin　　eu2＝Eutmp[i]；∥内毒素浓度　　if abs(eu2-eu1)＞1e-5 then　　begin j＝j+1； sEu[j]＝floatTostr(Eutmp[i])； eu1＝eu2；end； end； ∥sEu[j]存放内毒素浓度值字串，j为内毒素标准个浓度数2，3，4…，8 k＝j； if k＞＝2 then begin　　for i＝1 to 96 do begin x[i]＝0；y[i]＝0；end；　　j＝0；　　for i＝1 to 96 do　　begin　　fi(pos(EuStd，TubeHead[i，2])＝0)or (pos(′无效′，TubeHead[i，2])＞0)or　　 (Length(trim(TubeHead[i，5]))＝0)then continue；　　s1＝Trim(form3.StringGrid2.Cells[6，i])；　　if length(s1)＞0 then　　 if StrToFloat(s1)＞0 then　　 begin　　 j＝j+1；　　 x[j]＝StrToFloat(TubeHead[i，5])；∥标准管浓度值　　 y[j]＝StrToFloat(s1)； ∥取得有效标准管的OD或RT值　　 end； end；∥取得标准内毒素坐标点x[j]，y[j]，取对数，j为标准管数目&lt;dp n="d11"/&gt;　　 tubm＝j；　　 if ff＞0 then∥对同一浓度的试管，终点时间下的OD或RT值取平均　　 begin　　for k1＝1 tok do ∥k个浓度　　begin　　 yav[k1]＝0；m1＝0；xav [k1]＝strTofloat(sEu[k1])；　　 for i＝1 to tubm do　　 if abs(strtoFloat(sEu[k1])-x[i])＜1e-5 then　　 begin m1＝m1+1；yav[k1]＝yav[k1]+y[i]； end；　　 if m1＞0 then yav[k1]＝yav[k1]/m1；　　end；　　for i＝1 to k do begin x[i]＝xav[i]；y[i]＝yav[i]；end；　　tubm＝k；　　 end；∥平均回归的数据准备完成　　 for j＝1 to tubm do　　if Form3.RadioButtonl.Checked then y[j]＝log10(y[j])；　　 xm＝0；for i＝1 to tubm do xm＝xm+x[i]；　　 ym＝0；for i＝1 to tubm do ym＝ym+y[i]；　　 lxx＝0；for i＝1 to tubm do lxx＝lxx+x[i]*x[i]；lxx＝lxx-xm*xm/tubm；　　 lxy＝0；for i＝1 to tubm do lxy＝lxy+x[i]*y[i]；lxy＝lxy-xm*ym/tubm；　　 lyy＝0；for i＝1 to tubm do lyy＝lyy+y[i]*y[i]；lyy＝lyy-ym*ym/tubm；　　 Bod＝lxy/lxx； Aod＝ym/tubm-Bod*xm/tubm；　　 Rod＝ky/(sqrt(kx)*sqrt(lyy))；　　 ∥……写回归方程、相关系数到对应组件中　　 CalEu03()；　　 ∥计算各管的内毒素实测值，如回收率、标准方差、变异系数，　　 ∥分别写到表格的对应列中。　　 ∥……按钮操作逻辑控制　　end； end；</pre>样品细菌内毒素含量测定试验指定“终点时间”对某一种批号的试剂，如果适用于终点法进行试验，在数据采集时，实验时间可设置为该批号试剂的终点时间，一般终点时间都小于浊度法试验的实验时间；在数据采集时，指定“终点法”采集数据时间，当试验到达终点时间，试验自动结束。表一
细菌内毒素测定Raw070703-14检测报告——终点法检验日期 2003-7-7_ 检验员 Done 鲎试剂批号 H450L鲎试剂灵敏度 0.06 反应器温度 37.0 BET水批号0301220标准内毒素批号 2002-12 室温26回归方程Lg(Is/Ie)＝-0.0148+1.0544C 相关系数0.9976终点时间47分工作波长405nm

