专利名称：妇女体液样品中涉及存在唾液酸酶或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的病理风险确定的酶检验方法
技术领域：
本发明描述了用于妇女体液样品中涉及唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的病理风险的评价方法。
特别地，本发明提供的方法用于定性和定量地确定病理风险，所述病理如低出生体重(LBW)，早产(PTD)，膜早期破裂，羊膜内感染，自然流产，子宫内膜炎，分娩后感染或者妇科手术术后感染，上生殖道感染(PID)，这些病理风险可引起不育症，宫颈炎，对乳头瘤病毒(HPV)和人免疫缺陷病毒(HIV)引起的病毒感染的性传播疾病易感性，HIV感染的垂直传播。
主要由早产(PTD)引起的低出生体重(LWB)是导致新生儿发病、死亡和长期婴儿神经障碍的主要风险因子。
对于大部分的低出生体重病例还未得到公认的因果因子，这使得目前的预防方案不够有效。然而一些研究已经表明细菌性阴道病(BV)与早产(PTD)、低体重婴儿的早产、前期和后期流产有关系，并且通常与母系并发症有关，与未患有BV情况相比，相关风险可从1.4倍增加到6.9倍。另外近年来细菌性阴道病与性获得HIV病毒感染和垂直母婴HIV传播的风险增高有关。细菌性阴道病在西欧未妊娠妇女中的发病率为约10％，在西欧妊娠妇女中的发病率为约15％，在美国妊娠妇女中的发病率为10-30％，在非洲血统有色人种妇女中的发病率超过30％，在就诊于性传播疾病门诊的妇女中的发病率超过60％。总之，值得注意的是在暴露于HIV病毒增高的风险的个体中，患有BV的妇女中只有一小部分会产生不利妊娠后果或者获得HIV感染，因此需要一种选择性指示剂用于对处于增高的风险并需要治疗的患者的个体化。
细菌性阴道病是由不同菌种引起的，这些菌种包括阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)，拟杆菌属菌种(Bacteroides spp.)，普雷沃氏菌属菌种(Prevotella spp.)和动弯杆菌属菌种(Mobiluncus spp.)，解脲脲枝原体(Ureaplasma urealyticum)和人枝原体(Mycoplasmahominis)。细菌性阴道病的发病机理仍不清楚，并且这种病理条件的存在经常不易被诊断。
特别地，还不知道是什么引发了从正常乳酸杆菌集群到变化的阴道菌群的转变，也还不知道阴道微生物菌群变化的何种程度才是真正病理状况的指标。
细菌性阴道病的一个至关重要的论点是阴道加德纳氏菌与厌氧菌的协同作用。
在95％以上的细菌性阴道病病例中发现高滴定度的阴道加德纳氏菌，而在未患有细菌性阴道病的妇女中也发现低滴定度的阴道加德纳氏菌。
然而已经论证了阴道加德纳氏菌集群和细菌性阴道病状况之间的严格相关性。
唯一被全部定性的由阴道加德纳氏菌释放的毒力因子为β-溶血毒素(Gvh)，其分子量为约59,000道尔顿。
此外，研究已显示约半数未妊娠妇女对Gvh产生免疫应答，在阴道粘膜水平产生IgA抗体。患有BV的妇女不产生抗Gvh IgA抗体主要由于IgA的失活，且这种现象与高的阴道唾液酸酶活性水平有关。这种失活源自IgA结构的被破坏，这种结构的被破怀可能是由厌氧菌释放的一群因子的水解作用所导致。
目前还未知在患有细菌性阴道病的妇女亚群中，抗微生物宿主防御的哪些因子是妥协的，或者哪些毒力因子激发了IgA的裂解。
首先，还未知这种状况是否与BV并发症的增高的风险有关。
这种不确定定义使得临床医生面对的问题为是否对患有细菌性阴道病的妇女实施药理学治疗。已知有两种不同的药物用于治疗细菌性阴道病甲硝唑和克林霉素。这两种药物的主要缺点在于其副作用，尤其是甲硝唑能引起胃肠综合症，并且被认为是致畸剂，因此不推荐用于妊娠期，另外克林霉素能引起腹泻和可能致命的假膜性结肠炎。另外这两种药物都能引起酵母菌性阴道炎。
基于以上原因，非常需要开发出一种方法用于确定病理并发症风险，所述病理并发症如低出生体重(LBW)，早产(PTD)，自然流产，膜早期破裂，子宫内膜炎，获得性HIV感染，获得性HPV感染(其可导致子宫颈上皮内瘤形成)，上生殖道感染(PID)，分娩后感染或者妇科手术术后感染。
本发明提供一种可靠方法，通过为医生配备一种有价值的工具用于决定是否实施药理学治疗，以解决上述并发症风险的确定问题。
通过主要权利要求所描述的病理风险的确定方法解决了这个问题。
