专利名称：检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条。
背景技术：
目前，国内用的双抗原夹心胶体金法检测土拉菌时，常用土拉菌的脂多糖(LPS) 作为检测血清中抗体的抗原。但脂多糖在大量的获取、对环境的污染及操作人员安全等方 面存在缺陷，限制了这些方法的推广和应用。而 ^ορΑ蛋白是一种具有土拉菌共有的特异性 强和保守性好的外膜蛋白，并具有良好的抗原性，可用作检测土拉菌的检测抗原。本实验利用制备的重组抗原，采用间接法的胶体金免疫层析试纸条来检测土拉菌 抗体，并对该方法的特异性、敏感性进行评价。通过对在人血清中掺入土拉菌 ^ορΑ抗体的 模拟样品进行检验，评价该法用于检测土拉菌的可行性。

实用新型内容本实用新型的目的在于提供一种快速定性和定量检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶 体金免疫检测试纸条。为实现上述目的，本实用新型检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸 条，包括反应支撑物、紧密连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端 的上表面与吸水垫部分重叠连接、硝酸纤维膜末端的下表面与金标抗体保护膜部分重叠连 接，金标抗体保护膜的上表面部分重叠连接有样品垫，其中，金标抗体保护膜包括膜本体、 及均勻涂布在其上的胶体金标记的SPA涂层，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置有羊抗兔 IgG包被的质控条带、靠近其末端处设置有重组R)pA蛋白包被的检测条带。进一步，所述反应支持物为PVC板，吸水垫为滤油纸。进一步，所述金标抗体保护膜为玻璃纤维膜、聚脂膜或滤纸纤维。进一步，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚脂膜或滤纸纤维。进一步，所述试纸整体的外部包裹有外壳，该外壳上对应于所述样品垫处设置有 样品孔，外壳上对应于所述质控条带、检测条带处设置有观察窗。本实用新型检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，结合了胶体金标 记和双抗原夹心免疫层析的技术原理，将样品结合垫采用分散剂和封闭剂进行预处理，确 定了最佳反应条件，保证了检测方法的敏感性和特异性，具有操作简单，检测时间短，无需 专业人员，适合快速现场检测等优点。并且，借助于相关设备，可做到定性和定量检测，从而 大大提高了其推广和应用。

图1为本实用新型检测试纸条的目测敏感性图；图2为特异性检测试验图；图3为本实用新型检测试纸条稳定性检测图；[0014]图4为本实用新型检测试纸的拟合直线图；图5A为本实用新型检测试纸的正面示意图；图5B为本实用新型检测试纸的侧面结构示意图；图6A为本实用新型检测试纸的阳性检测结果示意图；图6B为本实用新型检测试纸的阴性检测结果示意图；图6C为本实用新型检测试纸的无效检测结果示意图。
具体实施方式
如图1至图4，图5A、图5B、图6A、图6B、图6C所示，图1是本实用新型检测试纸 条的目测敏感性图。1 阴性对照；2-7 土拉菌抗体浓度M00ng/mL、1200ng/mL、120ng/mL、 60ng/mL、30ng/mL、15ng/mL。图2为特异性检测试验。测试条1-6 :lug/mL的马秋波GP2抗体、天花MlR抗体、 黄热YF-E-D3抗体、禽流感NP抗体、登革病毒Deng-E-D3抗体和普氏立克次体120N抗体图3为本实用新型检测试纸条的目测敏感性图稳定性检测；测试条1 阴性对照， 2 4 土拉菌抗体浓度 120ng/mL、60ng/mL、30ng/mL图5A、图5B中，1 吸水垫；2 硝酸纤维膜，T 包被重组R)pA蛋白检测条带；C 包 被羊抗兔IgG的质控条带；3 含有胶体金标记SPA的玻璃纤维膜；4 样品垫；5 反应支持 物。图6A、图6B、图6C是本实用新型的检测结果示意图；T、C两条线阳性；C 一条线阴
性 ’无效。本实用新型检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，定性检测土拉弗 朗西斯菌抗体灵敏度达到30ng/ml。在模拟样品检测中，检测正常人血清中添加不同浓度土 拉弗朗西斯菌抗体的灵敏度达到到30ng/ml。另外，本实用新型的胶体金免疫层析试纸条在 37°C放置一周后检测发现试纸条的检测敏感性没有下降，显示了良好的稳定性，相当于4°C 存放12个月的效果；与马秋波GP2抗体、天花MlR抗体、黄热YF-E-D3抗体、禽流感NP抗 体、登革病毒Deng-E-D3抗体和普氏立克次体120N抗体等相似毒素没有交叉反应特异性良 好。结合金标分析仪建立了胶体金免疫层法定量检测土拉弗朗西斯菌抗体的工作拟 合曲线，在线性范围内，即R2O. 9905 ；线性范围30 960ng/ml，可以进行定量检测。经检测 发现，该方法回收率高Gl. 0% 118. 6% )、重复性良好。本研究建立的胶体金定量检测方 法可以在15min内完成一定范围内的定量检测，检测时间缩短了 3 4个小时。并且经过 整个检测系统的优化克服了检测血清样品时出现假阳性的现象。