专利名称：一种检测不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的方法，特别是涉及高效液相色谱-荧光检测法，高效液相色谱-二极管阵列检测法测定，光谱及高效液相色谱-质谱联用法确证中药中玉米赤霉烯酮毒素的方法。
背景技术：
玉米赤霉烯酮毒素是由禾谷镰刀菌、三线镰刀菌及串珠镰刀菌等产生一种雌激素类真菌毒素，在自然界分布广泛，其主要存在于霉变的玉米、高粱、小麦、燕麦、大麦等谷类作物以及奶类制品中，近期研究发现干燥的人参根、斯里兰卡药用植物Tribulus terrestris等药用植物中叶含有玉米赤霉烯酮毒素。毒理学实验表明，玉米赤霉烯酮毒素具有类雌激素样作用，生殖发育毒性、免疫毒性、肝毒性、遗传毒性，对肿瘤发生也有一定的影响。为了控制玉米赤霉烯酮毒素对人和动物产生的危害，世界多国已经制定了食品及饲料中玉米赤霉烯酮毒素的限量标准，如奥地利制定的小麦等食品中玉米赤霉烯酮毒素的限量标准为60μ g/kg，法国规定的谷物和菜油中的玉米赤霉烯酮毒素的限量标准为200μ g/ kg。在我国，最新的粮食卫生标准规定供人食用的原粮和成品粮，包括禾谷类、豆类等玉米赤霉烯酮毒素的限量标准为60μ g/kg。2006年出台的国家标准规定了饲料中玉米赤霉烯酮毒素的限量标准分别为500 μ g/kg。我国是药用植物资源大国，药用植物从生长、采集、贮存以及加工过程中均可能受玉米赤霉烯酮毒素污染。玉米赤霉烯酮毒素常以痕量存在，常规检测方法由于检测限限制难以广泛应用，因此简化检测步骤，提高检测灵敏度及准确性已成为当前玉米赤霉烯酮毒素检测中的一大难题。与传统的薄层色谱法、酶联免疫法相比高效液相色谱法灵敏度更高， 选择性更好，结果也更加准确可靠。高效液相色谱具有高分离效能，能准确检测药用植物中的玉米赤霉烯酮毒素，质谱技术具有定性能力强、高灵敏度的特点，二者联用，可以充分发挥其优点。本发明克服现有技术不足，建立了高效液相色谱-荧光检测法、高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的方法，并建立了不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的高效液相色谱-质谱联用确证法。

发明内容
本发明的目的是提供中药中玉米赤霉烯酮毒素的多种检测方法，保证在不同实验室条件下准确检测不同基质中药中的玉米赤霉烯酮毒素时的准确性和先进性，能有效的对中药中的玉米赤霉烯酮毒素进行测定和确证。到目前为止，国内外报道的玉米赤霉烯酮毒素分析方法大多限于食品、农产品以及饲料等方面，对中药中玉米赤霉烯酮毒素的分析，目前还是空白。因此对玉米赤霉烯酮毒素测定方法的建立研究迫在眉睫。现有的测定食品、农产品以及饲料中的玉米赤霉烯酮毒素的方法，由于样品基质相对简单，干扰较小，一般都较容易测定。本发明在上述研究的基础上，选择了适用于中药中玉米赤霉烯酮毒素的提取溶剂，提取方法及流动相比例，保证样品处理快捷简便，准确性高，重现性好，故采用该方法能更加准确的对中药中的玉米赤霉烯酮毒素进行测定。本发明是通过高效液相色谱-荧光检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量； 采用高效液相色谱-二极管阵列检测法建立另一种测定中药中玉米赤霉烯酮毒素含量的方法；采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。具体的中药中玉米赤霉烯酮毒素的测定的方法，可以通过以下步骤实现仪器、药品及材料仪器Hitachi L-2130高效液相色谱系统，日本Hitachi公司；Hitachi L-2485 荧光检测器，日本 Hitachi 公司；ShimadzuLC-20AT高效液相色谱系统，日本Shimadzu公司；Shimadzu SPD-M20A 二极管阵列检测器，日本Shimadzu公司；Shimadzu LCMS-2010EV高效液相-质谱联用系统，日本Siimadzu公司；Shimadzu 20IOEV单四级杆质谱系统，日本Shimadzu公司；Waring高速均质器，美国Waring公司；CX-250HP型超声波清洗器，北京医疗设备二厂；ZD-9556型水平摇床，太仓市科教仪器厂；WH-861型旋涡混合器，金坛市盛蓝仪器制造有限公司；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司Zearala testTM HPLC 免疫亲和柱，美国 VICAM 公司；GF/A型玻璃微纤维滤纸，英国WHATMAN公司。对照品玉米赤霉烯酮毒素标准品购自以色列!^ermentek公司，纯度彡99%。药材所测样品分别购自江西樟树、江苏镇江、北京以及贵州遵义，所有样品均为药材市场上随机购买而来，经中国医学科学院药用植物研究所张本刚教授鉴定，低温干燥后备用。1、用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量；a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水为流动相，柱温 20-30°C，激发波长270士2nm，发射波长440士b.溶液配制对照品溶液的制备取玉米赤霉烯酮标准品适量，加流动相或乙腈制成溶液；吐温-PBS缓冲溶液的配制称取氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾适量并溶于水中，用浓盐酸调节PH至7. 0，加吐温-20，用水定容。c.样品溶液的制备样品提取取药材粉末，置具塞锥形瓶中，加甲醇-水混合溶剂，提取，过滤，取滤液加吐温-PBS缓冲溶液，震摇，静置后过滤，滤液备用。样品净化取上述溶液缓慢通过免疫亲和柱，直至空气通过柱体，以水淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使空气通过柱体。加入甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，涡旋，过滤后。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱仪，测定。