本发明方法的进一步的特征和先进性会通过随后的优选实施例的描述变得更加突出，这些特征和先进性是在指示性的描述中给出的，但不限于这些描述。
为建立本发明的方法，对临床病例进行了研究并且与不具有公认的病理状况的妇女对照组进行了比较。
特别地，对116名生产低出生体重婴儿(LBW)的妇女，86名发生早产(PTD)的妇女和417名妊娠期间具有正常体重婴儿(NTD)的妇女进行了检查。
检查了所有这些妇女阴道液样品中的唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶的活性，此外对所述唾液酸酶和氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平进行了评价。
唾液酸酶是由细菌产生的酶，并且出现在几种疾病的发病机理中。这些酶激发包括IgA的各种糖蛋白的唾液酸酶的水解，改变免疫应答。
氨酰基脯氨酸二酞酶是由细菌产生的利于细胞浸润的蛋白水解酶。这些酶可激活细胞因子和其它免疫介质。
唾液酸酶活性的确定是通过将50μl阴道液样品与50μl的底物在pH5.0进行培养，使用方法见Cauci等人，美国妇科学杂志(Am JObstat Gynecol)，1998；178511-515页的描述。用底物转化产生的毫微摩尔甲氧苯酚表示具体活性，并对照纯甲氧苯酚标准曲线进行计算。唾液酸酶活性水平的评价如下低于0.19nmol甲氧苯酚的值为无活性，等于或者大于0.19nmol甲氧苯酚的值为+1截断值，等于或者大于0.38nmol甲氧苯酚的值为+2截断值，等于或者大于2.50nmol甲氧苯酚的值为+3截断值，等于或者大于5.0nmol甲氧苯酚的值为+4截断值。
氨酰基脯氨酸二酞酶活性的确定方法见Cauci等人，传染病杂志(J Infect Dis)，1998；1781698-1706页的描述。氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平的评价如下低于22mOD值为无活性，等于或者大于22mOD值为+1截断值，等于或者大于44mOD值为+2截断值，等于或者大于1000mOD值为+3截断值，等于或者大于2000mOD值为+4截断值。
使用健康对照人群(没有任何一种阴道症状和除了乳酸杆菌以外的微生物阴道集群)中测得的平均值加上一个标准偏差计算唾液酸酶和氨酰基脯氨酸二酞酶活性的+1截断值。对+1截断值加倍得到+2截断值。对+4截断值减半得到+3截断值。
特别地，为建立本发明的方法，所述唾液酸酶和氨酰基脯氨酸二酞酶活性与LBW和PTD有关。
下面表1显示的分析数据分别为生产低出生体重婴儿(LBW)，早产(PTD)或者正常足月分娩(NTD，对照组)妇女的百分数，粗体数据表示LBW或者PTD妇女的百分数与NTD妇女的百分数的比值(让步比，OR)。使用SPSS计算机统计程序对此值进行计算和用标准因子进行修正。
特别地，阴道液样品的获得取自妇女妊娠期的前3个月和第4-6月，并且优选妊娠期的第7整周到第24整周。
按照以下标准这些组妇女被进一步分组，阴道液样品中单独唾液酸酶的活性，单独氨酰基脯氨酸二酞酶的活性，这些酶的活性并且pH≥4.7，这些酶的活性和细菌性阴道病(BV)的病理状况，或者这些酶的活性和阴道加德纳氏菌细菌。
表1阳性％OR测量参数 NTD LBW PTD和/或阴道集群n＝417 n＝116 n＝86唾液酸酶活性≥+1 15.3 28.7 2.220.01.4≥+2 10.3 18.3 1.911.81.2≥+3 3.8 7.8 2.14.7 1.2≥+4 1.0 3.5 3.72.4 2.5氨酰基脯氨酸二酞酶活性≥+1 33.7 41.6 1.434.91.1≥+2 26.0 37.2 1.724.10.9≥+3 3.9 7.1 1.96.0 1.6≥+4 1.0 4.4 4.83.6 3.9pH≥4.7 30.5 37.1 1.332.61.1pH≥4.7和唾液酸酶活性≥+1 9.8 19.0 2.011.61.2≥+2 7.9 13.8 1.810.51.4≥+3 3.8 7.8 2.14.7 1.2≥+4 1.0 3.4 3.62.3 2.4pH≥4.7和氨酰基脯氨酸二酞酶活性≥+1 20.9 31.0 1.625.61.3≥+2 18.5 30.2 1.720.91.2≥+3 3.6 6.0 1.84.7 1.4≥+4 0.7 3.4 5.12.3 3.5BV 14.6 20.7 