专利名称：99mTc肽基化合物作为骨髓成像剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及骨髓成像中与使用肽基化合物有关的方法和材料。更具体而言，本发明涉及99mTc肽基化合物作为靶向载体的用途，该靶向载体与血管生成相关的受体特别是整联蛋白受体、例如α νβ 3整联蛋白受体结合。因此，这样的造影剂可用于诊断溶血性贫血症、骨髓增生性疾病、骨髓纤维变性、活检部位选择、骨转移的早期检测以及检测股骨头的缺血性坏死。
背景技术：
新血管可通过两种不同机制形成血管发生(vasculogenesis)或血管生成 (angiogenesis).血管生成是通过从存在的血管分支形成新血管。这一过程的初次刺激可能是提供给组织中细胞的营养物和氧(低氧)不够。细胞可通过分泌许多血管生成因子发生应答；一个经常涉及的实例是血管内皮生长因子(VEGF)。这些因子启动分解基膜蛋白的蛋白水解酶的分泌，也启动限制这些潜在有害酶作用的抑制剂的分泌。血管生成因子的另一个突出作用是引起内皮细胞迁移和分裂。附着于基膜的内皮细胞不经历有丝分裂，所述基膜在逆腔侧(contralumenal side)环绕血管形成连续的层。受体失去血管生成因子的附着及其信号的联合后果是引起内皮细胞移动、繁殖和其自身重排，并最终合成环绕新血管的基膜。在组织生长和重建包括伤口愈合和炎症过程中，血管生成显著。当肿瘤达到毫米大小时必须启动血管生成以维持其生长速度。血管生成伴随在内皮细胞及其环境的特征变化。除了参与影响和控制蛋白质水解的蛋白发生变化以外，还有这些细胞表面经过重建来为迁移作准备，并且在基膜降解处隐藏结构被暴露出来。在肿瘤的情况下，产生的血管网络常常是紊乱的，伴随有急剧扭结(sharp kink)形成并且动静脉分流。血管发生的抑制被认为是用于抗肿瘤治疗的有前景的策略。伴随血管发生的变形(transformation)对诊断而言也十分有前景，一个显而易见的实例是诊断恶性病，而且这一概念在炎症和许多炎症相关的疾病包括动脉粥样硬化中也表现出极大的前景，早期动脉粥样硬化病变的巨噬细胞是血管生成因子的潜在来源。这些因子也参与到心肌的梗塞部分的血管再形成中，当短时间内狭窄释放时该血管再形成发生。与新血管形成或血管生成、新血管的发育或增殖相关的不期望病症的进一步实例在下文中出示。在这一点上也作出了对WO 98/47541的引用。与血管生成相关的疾病和适应症是例如不同形式的癌症和转移，例如乳腺癌、皮肤癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌或卵巢癌。其他疾病和适应症是炎症(例如慢性炎症)、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和龈炎。此外的与血管生成相关的疾病和适应症是动静脉畸形、星形细胞瘤、绒毛膜癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、血管瘤(儿童期血管瘤，毛细血管血管瘤)、肝癌、子宫内膜增生、 心肌局部缺血、子宫内膜异位、卡波济氏瘤、黄斑变性、黑素瘤、成神经细胞瘤、闭塞性外周动脉病、骨关节炎、牛皮癣、视网膜病(糖尿病视网膜病，增生性视网膜病)、硬皮病、精原细胞瘤和溃疡性结肠炎。血管生成涉及内皮细胞和外围组织独特的受体。这些标记包括生长因子受体例如VEGF和整联蛋白家族受体。免疫组织化学研究表明多种整联蛋白(可能最重要的是αν 类)在血管的顶面表达[Conforti，G等(19^)Blood 80 :37-446]并且适合被循环配体靶向[Pasqualini，R等(1997)Nature Biotechnology 15 :542-546]。