2、用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量、光谱图确证阳性结果；a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水为流动相，柱温 20-30 0C，检测波长236nm，272nm, 316nm ；b.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱仪，测定。3、采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。a.液相条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-醋酸铵水为流动相；柱温 20-30 0C ；b.质谱条件用大气压化学电离方式电离；选择正离子监测模式；全扫描模式扫描。c.测定法分别精密吸取对照品和上述阳性样品溶液，注入高效液相色谱-质谱联用系统，测定。上述的中药中玉米赤霉烯酮毒素的测定方法，优选以下步骤1、用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量；a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水 (6-10 46 44-48，V/V)为流动相，柱温20-30°C，激发波长270士2nm，发射波长 440士2nm ；b.溶液配制对照品溶液的制备精密称取取玉米赤霉烯酮标准品适量，加流动相或乙腈制成每 ml 含 20-60 μ g/mL 溶液；吐温-PBS缓冲溶液的配制称取8. Og氯化钠、1. 2g磷酸氢二钠、0. 2g磷酸二氢钾、0. 2g氯化钾溶于水中，用浓盐酸调节pH至7. 0，加入Iml吐温_20，用水定容。c.样品溶液的制备样品提取精密称取药材粉末20_30g(精确至0. Ig)，置于250mL具塞锥形瓶中， 加80-120mL甲醇-水(体积比为80 20)混合溶剂，用高速均质器提取3min，普通滤纸过滤，取滤液IOml加40ml吐温-PBS缓冲溶液，震摇，静置2_;3min后用玻璃微纤维滤纸过滤， 滤液备用。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液10-20 μ L，注入液相色谱仪，测定。2、用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量、光谱图确证阳性结果；a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水 (6-10 46 44-48, V/V/V)为流动相，柱温 20_30°C，检测波长236nm，272nm，316nm ；b.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液40-100 μ L，注入液相色谱仪，测定。3、采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。a.液相条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%醋酸铵水 (70-80 20-30，V/V)为流动相；柱温 20_30°C ；b.质谱条件用大气压化学电离方式电离；选择正离子监测模式；干燥气流速 6. 00士2L/min，干燥气温度330_340°C，碎裂电压140-160V，全扫描模式扫描。c.测定法分别精密吸取对照品和上述阳性样品溶液5-10 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用系统，测定。本发明中药中玉米赤霉烯酮毒素的测定方法，更优选的技术方案可以按下列测定步骤进行1、用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量；a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水(8 46 46， V/V/V)为流动相，柱温25°C，激发波长270nm，发射波长440nm ；b.溶液配制对照品溶液的制备精密称取取玉米赤霉烯酮标准品适量，加乙腈制成每ml含 40 μ g/mL 溶液；吐温-PBS缓冲溶液的配制称取8. Og氯化钠、1. 2g磷酸氢二钠、0. 2g磷酸二氢钾、0. 2g氯化钾溶于900ml水中，用浓盐酸调节pH至7. 0，加入Iml吐温-20，用水定容至 1000ml。c.样品溶液的制备样品提取精密称取药材粉末25. 0(精确至0. Ig)，置于250mL具塞锥形瓶中，加 IOOmL甲醇-水(体积比为80 20)混合溶剂，用高速均质器提取;3min，普通滤纸过滤，取滤液IOml加40ml吐温-PBS缓冲溶液，震摇，静置aiiin后用玻璃微纤维滤纸过滤，滤液备用。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液20 μ L，注入液相色谱仪，测定。2、用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量、光谱图确证阳性结果；a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水(8 46 46， V/V/V)为流动相，柱温25°C，检测波长236nm ；b.