1.512.80.9BV和唾液酸酶活性≥+1 9.1 15.7 1.97.1 0.8≥+2 7.4 12.2 1.77.1 0.9≥+3 3.8 7.8 2.14.7 1.2≥+4 1.0 3.5 3.72.4 2.5BV和氨酰基脯氨酸二酞酶活性≥+1 13.5 18.6 1.512.00.9≥+2 13.0 18.6 1.510.80.8≥+3 2.7 3.5 1.32.4 0.9≥+4 0.2 2.7 11.3 1.2 5.0阴道加德纳氏菌 36.2 42.2 1.336.01.0阴道加德纳氏菌和唾液酸酶活性≥+1 11.0 18.3 1.811.81.1≥+2 8.2 13.0 1.79.4 1.2≥+3 3.8 7.8 2.14.7 1.3≥+4 1.0 3.5 3.72.4 2.5阴道加德纳氏菌和氨酰基脯氨酸二酞酶活性≥+1 23.4 31.0 1.526.51.2≥+2 21.0 30.1 1.722.91.1≥+3 3.6 7.1 2.06.0 1.7≥+4 0.7 4.4 6.43.6 5.2
表1显示的主要结果为OR值，因为OR代表低出生体重(LBW)或者早产(PTD)的风险指数。
如果比值低于1意味着妇女没有或者有低的并发症风险。比值为1-2表示并发症的中等风险。如果比值为2-4表示妇女有并发症的高风险，如果比值高于4则表示妇女具有发生低出生体重或者早产的极高风险。
特别地，在实施例描述中，对应OR值等于2的中等风险意味着与普通妇女相比患者具有发生并发症的两倍风险，也就是说，风险相对高100％。
优选地，这种结果可用记分表示-表示低风险或者无风险，+表示中等风险，++表示高风险，+++表示极高风险。
表1突出了相对于唾液酸酶活性或者氨酰基脯氨酸二酞酶活性的增加，OR值具有基本递增的性质。
特别地，唾液酸酶活性水平为+1至+3截断值，LBW的OR值为2-4，而PTD的OR值为1-2。因此不考虑BV状况和阴道加德纳氏菌的存在，所述阴道液样品中的唾液酸酶水平表示LBW风险高和PTD风险中等。
对于唾液酸酶活性等于或者高于+4，LBW和PTD的OR值为2-4。因此LBW或PTD风险高。
同样的，氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平为+1至+3截断值，LBW和PTD的OR值为1-2，因此LBW和PTD风险中等。
另外，氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平等于或者大于+4，LBW的OR值高于4，PTD的OR值为2-4。因此LBW风险极高，而PTD风险中等。
从表1表示的临床数据分析，有可能将LBW和PTD的风险与患者体液中检测出的唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平相关，优选阴道液样品。
以上面表示结果为基础，并且根据本发明，建立了一种体液样品中涉及唾液酸酶或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的病理风险的确定方法，病理如低出生体重(LBW)，早产(PTD)，膜早期破裂，羊膜内感染，自然流产，子宫内膜炎，分娩后感染或者妇科手术术后感染，上生殖道感染(PID)，这些病理可引起不育症，宫颈炎，对乳头瘤病毒(HPV)和人免疫缺陷病毒(HIV)引起的病毒感染的性传播疾病的易感性，和HIV感染的垂直传播。
所述方法依次包括如下步骤a)确定所述体液样品中的唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平；b)将所述唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平与所述活性的前置值范围进行比较；c)计算风险因子。
很显然已设计了一种有效的评价妇女体液样品中涉及唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的病理风险的方法。这种方法利于进行非常精确和可靠的评价。
另外，如前所述，表1报道了pH≥4.7的妇女阴道液样品的分析数据和唾液酸酶或者氨酰基脯氨酸二酞酶的活性。
值得注意的是，阴道pH≥4.7的妇女中，对于唾液酸酶活性水平为+1至+2，LBW或者PTD的OR值为1-2，因此LBW和PTD风险中等。而唾液酸酶活性水平为+3时，LBW的OR值为2-4，PTD的OR值为1-2，因此LBW风险高，而PTD风险中等。最后唾液酸酶活性水平为+4，LBW或者PTD的OR值为2-4，因此相应的风险高。