α 5β 1 也是一种促进纤连蛋白基质装配并启动细胞附着于纤连蛋白的重要整联蛋白。它在细胞迁移[Bauer，J. S.， (1992) J. Cell Biol. 116 :477-487]以及肿瘤侵入和转移中[Gehlsen，K. R.，(1988) J. Cell Biol. 106 :925-930]也起着关键的作用。整联蛋白α νβ3是已知与血管生成相关的受体之一。在血管生成过程临界期，受刺激的内皮细胞似乎依赖于该受体而存活，因为α νβ 3整联蛋白受体/配体相互作用的拮抗剂诱导细胞程序性死亡并抑制血管生长。整联蛋白是异源二聚体分子，其中α和β亚基穿过细胞膜脂双分子层膜。α亚基在其胞外链上具有四个Ca2+结合结构域，而β亚基具有许多胞外半胱氨酸富集结构域。参与细胞粘着作用的许多配体(例如纤连蛋白)含有三肽序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)。RGD序列似乎充当该序列所在的配体与细胞表面受体之间的初级识别位点。普遍认为配体和受体的次级相互作用(secondary interation)增强相互作用的特异性。这些次级相互作用可能发生在与RGD序列直接相邻的配体部分和受体部分之间， 或者发生在远离RGD序列的位点处。已知RGD肽与很多整联蛋白受体结合，并具有调节临床环境中许多重要应用的细胞事件的潜力(Ruoslahti，J. Clin. Invest. ,87 :1_5 (1991)。可能研究最广泛的RGD肽及其模拟物的作用涉及其作为抗凝血剂的用途，这种情况下其靶向血小板整联蛋白GpIIbllla。通过给予α ν β 3或α ν β 5拮抗剂抑制组织中的血管生成业已在例如利用抗体或含RGD的肽的WO 97/06791和WO 95/25543中描述。EP 578083描述了一系列单环的含RGD 肽，而 WO 90/14103 要求保护 RGD 抗体。Haubner 等人在 J. Nucl. Med. (1999) ；40 :1061-1071 中描述了一类新的基于单环含RGD肽的肿瘤靶向示踪物。然而，利用全身放射自显影成像的生物分布研究显示用125I标记的肽血液清除率非常快并且主要是肝胆排泄途径导致高背
旦
ο在WO 98/54347和WO 95/14714中也描述了包含多个桥的环状R⑶肽。来源于体内生物淘选的肽(W0 97/10507)用于多种靶向作用的应用。序列⑶CRGDCFC(RGD-4C)用于使药物例如多柔比星(W0 98/10795)、核酸和腺病毒(参见WO 99/40214，WO 99/39734, WO 98/54347，WO 98/54346, US 5846782)靶向细胞。然而含多个半胱氨酸残基的肽背负着可能存在多个二硫化物异构体的缺点。有4个半胱氨酸残基的肽例如RGD-4C可能形成3种不同二硫化物折叠构型。因为RGD药效团被迫形成为3种不同构象，所以异构体将对整联蛋白受体具有不同的亲和力。在PCT/N001/00146和PCT/N001/00390中找到包含基于含RGD肽的化合物的进一