本实用新型检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，其中包括将待测 标本与样品稀释液混勻，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用 上行，10-15分钟判读结果；所述检测试纸条包括(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有重组R)PA蛋白和质控抗体的检测条带和质控条带；(4)金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的SPA ；[0032](5)样品垫；其中反应支持物选用PVC板；吸水垫选用滤油纸；硝酸纤维膜上靠近其起始端处 设置有羊抗兔IgG包被的质控条带、靠近其末端处设置有重组R)pA蛋白包被的检测条带。 金标抗体保护膜的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，其上含有胶体金标记的SPA ；样 品垫材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。本实用新型方法所涉及试纸中的所述吸水垫选用滤纸，所述反应支持物选用PVC 板，所述金标抗体保护膜的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，其上均勻涂布有胶体金 标记的抗体。本实用新型方法所涉及试纸中的所述金标抗体保护膜由将胶体金标记的SPA均 勻涂布在聚脂膜、玻璃纤维膜或滤纸纤维膜上来制成。本实用新型检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条的结构为反应支 持物5位于底层，硝酸纤维膜2位于反应支持物5上的中部，硝酸纤维膜2的T处是重组 ^ορΑ蛋白包被的检测条带，C处是羊抗兔IgG包被的质控条带；金标抗体保护膜3位于硝酸 纤维膜2上部的一侧并与之部分重叠，该膜含有胶体金标记的重组土拉弗朗西斯菌抗体； 吸水垫1位于硝酸纤维膜2上部的相对于金标抗体保护膜3而言的另一侧、并与硝酸纤维 膜2部分重叠；样品垫4位于硝酸纤维膜2上与吸水垫1相反的一侧并与金标抗体保护膜 3部分重叠。上述试纸中，吸水垫1 一侧为起始端，金标抗体保护膜3 —侧为末端，检测条带位 于接近末端，质控条带接近于起始端。上述试纸中，重组 ^ορΑ蛋白的浓度为l_5mg/ml，质控羊抗兔I gG的浓度为 0. l_5mg/ml0上述试纸中，羊抗兔IgG抗体浓度优选为0. 5-2. 5mg/ml。上述试纸中，SPA标记Iml胶体金的量为5_6ug。本实用新型检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条的制备方法，该方 法包括(1)用隔流喷金划线机以一定喷膜速度喷涂抗土拉弗朗西斯菌抗体抗体和质控抗 体两个条带的硝酸纤维膜；(2)制备一种含有胶体金标记的SPA的金标抗体保护膜，将胶体金标记的SPA均勻 涂布在玻璃纤维膜上，并烘干或冷冻干燥后，制成金标抗体保护膜。本实用新型所述的制备方法，其中所述喷涂包被膜的步骤中，喷膜速度是 10-100mm/so本实用新型所述的制备方法，其中所述重组R)PA蛋白，其加入量为l_5mg/ml，该 蛋白的稀释液可以为PB。本实用新型所述的制备方法，其中质控羊抗兔IgG的浓度为0. l-5mg/ml。本实用新型所述的制备方法，其中将胶体金标记的SPA均勻涂布在玻璃纤维膜 上，其中PH为6. 4-6.8。本实用新型涉及所述试纸在检测土拉弗朗西斯菌抗体中的应用，其中包括将待测 标本与样品稀释液混勻，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用 上行，10-15分钟判读结果。[0049]本实用新型涉及上述方法制备的检测土拉弗朗西斯菌抗体的试纸。本实用新型所述的方法和产品中使用层析测试条耗材，耗材例如是玻璃纤维的结 合垫，硝酸纤维素膜(例如NC膜，SHF 1350225)，样品垫及吸水垫、滤纸，可购自Minipore 公司。本实用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗体的检测试纸，它还包含金标抗体保护膜。本实用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗体的检测试纸，其中反应支持物选用 PVC 板。本实用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗体的检测试纸，其中吸水垫选用滤纸。本实用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗体的检测试纸，其中金标抗体保护膜选 用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。一、胶体金免疫层析试纸条的制备材料和方法1、抗原及抗体纯化的天然土拉弗朗西斯菌抗体，研究室制备的兔、鼠抗重组相思子A链多克隆 抗体。2、层析测试条耗材结合垫(玻璃纤维)、硝酸纤维素膜(NC膜，SHF 1350225)、样品垫及吸水垫、滤纸 购自Minipore公司。