pH≥4.7的阴道液样品中氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平为+1至+3时，LBW和PTD的OR值为1-2，因此相应风险中等。不同的是，对于氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平为+4时，LBW的OR值大于4，PTD的OR值为2-4，因此LBW风险极高而PTD风险高。
根据本发明实施例，可对pH值等于或大于4.7的阴道液样品使用该方法。
另外，如前所述，表1报道了患有BV的妇女阴道液样品的分析数据和唾液酸酶或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的测定数据。
特别地，在患有BV的妇女中对于唾液酸酶活性水平在+1至+2，LBW的OR值为1-2，PTD的OR值低于1，因此LBW风险中等，而PTD风险低或者没有风险。对于唾液酸酶活性水平在+3至+4时，LBW的OR值为2-4，因此LBW风险中等。
对于PTD水平等于或大于+3与等于或大于+4是有区别的。前一种情况OR值为1-2，风险中等，第二种情况OR值为2-4，风险高。
对于氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平为+1至+3时，LBW的OR值为1-2，LBW风险中等。对于同样的氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平值，PTD的OR值低于1，因此PTD的风险低或者没有风险。
值得注意的是，氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平等于或大于+4时，LBW和PTD的OR值高于4，因此二者的风险极高。
从以上所述，根据第一个实施例，本发明的用于确定并发症风险的方法可用于患有BV妇女的体液样品。
最后，表1显示了患有阴道加德纳氏菌集群的妇女的阴道液样品的分析数据和对唾液酸酶或者氨酰基脯氨酸二酞酶呈阳性的数据。
特别地，对于唾液酸酶活性水平为+1至+2时，LBW和PTD的OR值为1-2，风险中等。唾液酸酶活性水平等于或高于+3时，LBW的OR值为2-4，而PTD的OR值为1-2，因此LBW风险高，而PTD的风险中等。唾液酸酶活性水平等于或者大于+4时，LBW和PTD的OR值为2-4，因此不利妊娠后果的风险高。
氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平为+1至+2时，LBW和PTD的OR值为1-2，因此LBW和PTD的风险中等。氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平等于或者大于+3时，LBW的OR值为2-4，相应风险高，而PTD的OR值为1-2，因此相应风险中等。最后氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平等于或者大于+4，LBW和PTD的OR值均大于4，因此相应风险极高。
从以上所述，根据第二个实施例，本发明的用于确定并发症风险的方法可用于患有阴道加德纳氏菌集群的妇女的体液样品。
本发明中这两个实施例的先进性在于，通过结合使用细菌学分析方法或者BV的诊断或者阴道pH值的测定，可通过导致高风险的唾液酸酶和氨酰基脯氨酸二酞酶的活性的简单的确定方法选择具有极高风险的妇女。
正如本说明书的前言部分所述，本发明的方法可利于确定病理风险如获得性HIV病毒感染，HPV病毒感染，上生殖道感染(PID)，分娩后感染或者妇科手术术后感染，自然流产，子宫内膜炎，宫颈炎。
下面的部分将要描述关于获得性HIV病毒感染的研究。
为建立方法，最初征集了50名具有高风险的性获得性HIV病毒感染的妇女。三年之后，这些妇女中的42名妇女亚群仍然为HIV血清阴性(对照组)，有8名妇女亚群为HIV血清阳性。
根据体液样品中的唾液酸酶活性值，氨酰基脯氨酸二酞酶活性值，pH值等于或者大于4.7，细菌性阴道病(BV)的诊断和阴道加德纳氏菌的存在将这些组做了进一步的分组。
表2显示了在42名HIV血清阴性妇女亚群(对照组)和8名变为HIV血清阳性妇女亚群的阴道的酶活性值。