步实例，其内容通过引用结合到了本文中。然而，存在通过提供正发挥作用的骨髓的整体纵览(total body view)来克服骨髓取样误差的评估骨髓的需要。骨髓抽吸和活检是评估骨髓的已知技术，但是这种评估限于整个造血器官的小部分。放射性核素骨髓成像是通过提供正发挥作用的骨髓的整体纵览来克服骨髓取样误差的简单技术。通过利用99mTc肽基化合物作为靶向载体，该靶向载体与血管生成相关的受体特别是整联蛋白受体、例如α νβ 3整联蛋白受体结合，本发明估计了评估骨髓的需要。发明概述本申请提供了骨髓成像中与使用肽基化合物有关的方法和材料。如本文所述， α νβ 3整联蛋白受体在骨髓上的表达可通过提供正发挥作用的骨髓的全面和完全的整体纵览来克服骨髓取样误差。骨髓抽吸和活检是评估骨髓的优异技术，但是该评估限于整个造血器官的小部分。放射性核素骨髓成像是通过提供正发挥作用的骨髓的整体纵览来克服骨髓取样误差的简单技术。此外，该方法是非侵入性的且提供了评估多种临床问题的无创伤方法，这些临床问题包括骨髓组织学和临床状态之间的差异(可能的骨髓取样误差)、当考虑进一步治疗时在放疗和化疗后活性骨髓量的确定、髓外红细胞生成部位的检测、骨髓活检最佳部位的定位、弥漫性血液学疾病的诊断和分级、转移的检测、溶血性贫血症中骨髓梗塞的诊断以及检测股骨头的缺血性坏死。存在两大类骨髓剂(bone marrow agents)，结合到红细胞前体如放射性铁中的那些，以及被网状内皮组织系统(reticuloendothelial system,RES)摄取的胶体。本发明涉及红细胞前体如放射性铁，原因是99mTc肽基化合物并非基于白蛋白，因此与99mTc-白蛋白纳米胶体相比该产物具有更广泛的用途。此外，99mTc-NC100692的体内特性提供了优于该骨髓成像放射性药物的成像性质。除非另有规定，否则本文中所用的所有科技术语具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。发明详述骨髓的放射性核素成像可用于使发生在溶血性贫血、骨髓增生性疾病或骨髓纤维变性中的骨髓分布缺陷、非均勻骨髓分布或活性骨髓膨胀成长骨可见。骨髓成像还有助于活检部位的选择以及骨转移的早期检测。本申请提供了骨髓成像中与使用肽基化合物有关的方法和材料。如本文所述， α νβ 3整联蛋白多肽在骨髓上的表达可通过提供正发挥作用的骨髓的全面和完全的整体纵览来帮助克服骨髓取样误差。本发明涉及99mTc肽基化合物作为靶向载体的用途，该靶向载体与血管生成相关的受体特别是整联蛋白受体、例如α νβ 3整联蛋白受体结合。因此，这样的造影剂可用于诊断溶血性贫血症、骨髓增生性疾病、骨髓纤维变性、活检部位的选择、骨转移的早期检测以及检测股骨头的缺血性坏死。可使用任何方法确定α νβ 3整联蛋白多肽是否在骨髓上表达。例如，骨髓组织可与某种分子接触，该分子结合到表达α νβ 3整联蛋白多肽的细胞。这种分子与骨髓组织的结合水平是可以检测的。存在与该组织结合的分子可表明该组织具有α νβ 3整联蛋白多肽。不存在与该组织结合的分子或存在几乎不可检测水平的与该组织结合的分子可表明该组织不表达α νβ 3整联蛋白多肽或低水平地表达α νβ 3整联蛋白多肽。α νβ 3整联蛋白多肽可为具有α ν和β 3多肽亚基的整联蛋白多肽。整联蛋白α ν多肽的实例包括人整联蛋白α ν多肽(例如以GenBank GI nos. gi4504763或
5gi466372提出的人整联蛋白^￥多肽)。整联蛋白β 3多肽的实例包括人整联蛋白α ν多肽(例如以GenBank GI nos. gi541M349或gi386833human提出的整联蛋白3 3多肽)。 整联蛋白αν和β3多肽的实例还包括整联蛋白αν和β3多肽的变体以及整联蛋白αν 和β 3多肽的同系物和直向同源物。与具有α νβ 3整联蛋白多肽的细胞结合且当与细胞上的α νβ 3整联蛋白多肽结合时可被检测的任何分子可用于评价骨髓上α νβ 3整联蛋白多肽的存在、不存在或低水平。