专利名称：植物组织少量样品快速制备方法
技术领域：
本发明涉及一种对植物组织进行分析测定的样品快速制备方法，具体为对植物鲜样或烘干样品在离心管中直接打碎方法。
背景技术：
钾(K+)是植物体中含量最高的矿质营养元素，也被称为“品质元素”，它能提高作物产量，改善作物品质、增强作物抗逆性。烟草是一种喜钾植物，钾也是烤烟重要品质指标之一，烟叶钾含量高对烟叶外观质量、感官质量及烟叶吸食安全性均有良好作用。目前我国黄淮烟区和部分西南烟区烟叶钾含量偏低，通过烟草钾高效遗传材料筛选，进行烟草钾素营养性状的遗传改良和育种工作是一条经济有效的提高我国烟叶钾含量的技术途径之一。对育种材料进行DNA提取是植物分子生物学研究的重要步骤，对植物组织钾含量测定是筛选钾高效遗传材料的重要步骤，两个重要步骤均需要对大量样品进行制备以利于DNA提取和钾含量测定。提取植物样品DNA可以采用试剂盒，但每个样品的提取成本比较高，主要针对样品数量较少的植物鲜样进行样品快速制备和DNA提取；另外一种做法是采用液氮冷冻，然后磁珠高频振荡来打碎样品，最后采用常规的CTAB或SDS方法提取DNA，操作程序较多，且每次机器打碎的样品数量较少；植物组织钾含量测定主要采用流动分析仪和火焰光度计测定方法，但上机测定前的样品制备通常采用人工操作高速粉碎机打碎烘干样品或利用研钵手工磨样，前者需要每个样品有足够的取样量，后者可以磨取样量比较少的样品，但回收率低，有一定的样品量损失，两者均存在人工投入大，工作效率低。

发明内容
本发明的目的正是针对上述现有状况而专门提供的一种植物组织少量样品快速制备方法，以适应日常植物学研究中需要对植物鲜样或烘干样品进行制备，利于开展后续提取和测定分析工作。本发明利用现有液氮速冻和高频振动粉碎的技术原理，借助一定的方法改进现有技术，在离心·管中直接取样、烘干，然后利用高速转头打碎烘干样品；或借助液氮对离心管中鲜样进行速冻，然后利用高速转头直接在离心管中打碎植物鲜样。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种植物组织少量样品快速制备方法，适用于对植物鲜样或干样进行成分分析或DNA鉴定，是通过将植物鲜样直接装入2ml圆底离心管中在烘箱中进行烘干处理或在液氮中进行速冻处理，之后用带有圆顶钻头的手持电钻将样品在离心管中直接打碎，在烘干样品管中加提取液浸提，或在冷冻样品管中加提取液分解细胞，然后在高速离心机中分离上清液，用上清液进行成分分析或作为DNA鉴定样品。在本发明中，装在离心管中的植物鲜样烘干处理时，先在烘箱中105°C杀青5min 25 min，然后在55°C 85°C下烘干。在鲜叶样品制备冷冻前，用剪刀剪取的样品，要卷起对折后装入离心管中，以利于在液氮速冻后样品不易从离心管中掉出；手持电钻的钻头顶端为半圆形，以利于在离心管中打碎样品，而不会将管子打穿；离心管为透明、耐高温、具有一定强度的塑料材质，市面购买的2ml普通圆底离心管均可以使用。本发明相比现有技术的优点在于:采用该方法使样品制备工作灵活，省去仪器操作和简化步骤，节约一定的试验成本，提高工作效率。本方法适用于开展烟草钾素营养和钾高效遗传材料的钾含量测定工作，及分子生物研究的DNA提取前样品制备工作，方便实验室内取样量少、分析样品数量多的样品分析和测试工作。
具体实施例方式实施例1烟叶中钾含量测定
(I)以烤烟NC297上部烟叶为材料，在烟叶烘烤过程的不同关键阶段，从烤房中选取代表性烟叶10片，用Icm直径打孔器在烟草叶片不同部位(左右半片烟叶各取7个部位，主叶脉取5个部位)打孔提取样品，直接装到2ml圆底离心管中，离心管上均编号，装样前称量离心管质量，装样后称取离心管和烟叶质量。将离心管中制备样品先开盖在烘箱中105°C杀15min,然后65°C烘干,烘干后称量尚心管和烘干样品质量。(2)将电钻的钻头打磨成近半圆形，用带有圆底转头的手持电钻直接在离心管中打碎样品，样品打碎好的离心管开盖放在96孔双面离心管架上，用5ml移液枪吸取1.5ml5%醋酸加到离心管中，盖上盖子在水平摇床上水平振荡浸提半小时。