表2阳性％OR测量参数血清阴性 血清阳性和/或阴道集群 N＝42N＝8唾液酸酶活性≥+164.3 75.01.3≥+240.5 62.51.6≥+314.3 50.03.6≥+49.5 37.54.2氨酰基脯氨酸二酞酶活性≥+183.3 100.1.1≥+273.8 87.51.3≥+316.7 50.03.2≥+411.9 50.04.4pH≥4.7 81.0 87.51.2pH≥4.7和唾液酸酶活性≥+159.5 75.01.4≥+235.7 62.51.8≥+314.3 50.03.6≥+49.5 37.54.2pH≥4.7和氨酰基脯氨酸二酞酶活性≥+173.8 87.51.3≥+271.4 87.51.4≥+314.3 50.03.6≥+411.9 50.04.4BV 71.4 87.51.4BV和唾液酸酶活性≥+154.8 75.01.5≥+233.3 62.52.0≥+311.9 50.04.3≥+49.5 37.54.2BV和氨酰基脯氨酸二酞酶活性≥+173.8 87.51.3≥+269.0 87.51.5≥+311.9 50.04.3≥+49.5 50.05.5阴道加德纳氏菌 100.0100.0 1.0阴道加德纳氏菌和唾液酸酶活性≥+164.3 75.01.3≥+240.5 62.51.6≥+314.3 50.03.6≥+49.5 37.54.2阴道加德纳氏菌和氨酰基脯氨酸二酞酶活性≥+183.3 100.0 1.1≥+273.8 87.51.3≥+316.7 50.03.2≥+411.9 50.04.4
表2表示的主要结果为OR值，因为OR值代表了通过性传播患有HIV感染的风险指数。
如果该比值低于1，则妇女具有性获得病毒感染的低风险或者无风险。比值为1-2表示病毒感染的获得为中等风险。如果比值为2-4，则妇女具有病毒感染获得的高风险，如果比值大于4则为妇女具有病毒感染获得的极高风险。特别地，例如对应OR值为2的中等风险表示患者具有相对于普通妇女两倍的病毒感染获得的可能性，即风险相对高100％。
优选该结果可用记分表示-表示低风险或者无风险，+表示中等风险，++表示高风险，+++表示极高风险。
表2中表示的LBW或者PTD的值与表1中的值意义相同，在此不再详述。
从表1和表2可得出结论为随着唾液酸酶或者氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平的增大，OR值具有基本递增的性质。
下文将报道确定阴道液样品中唾液酸酶和氨酰基脯氨酸二酞酶活性的实施例，用来阐明本发明，而不构成对本发明的限制。
唾液酸酶活性确定将50μl阴道液样品与50μl溶解于50mM醋酸钠的2-(3’-甲氧苯基)-N-乙酰基-D-神经氨酸(Sigma供应)底物在pH＝5时于室温培养90分钟。加入4mM的4-氨基安替比林和6mM铁氰酸钾显色溶液后，具有唾液酸酶活性的样品在492纳米显可测的红色。测定结果以加入显色剂后的样品吸收和未加入显色剂的相同样品的吸收之间的差异来表示。对照已知量纯甲氧苯酚的标准曲线表示具体活性。
作为选择，可使用不同于2-(3’-甲氧苯基)-N-乙酰基-D-神经氨酸(Sigma，M1393)的生色底物或者荧光底物进行唾液酸酶活性的检验，如2-O-(邻硝基苯基)-α-D-N-乙酰基神经氨酸(Sigma，N1266，N1516)，2’-(4-甲基-7-羟基香豆素基(umbelliferyl))-α-D-N-乙酰基神经氨酸钠盐(Sigma，M8639)，5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-N-乙酰基神经氨酸(X-NeuNAc)，(Sigma，B4666；或者Calbiochem 203770)。
氨酰基脯氨酸二酞酶活性确定将50μl阴道液样品与50μl溶解于100mM醋酸钠的L-脯氨酸-对硝基苯胺底物(Sigma)在pH＝5时在37℃培养24小时，具有氨酰基脯氨酸二酞酶活性的样品在405纳米显黄色，使用无底物相同样品用于消除样品背景，用不含有阴道液的两个空白液的平均值消除底物的自发水解。结果以千分之一光学密度单位(mOD)表示。