权利要求
1.一种细菌内毒素定量检测的方法——动态终点法，其方法步骤如下①使用凝胶法、终点法、动态比浊法或动态比色法鲎试剂做动态终点法检测细菌内毒素；②确定建立标准曲线所需的标准内毒素浓度，制备至少三个浓度的标准内毒素浓度，分别与鲎试剂在光电检测仪上反应，光电检测仪采集反应数据，通过计算机记录并描绘出各反应的动态曲线；③计算机根据反应动态曲线，自动确定合理的反应终点时间段，并在此时间段内自动搜索出最佳终点时间T0；④利用最佳终点时间T0建立标准曲线，在光电检测仪上进行终点法定量检测样品的内毒素含量。
2.根据权利要求1所述细菌内毒素定量检测方法，其特征在于每批号鲎试剂与特定的系列浓度标准内毒素反应，其最佳终点时间T0是一个固定的值。
3.根据权利要求1所述细菌内毒素定量检测方法，其特征在于阴性对照的内毒素含量要小于标准曲线的最低点浓度。
4.根据权利要求1所述细菌内毒素定量检测方法的计算机程序，包括记录试验试管的序号、名称、样品批号、稀释倍数、标准内毒素等五项参数及光电检测仪读取的透光强度；以数据文件形式将记录的数据保存；打开数据文件，将试验中每个试管的序号、名称、样品批号、稀释倍数及标准内毒素五个参数写入表格前五列；每一个试管的透光强度在对应的二维数组datak[i，j]{试管序号i＝1，2，……，96，采样数据j＝1，2，……，}中，进行数据分析；数据分析的方法选择；搜索最佳终点时间T0；利用最佳终点时间T0进行终点法试验，检测样品内毒素含量。
5.根据权利要求4所述细菌内毒素定量检测方法的计算机程序，其特征在于数据分析的方法选择OD法和RT法。
6.根据权利要求4所述细菌内毒素定量检测方法的计算机程序，其特征在于搜索最佳终点时间包括①终点法分析方法选择A、光密度法(OD)——Is/Ie，随着试验时间的增加，OD值逐渐增大，变化范围在1～1.7之间；OD法的回归方程是Lg(Is/Ie)＝a+bC，C为内毒素浓度，a，b为回归方程系数。B、透光度法(RT)——Ie/Is，随着试验时间的增加，RT值逐渐减小，变化范围在0.3～1之间；RT法的回归方程是Ie/Is＝a+bC，C为内毒素浓度，a，b为回归方程系数；②从表格中取出标准管的序号后，建立标准管数组；③标准管中内毒素浓度值存放在数组X[I]中，计算Lxx＝∑Xi2-(∑Xi)2/n；n为标准管数目，I＝1，2，……，n；④从5分钟开始，每增加1分钟取一组标准管的透光强度数据，计算OD值或RT值到数组Y[i]{OD法Y＝Ig(Is/Ie)，RT法Y＝Ie/Is}中其中Is——初始光强，取稳定期wdq(一般为12个采样周期)之后的三个光强平均值作为初光强；Ie—动态光强，任意采样时间下的透光强度；Dt——采样间隔，5秒或10秒；从数据文件头中取得；⑤计算Lyy＝∑Yi2-(∑Yi)2/n；Lxy＝∑Xi*Yi-(∑Xi)*(∑Yi)/n；n为标准管数目，I＝1，2，……，n；相关系数R＝Lxy/(sqrt(Lxx)*sqrt(Lyy))⑥当相关系数R＞0.9999时，跳出循环，取得此时间为最佳终点时间的参考值；否则取相关系数绝对值最大时的时间作为最佳终点时间的参考值。
7.根据权利要求6所述细菌内毒素定量检测方法的计算机程序，其特征在于确定终点时间①标准管的内毒素浓度在一个数量级、如0.03～0.3，浓度个数应在三个及以上；②最小浓度管的动态曲线已与阴性对照管的动态曲线分开；③最大浓度管的动态曲线尚未进入平坦期。
全文摘要
本发明涉及一种细菌内毒素定量检测方法——动态终点法。该检测方法解决了以往终点法确定重要参数——终点时间的盲目性，使终点时间的选择具有合理性。本发明采用光电检测仪，利用计算机记录描绘出反应动态曲线，搜索出最佳终点时间，然后利用此终点时间进行终点法定量检测样品的内毒素含量。动态终点法不仅适合终点法鲎试剂，也适合动态比浊法或动态比色法试剂。
文档编号G01N21/25GK1529148SQ0314697
公开日2004年9月15日 申请日期2003年9月26日 优先权日2003年9月26日
发明者冯聚锦, 肖洪生, 熊向党 申请人:湛江安度斯生物有限公司