专利名称：海水中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法
技术领域：
本发明涉及一种脂溶性贝类毒素的检测方法，特别是一种海水中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法。
背景技术：
海洋生物毒素(贝类毒素)特指主要由海洋有毒微藻或微生物产生、能够在海洋生物尤其是双壳贝类中富集的、对其他生物包括人类产生危害的一大类小分子有毒化学物质。针对这些生物毒素，研究者初期主要根据所引起的中毒症状将其分为六大类麻痹性贝类毒素(Paralytic Shellfish Poisoning, PSP)、腹湾性贝类毒素(DiarrheticShellfish Poisoning, DSP)、神经性贝类毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning, NSP)、记忆缺失性贝类毒素(Amnesic Shellfish Poisoning,ASP)、西加鱼毒素(Ciguatera FishPoisoning, CFP)、蓝绿藻毒素。不过随着研究的深入，新的生物毒素种类不断被发现，且多种毒素如OA往往与毒素AZA和PTX伴生而成，但具有不同的致毒机理，原有分类方法已不能满足管理和科研的需求。因此，2004年，由联合国粮农组织、世界卫生组织和政府间海洋委员会共同组建的双壳类软体生物毒素工作组将贝类毒素分为八大类，分别为石房蛤毒素组(Saxitoxin, STX)、软骨藻酸组(Domoic acid, DA)、大田软海绵酸毒素组(Okadaicacid, 0A)、原多甲酸毒素组(Azaspiracid, AZA)、短裸甲藻毒素组(Brevetoxin, BTX)、蛤毒素组(Pecenotoxins, PTX)、奸夷扇贝毒素组(Yessotoxin, YTX)和环亚胺类毒素(Cyclicimines’CIs)。除此之外，水螅毒素(Palytoxins,P1TX)和西加鱼毒素(Ciguatoxins,CTX)也正在被考虑是否划作贝类毒素中。现有8大类贝类毒素中，STX和DA毒素组较易溶解于水，比较而言0A、AZA> BTX、PTX、YTX、CIs均为聚醚类物质，具热稳定性，易溶解于甲醇、乙醚等非极性有机试剂中，因此被统一称作为脂溶性贝类毒素(lipophilic phycotoxins，LPs)。贝类毒素的严重危害性已引起多个国家的密切关注，以欧美加等为首的发达国家相继制定了贝类毒素监控国家计划。传统的监控方法主要是定期对相关海域中的双壳贝类进行贝类毒素的含量及产毒藻种类和数量进行监测，以评估贝类毒素的风险性，对保护消费者安全，确保贝类产业健康发展做出了积极贡献。然而，传统手段需要采集大量的贝类和藻类样品才能对贝类毒素做出有效预警，不仅耗费大量的人力物力，而且时效性不强。2004年，MacKenzie等人首次报道了一种固相吸附毒素追踪技术(Solid phase adsorption toxin tracking, SPATT),主要是利用特异性吸附材料对目标毒素进行吸附，然后实验室内洗脱、浓缩和净化后经LC-MS检测。SPATT技术与传统方法相比，不仅大量减少采样分析工作量，而且还可以监控目标海域不同水层贝类毒素的变化，同时结合贝类中毒素和有毒藻的变化情况，对贝类毒素有早期预警作用，具有很大的发展前景。现有的检测技术主要还是小鼠生物法，存在动物福利以及检出限高且不能明确辨析贝毒成分等问题，虽然质谱检测技术也已开始用于贝类毒素的检测，但检测种类比较单一，或前处理方法尚需进一步完善。因此建立一种快速、灵敏、准确的多种脂溶性贝类毒素同时检测方法变得尤为重要。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种针对性强、操作简单、检测速度快、检测面广、降低了测试成本、易于推广应用的海水中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法。本发明是通过以下 的技术方案来实现的。