作为选择，可使用不同于L-脯氨酸-对硝基苯胺(Sigma P5267)的生色底物或者荧光底物进行氨酰基脯氨酸二酞酶活性的检验，如L-脯氨酸-β-萘酰胺(Sigma P1380)，N-苄基氧羰基-L-脯氨酰-β-萘酰胺，N-苄基氧羰基-L-脯氨酸-对硝基苯酯(Sigma C4877)，羟基-L-脯氨酰-β-萘酰胺，L-脯氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素(Sigma P5898)，L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘酰胺(Sigma P9655)。
本发明的进一步的目的是提供一种确定妇女体液样品中涉及唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的病理风险的试剂盒。
试剂盒包括在溶液中的唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性检验，该溶液含有用于接种生物样品的无色底物溶液；配备分液器容器内的显色剂溶液；通过显色强度评价酶活性水平的参考刻度。
根据实施例，试剂盒也包括在固相载体上的唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性检验，该载体作为一个平台包括由固相框架支持的两层膜，并且含有酶底物和显色剂，生物样品流过其中；和通过显色强度评价酶活性水平的参考刻度。
根据进一步的实施例，所述试剂盒也可包括在固相载体上的唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性检验，该载体包括充满酶的生色底物或者荧光底物的膜和显色剂，并被惰性带所承载，用于与生物样品接触。所述试剂盒将装有通过显色强度评价酶活性水平的参考刻度。
根据本发明的进一步实施例，所述试剂盒也可包括pH指示剂，优选变色范围为4-7的pH显色纸。
值得注意的是本发明的试剂盒可有利地是联合试剂盒。所述试剂盒例如可包括在溶液中或者在固相载体上进行的确定唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的检验和pH指示剂。
显然参考以上表格所示的评价结果和来自描述的或者任何可得分析检验的评价结果，试剂盒提供了一种确定上述病理风险的快速方法，该试剂盒的主要意义是为医生提供有效工具以决定对患者进行药理学治疗并且可检验疗效。
由以上描述可正确评价本发明的确定病理风险的方法，该方法可用于实现本发明前言部分所述要求。所述病理风险如低出生体重(LBW)，早产(PTD)，膜早期破裂，羊膜内感染，自然流产，子宫内膜炎，分娩后感染或者妇科手术术后感染，上生殖道感染(PID)，这些病理可引起不育症，宫颈炎，对乳头瘤病毒(HPV)和人免疫缺陷病毒(HIV)引起的病毒感染的性传播疾病的易感性，HIV感染的垂直传播。
显然本领域的技术人员为了满足偶然的或者特殊的要求，可对上述方法引进数种改进和实施例，但所有这些都包含在下面权利要求所限定的发明中。
权利要求
1.妇女体液样品中涉及存在唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的病理风险的确定方法，该方法依次包括以下步骤a)确定所述体液样品中唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平；b)比较所述唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性和所述活性的前置值范围；c)计算风险因子。
2.权利要求1所述方法，其中在步骤a)后确定所述唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平的记分。
3.权利要求1或2所述方法，其中在pH等于或者大于4.7的阴道液样品中呈现病理风险。
4.权利要求1或2所述方法，其中在患有BV妇女的体液样品中呈现病理风险。
5.权利要求1或2所述方法，其中在阴道加德纳氏菌集群的妇女的体液样品中呈现病理风险。
6.权利要求1-5任一项所述方法，其中对阴道液样品使用该方法。
7.权利要求1-6任一项所述方法，其中涉及存在唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的病理包括低出生体重(LBW)，早产(PTD)，膜早期破裂，羊膜内感染，自然流产，子宫内膜炎，分娩后感染或者妇科手术术后感染，上生殖道感染(PID)，这些病理可引起不育症，宫颈炎，对由乳头瘤病毒(HPV)和人免疫缺陷病毒(HIV)引起的病毒感染的性传播疾病易感性，和HIV感染的垂直传播。