(3)装有浸提液的2ml离心管在离心机中12000 rpm高速离心3 min，然后放在96孔双面离心管架上，用Iml移液枪吸取0.5ml上清液于新的1.5ml离心管中，再用Iml移液枪吸取Iml 5%醋酸于该离心管中，使浸提液稀释3倍。(4)将装有 浸提上清液的离心管剪掉离心管盖，直接放在流动分析仪5ml样品杯中，然后再将样品杯放在流动分析仪吸样架上，上机测定钾含量。(5)烟叶烘烤过程中不同部位钾含量测定见表1，表2，表3，主叶脉中钾含量高于叶片，叶片中钾含量随烘烤进行有增加趋势，而主叶脉中钾含量有降低趋势。表I烟叶左半片叶不同部位钾含量(％)
钾含量(％) |38°C开始|38°C结束|42°C变黄结束|48°C定色结束 立 I0.39 0.40 0~670.49
1 20.49 α 37 (Γ760.56
立 30.58 0.34 0~640.47
立 40.50 0.35 0~930.69
1 50.57 0.56 0~730.52
立 60.54 0.38 0~720.59
1 70.59 0.52 0~680.55
平场值’0.52 0.42 0~730.55
寂推差|θ.07 |θ.09 |θ.09|θ.07
注:表中温度是烟叶在烤房中进行升温烘烤，变黄和定色阶段取样的烤房温度
表2烟叶右半片叶不同部位钾含量(％)
钾含量(％) |38°C开始|38°C结束|42°C变黄结束|48°C定色结束
WiiL I0.52 α 600~720.58
立 20.62 0.660~990.64
1 30.60 0.490~590.54
立 40.43 0.880~790.73
立 50.53 0.550~670.55
1 60.42 0.370~800.68
1 7|θ.48 |θ.39|θ.77|θ.60
权利要求
1.一种植物组织少量样品快速制备方法，适用于对植物鲜样或干样进行成分分析或DNA鉴定，其特征在于:是通过将植物鲜样直接装入2ml圆底离心管中，并在烘箱中进行烘干处理或在液氮中进行速冻处理，之后再用带有圆顶钻头的手持电钻将样品在离心管中直接打碎，然后在烘干样品管中加提取液浸提，或在冷冻样品管中加提取液分解细胞，最后在高速离心机中分离上清液，用上清液进行成分分析或作为DNA鉴定样品。
2.根据权利要求1所述的植物组织少量样品快速制备方法，其特征在于:装在离心管中的植物鲜样烘干处理时，可以先在烘箱中105°C杀青5 min 25 min，然后在55°C 85°C下烘干。
3.根据权利要求1所述的植物组织少量样品快速制备方法，其特征在于:液氮速冻处理时，将含有样品的离心管直接开盖放到装有液氮的泡沫盒中，用捻子取出离心管直接在管中打碎样品。
4.根据权利要求1所述的植物组织少量样品快速制备方法，其特征在于:手持电钻的钻头顶端为半圆形。
5.根据权利要求1所述的植物组织少量样品快速制备方法，其特征在于:离心管为透明、耐高温、具有一定 强度的塑料材质。
全文摘要
一种植物组织少量样品快速制备方法，适用于对植物鲜样进行成分分析或DNA鉴定，是通过将植物鲜样直接装入2ml圆底离心管中，并放在烘箱中进行烘干处理或在液氮中进行速冻处理，之后用带有圆顶钻头的手持电钻将样品在离心管中直接打碎，在烘干样品管中加提取液浸提，或在冷冻样品管中加提取液分解细胞，然后在高速离心机中分离上清液，用上清液进行成分分析或作为DNA鉴定样品。采用本发明使样品制备工作灵活，省去仪器操作和简化步骤，节约一定的试验成本，提高工作效率。本方法适用于开展烟草钾素营养和钾高效遗传材料的钾含量测定工作，及分子生物学研究的DNA提取前样品制备工作，方便实验室内取样量少、分析样品数量多的样品分析和测试工作。
文档编号G01N1/44GK103234787SQ201310121110
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月9日 优先权日2013年4月9日
发明者高志强, 宋纪真, 周汉平, 王信民, 奚家勤, 郭建华 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院