一种海水中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法，包括吸附袋的制作、吸附袋的使用、毒素萃取、测定条件与方式、定性测定和定量测定，具体步骤如下(I)吸附袋的制作用聚酯网布，缝制成布袋，装入树脂之后密封，在正方形布袋的一角固定尼龙挂扣，把吸附袋在甲醇中浸泡，然后用蒸馏水浸泡去除甲醇，随即放入密封的塑料袋中，在4°C条件下短时间保存，待用；(2)吸附袋的使用把吸附袋系在长绳上，分上、中、下三层，层间隔至少超过5米以上，否则相应减少层数，每层一次固定3个及以上吸附袋，将绳系于固定位置的漂浮杆上，每间隔7-10天将吸附袋取出，再放入新的吸附袋，提取的吸附袋用蒸馏水冲洗，放入预先编号的塑料袋中，在4°C条件下短时间保存；(3)毒素萃取将树脂填料转入沙芯滤柱中，用50_70mL去离子水洗去盐分，把柱中水份正压吹干，加入20mL甲醇，滤入蒸发瓶中，再加入20mL甲醇重复提取一次，提取液在40°C使甲醇挥发，残余l_2mL水，用5mL 二氯甲烷萃取后离心，取出二氯甲烷层，再用5mL 二氯甲烷重复萃取一次，合并两次二氯甲烷萃取层后用氮吹干，用l.OmL 80%的甲醇定容，以O. 22 μ m的滤膜过滤，进样高效液相色谱-串联质谱分析；(4)测定条件与方式待测样品用液相色谱-串联四极杆质谱进行测定，仪器参数条件见表1，选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2 ；表I液相色谱-串联四极杆质谱的仪器参数条件
权利要求
1.一种海水中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法，包括吸附袋的制作、吸附袋的使用、毒素萃取、测定条件与方式、定性测定和定量测定，其特征在于具体步骤如下 (1)吸附袋的制作用聚酯网布，缝制成布袋，装入树脂之后密封，在正方形布袋的一角固定尼龙挂扣，把吸附袋在甲醇中浸泡，然后用蒸馏水浸泡去除甲醇，随即放入密封的塑料袋中，在4°C条件下短时间保存，待用； (2)吸附袋的使用把吸附袋系在长绳上，分上、中、下三层，层间隔至少超过5米以上，否则相应减少层数，每层一次固定3个及以上吸附袋，将绳系于固定位置的漂浮杆上，每间隔7-10天将吸附袋取出，再放入新的吸附袋，提取的吸附袋用蒸馏水冲洗，放入预先编号的塑料袋中，在4°C条件下短时间保存； (3)毒素萃取将树脂填料转入沙芯滤柱中，用50-70mL去离子水洗去盐分，把柱中水份正压吹干，加入20mL甲醇，滤入蒸发瓶中，再加入20mL甲醇重复提取一次，提取液在40°C使甲醇挥发，残余l_2mL水，用5mL 二氯甲烷萃取后离心，取出二氯甲烷层，再5mL 二氯甲烷重复萃取一次，合并两次二氯甲烷萃取层后用氮吹干，用l.OmL 80%的甲醇定容，以O.22 μ m的滤膜过滤，进样高效液相色谱-串联质谱分析； (4)测定条件与方式待测样品用液相色谱-串联四极杆质谱进行测定，仪器参数条件见表1，选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2 ； 表I液相色谱-串联四极杆质谱的仪器参数条件
全文摘要
一种海水中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法，包括吸附袋的制作、吸附袋的使用、毒素萃取、测定条件与方式、定性测定和定量测定。本发明检测方法采用树脂主动吸附海水中的贝类毒素，且可对海水不同分层进行特异性吸附，后经过萃取步骤分析海水中16种脂溶性贝类毒素的检测。且与传统方法相比，采样量少，降低成本，操作简单方便，稳定性强。
文档编号G01N30/06GK102928529SQ20121038845
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月15日 优先权日2012年10月15日
发明者谭志军, 吴海燕, 郭萌萌, 李兆新, 王联珠, 翟毓秀 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所