例如，RGD肽、小分子α νβ 3整联蛋白拮抗剂、凝集素或抗-α νβ 3整联蛋白抗体可用于确定α νβ 3整联蛋白多肽是否通过骨髓表达。RDG肽可为包含精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸氨基酸序列的任何多肽。RGD肽的实例包括但不限于 99mTc-NC100692 (Mousa, J. Cardiovasc. Pharmacol. 45 :462 (2005)。RGD 月太可为单体多肽或多聚体(例如二聚体)多肽。RGD肽也可为环状的，且可被稳定化(例如通过二硫键)。此外，RGD肽可经修饰以被聚乙二醇化或共价连接到低聚物，例如短链两亲性低聚物，以便口服给药或提高缀合的RGD肽的药物动力学或药效特性。所述低聚物可包含水溶性聚乙二醇(PEG)和脂溶性链烃基化合物(alkyls)。抗体可为但不限于单克隆、多克隆、人、人源化嵌合或单链抗体，以及具有结合活性的抗体片段。抗体可为任何型(type) (IgG、IgM、IgD或IgY)、类(class) (IgG4或IgA2) 或子类抗体。此外，抗体可为人、兔、绵羊或山羊抗体。抗体可为天然存在的、重组的或合成的。抗体可使用本领域已知的任何适合方法产生或纯化。可标记与具有ανβ3整联蛋白多肽的细胞结合的分子以便检测。能与具有 α νβ 3整联蛋白多肽的细胞结合的分子还可间接地使用与具有α νβ 3整联蛋白多肽的细胞结合的标记分子检测。可使用任何方法确定分子是否与表达α νβ 3整联蛋白多肽的细胞结合。此外，一种方法可用于确定表示骨髓细胞或组织的α νβ 3整联蛋白多肽表达水平。本申请提供了用于帮助医药专业人员或研究专业确定骨髓组织是否损坏的方法和材料。医药专业人员可为但不限于医生、护士、医药实验室技术人员和药剂师。研究专业人员可为但不限于研究者、研究技师、博士后受训人员和研究生。任何适合的方法用于将信息告知另外人士(专业人员)。当在受试者骨髓中发现α νβ 3整联蛋白多肽，则这是异常的指示。或者，当受试者骨髓中α νβ 3的量高于痕量，则为异常。如果在骨髓组织或细胞中α νβ 3整联蛋白多肽的表达值无明显意义，则认为正常。本发明的一个实施方案描述了用于评价骨髓组织中的异常的方法，所述方法包括确定所述骨髓组织或细胞是否表达α νβ 3整联蛋白多肽，其中表达所述α νβ 3整联蛋白多肽表明所述骨髓是异常的，且其中几乎不表达或不表达α νβ 3整联蛋白多肽表明所述骨髓是正常的。本发明的另一种方法提出骨髓组织为人骨髓组织。术语“组织”涵盖出于本文目的的哺乳动物或人的细胞。本发明进一步公开了一种方法，其中所述确定步骤包括使骨髓组织与具有结合所述α νβ 3整联蛋白多肽能力的标记分子接触。本发明的又一实施方案包括一种方法，其中所述标记分子为抗体。
再一实施方案包括一种方法，其中所述标记分子为R⑶肽，且进一步其中所述标记分子为 99mTc-NC-100692。另一实施方案包括一种方法，其中将所述标记分子给予具有骨髓组织的哺乳动物。本发明的再一实施方案提出了一种评估骨髓组织的方法，所述方法包括确定所述骨髓组织是否缺乏表达α νβ 3整联蛋白多肽，其中缺乏表达所述α νβ 3整联蛋白多肽表明所述骨髓组织是正常的。另一实施方案包括一种方法，其中所述骨髓组织为人骨髓组织。本发明的再一实施方案包括一种方法，其中所述确定步骤包括使所述骨髓组织的组织与具有结合所述α νβ 3整联蛋白多肽能力的标记分子接触。本发明的又一实施方案公开了标记分子为抗体，进一步其中所述标记分子为RGD 肽，且进一步其中所述RGD肽为99mTc-NC-100692。