3、实验仪器金标分析仪(中国科学院上海光学精密机械研究所、中国检验检疫科学研究院联 合研制)。4、胶体金免疫层析试纸条的制备4. 1胶体金结合垫将pH值6. 4 6. 8、浓度0. 2mg/ml的SPA标记于柠檬酸钠法制备25nm的胶体金 颗粒的胶体金颗粒，37°C干燥[7]。4. 2硝酸纤维素膜检测带重组R)pA蛋白lmg/ml ；质控带羊抗兔IgG :lmg/ml，37°C干燥。4. 3 组装将样品垫、结合垫、吸水垫依次贴在带有豁合剂的底衬卡，切成0. 4cm的条，干燥， 装壳，室温贮存备用(参见上述文献)。二、样品的定性和定量检测1、模拟样品的处理采用人的血清样品进行检测，用样品处理液进行100倍稀释后作为待检样品 ’另 外，把稀释后的人血清中加入 ^ορΑ抗体同时进行检测。2、定性检测将处理后的样品和样品处理液(作为阴性样品)IOOul加到制备好的层析条样品 垫端，静置15min，观察结果。检测带和质控带均出现红色判为阳性，仅质控带出现红色为阴 性，检测带和质控带均不显色，则为试纸条失效。[0075]3、定量检测3. 1判定值(CUT-OFF)的确定按1.6. 1将阴性样品检测20次，用金标免疫分析仪扫描读取信号T/C比值。20个 样品T/C比值的平均值(AVERAGE)与3倍标准差(STDEVA)之和为CUT-OFF值。3. 2定量检测判定将显色后的金标条放入金标免疫分析仪扫描，读取信号T/C比值，大于判定值为阳性。 三、灵敏度试验[0081] 1、定量检测[0082] 1、定量检测的灵敏度[0083] 检测不同浓度土拉弗朗西斯菌抗体，经过计算判定值(CUT-OFF)为0.002，浓度为 15ng/ml的土拉菌R)pA多抗的平均T/C比值均为0. 001，低于0. 002，为阴性；30 2400ng/ ml 的土拉菌 FopA 多抗的平均 T/C 比值分别为 0. 03,0. 061,0. 122,0. 211,0. 367,0. 627， 高于0. 002的结果为阳性；当土拉菌R)pA多抗浓度大于30ng/ml时，T/C比值平均值大于 0. 002，故检测灵敏度为30ng/ml。 表1 土拉弗朗西斯菌抗体胶体金免疫层析试纸条各浓度检测结果
权利要求1.检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，其特征在于，该试纸条包括反 应支撑物、紧密连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面 与吸水垫部分重叠连接、硝酸纤维膜末端的下表面与金标抗体保护膜部分重叠连接，金标 抗体保护膜的下表面部分重叠连接有样品垫，其中，金标抗体保护膜包括膜本体、及均勻涂 布在其上的胶体金标记的SPA涂层，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置有羊抗兔IgG包被 的质控条带、靠近其末端处设置有重组 ^ορΑ蛋白包被的检测条带。
2.如权利要求1所述的检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，其特征在 于，所述反应支持物为PVC板，吸水垫为滤油纸。
3.如权利要求1所述的检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，其特征在 于，所述金标抗体保护膜为玻璃纤维膜、聚脂膜或滤纸纤维。
4.如权利要求1所述的检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，其特征在 于，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚脂膜或滤纸纤维。
5.如权利要求1所述的检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，其特征在 于，所述试纸整体的外部包裹有外壳，该外壳上对应于所述样品垫处设置有样品孔，外壳上 对应于所述质控条带、检测条带处设置有观察窗。
专利摘要本实用新型公开了一种检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，包括反应支撑物、紧密连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分重叠连接、硝酸纤维膜末端的下表面与金标抗体保护膜部分重叠连接，金标抗体保护膜的下表面部分重叠连接有样品垫，其中，金标抗体保护膜包括膜本体、及均匀涂布在其上的胶体金标记的SPA涂层，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置有羊抗兔IgG包被的质控条带、靠近其末端处设置有重组FopA蛋白包被的检测条带。本实用新型结合了胶体金标记和双抗原夹心免疫层析的技术原理，将样品结合垫采用分散剂和封闭剂进行预处理，具有操作简单，检测时间短，适合快速现场检测等优点。
文档编号G01N33/569GK201903546SQ20102054668
公开日2011年7月20日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者孙肖红, 景滢滢, 杨宇, 杨永莉, 王静, 胡孔新 申请人:中国检验检疫科学研究院