8.权利要求1-7任一项所述方法，其中对第一个或者第二个三个月妊娠期间妇女的体液样品使用该方法。
9.权利要求1-8任一项所述方法，其中对第7-24整周妊娠期妇女的体液样品使用该方法。
10.权利要求1-9任一项所述方法，其中对妊娠期妇女的体液样品使用该方法。
11.用于定量确定妇女体液样品中唾液酸酶活性的试剂盒。
12.用于定量确定妇女体液样品中氨酰基脯氨酸二酞酶活性的试剂盒。
13.用于定量确定妇女体液样品中唾液酸酶和氨酰基脯氨酸二酞酶活性的试剂盒。
14.权利要求11-13任一项所述试剂盒，该试剂盒包括带有唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性参考刻度的说明性散页。
15.权利要求11-14任一项所述试剂盒，该试剂盒包括说明性散页，该散页给出了评价病理风险的说明无或者低(-)，中等(+)，高(++)，极高(+++)。
16.权利要求11-15任一项所述试剂盒，该试剂盒包括在溶液中用于确定唾液酸酶活性的检验。
17.权利要求11-15任一项所述试剂盒，该试剂盒包括在溶液中用于确定氨酰基脯氨酸二酞酶活性的检验。
18.权利要求11-15任一项所述试剂盒，该试剂盒包括在溶液中用于确定唾液酸酶活性和氨酰基脯氨酸二酞酶活性的检验。
19.权利要求11-15任一项所述试剂盒，该试剂盒包括在固相载体上的检验，优选活性带检验或者平台检验，用于确定唾液酸酶活性。
20.权利要求11-15任一项所述试剂盒，该试剂盒包括在固相载体上的检验，优选活性带检验或者平台检验，用于确定氨酰基脯氨酸二酞酶活性。
21.权利要求11-15任一项所述试剂盒，该试剂盒包括在固相载体上的检验，优选活性带检验或者平台检验，用于分别确定唾液酸酶活性和氨酰基脯氨酸二酞酶活性。
22.权利要求11或者13所述的试剂盒，该试剂盒包括用于确定唾液酸酶活性的作为生色底物或者荧光底物的试剂，所述试剂选自2-(3’-甲氧苯基)-N-乙酰基-D-神经氨酸，2-O-(邻硝基苯基)-α-D-N-乙酰基神经氨酸，2’-(4-甲基-7-羟基香豆素基)-α-D-N-乙酰基神经氨酸钠盐，5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-N-乙酰基神经氨酸。
23.权利要求12或者13所述的试剂盒，该试剂盒包括用于确定氨酰基脯氨酸二酞酶活性的作为生色底物或者荧光底物的试剂，所述试剂选自L-脯氨酸-对硝基苯胺，L-脯氨酸-β-萘酰胺，N-苄氧羰基-L-脯氨酰-β-萘酰胺，N-苄氧羰基-L-脯氨酸-对硝基苯酯，羟基-L-脯氨酰-β-萘酰胺，L-脯氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素，L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘酰胺。
24.权利要求11-23任一项所述试剂盒，该试剂盒包括pH指示剂。
25.权利要求24所述试剂盒，该试剂盒包括pH值参考刻度，和/或唾液酸酶活性的参考刻度，和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的参考刻度。
26.权利要求24所述试剂盒，该试剂盒包括散页，该散页给出了评价病理风险的说明无或者低(-)，中等(+)，高(++)，极高(+++)。
全文摘要
本发明描述了妇女体液样品中涉及存在唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的病理风险的确定方法，该方法依次包括以下步骤a)确定所述体液样品中唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平；b)比较所述唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平和所述活性的前置值范围；c)计算风险因子。这种方法对于准确和可靠地评价妇女体液样品中涉及唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的病理风险特别有效。因此这种方法为医生提供了一种有效工具以决定是否进行药理学治疗。
文档编号G01N33/50GK1503908SQ01822652
公开日2004年6月9日 申请日期2001年2月15日 优先权日2001年2月15日
发明者萨比纳考兹 申请人:尤尼拜尔有限公司