本发明的另一实施方案为一种方法，其中将所述标记分子给予具有骨髓组织的哺乳动物。将进一步通过以下非限定性实施例说明本发明。 实施例实施例1 在临床研究中检测缺陷性骨髓组织进行以下临床研究以验证使用α νβ 3整联蛋白表达采区分正常骨髓和缺陷性骨髓的提高的灵敏度和特异性。主要目的(primary endpoint)是诊断准确性。从主动的病人群中募集病人。管理算法通常基于临床经验、放射特性(radiologic appearance)、特性改变速率和病人喜好。存在许多其他试验用于帮助引导管理，包括CT造影增强、骨髓抽吸、 活检和放射性核素骨髓成像。受试者为待评估骨髓异常的病人。征得同意后，将受试者随机分成两个研究小组 一个小组未进行干预(通常的医生护理)，另一个小组使用临床实践但包括测试ανβ3整联蛋白表达。α νβ 3整联蛋白表达试验的诊断准确性通过遵循这些分组直到获得骨髓诊断结果来确定。图像分析由三名有经验的放射科医师中的一位进行。他们并不知晓受试者的临床病史和其他试验结果。与通过常规护理处理的骨髓的最终诊断结果比较来评估诊断准确性。计算敏感性、特异性以及正或负预测值。具体实施方案，引用文献本发明的范围不限于本文所述的特定实施方案。实际上，根据以上说明书和附图
， 除本文所述实施方案之外的本发明的各种实施方案对于本领域技术人员而言是显而易见的。这种改进意欲落入随附权利要求的范围内。本文中引用了各种出版物和专利申请，其公开内容通过全文引用结合到本文中。
权利要求
1.一种评估骨髓组织中的异常的方法，所述方法包括确定所述骨髓组织或细胞是否表达ανβ3整联蛋白多肽，其中表达所述ανβ3整联蛋白多肽表明所述骨髓是异常的，且其中几乎不表达或不表达α νβ 3整联蛋白多肽表明所述骨髓是正常的。
2.权利要求1的方法，其中所述骨髓组织为人骨髓组织。
3.权利要求1的方法，其中所述确定步骤包括使骨髓组织与具有结合所述ανβ 3整联蛋白多肽能力的标记分子接触。
4.权利要求3的方法，其中所述标记分子为抗体。
5.权利要求3的方法，其中所述标记分子为RGD肽。
6.权利要求3的方法，其中所述标记分子为99mTc-NC-100692。
7.权利要求3的方法，其中将所述标记分子给予具有骨髓组织的哺乳动物。
8.一种评估骨髓组织的方法，所述方法包括确定所述骨髓组织是否缺乏表达ανβ3 整联蛋白多肽，其中缺乏表达所述α νβ 3整联蛋白多肽表明所述骨髓组织是正常的。
9.权利要求8的方法，其中所述骨髓组织为人骨髓组织。
10.权利要求8的方法，其中所述确定步骤包括使所述骨髓组织的组织与具有结合所述α νβ 3整联蛋白多肽能力的标记分子接触。
11.权利要求10的方法，其中所述标记分子为抗体。
12.权利要求10的方法，其中所述标记分子为RGD肽。
13.权利要求10的方法，其中所述标记分子为99mTc-NC-100692。
14.权利要求10的方法，其中将所述标记分子给予具有骨髓组织的哺乳动物。
全文摘要
本发明涉及骨髓成像中与使用肽基化合物有关的方法和材料。更具体而言，本发明涉及99mTc肽基化合物作为靶向载体的用途，该靶向载体与血管生成相关的受体特别是整联蛋白受体、例如αvβ3整联蛋白受体结合。因此，这样的造影剂可用于诊断溶血性贫血症、骨髓增生性疾病、骨髓纤维变性、活检部位选择、骨转移的早期检测以及检测股骨头的缺血性坏死。
文档编号G01N33/574GK102265158SQ200980152816
公开日2011年11月30日 申请日期2009年12月15日 优先权日2008年12月23日
发明者B·麦帕兰, J·祖贝尔迪亚, P·埃文斯 申请人:通用电气健康护理有限公司