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液50 μ L，注入液相色谱仪，测定。3、采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。a.液相条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%醋酸铵水 (75 25, V/V)为流动相；柱温25°C ；b.质谱条件用大气压化学电离方式电离；选择正离子监测模式；干燥气流速 6. OOL/min，干燥气温度340°C，碎裂电压150V，全扫描模式扫描，扫描范围200-400m/z。c.测定法分别精密吸取对照品和上述阳性样品溶液10 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用系统，测定。经过多次重复试验，确认方法简便，结果准确，可作为不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的测定方法。本发明提供了中药中玉米赤霉烯酮毒素的高效液相色谱-荧光检测法测定；中药中玉米赤霉烯酮毒素的高效液相色谱-二极管阵列检测法，并采用光谱图确证了实验中的阳性结果；中药中的阳性结果的高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果确证。结果准确，重现性好，可作为不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的测定方法。1、用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量；(1)提取溶剂的选择用于提取玉米赤霉烯酮毒素的提取溶剂系统主要包括乙腈-水(90 10，V/V)系统，甲醇-水(80 20，V/V)等，本实验选择空白样品炒杏仁加样(60ug/kg)及阳性样品薏苡仁(北京)的提取效果(以含量计算)对两种提取溶剂系统进行比较，每组实验均重复 3次，η = 3，结果见表1。 甲醇水(80 20)与乙腈冰(90 10)提取效果相差不大，但乙腈-水系统提取物在过免疫亲和柱过程中压力较甲醇-水体系大，考虑到中药基质复杂，且乙腈毒性及价格较甲醇更高，因此选择甲醇水体系进行提取。表1提取溶剂选择表
权利要求
1.一种检测不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)、用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量；(2)、用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量、光谱图确证阳性结果；(3)、采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。
2.根据权利要求1的不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)、用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量；a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水为流动相，柱温 20-30°C，激发波长270士2nm，发射波长440士2nm ；b.溶液配制对照品溶液的制备取玉米赤霉烯酮标准品适量，加流动相或乙腈制成溶液；吐温-PBS缓冲溶液的配制称取氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾适量并溶于水中，用浓盐酸调节PH至7. 0，加吐温-20，用水定容。c.样品溶液的制备样品提取取药材粉末，置具塞锥形瓶中，加甲醇-水混合溶剂，提取，过滤，取滤液加吐温-PBS缓冲溶液，震摇，静置后过滤，滤液备用。样品净化取上述溶液缓慢通过免疫亲和柱，直至空气通过柱体，以水淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使空气通过柱体。加入甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，涡旋， 过滤后。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱仪，测定。(2)、用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量、光谱图确证阳性结果；a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水为流动相，柱温 20-30 0C，检测波长236nm，272nm, 316nm ；b.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱仪，测定。(3)、采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。a.液相条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-醋酸铵水为流动相；柱温 20-30 0C ；b.质谱条件用大气压化学电离方式电离；选择正离子监测模式；全扫描模式扫描。c.测定法分别精密吸取对照品和上述阳性样品溶液，注入高效液相色谱-质谱联用系统，测定。
3.根据权利要求2的中药中玉米赤霉烯酮毒素的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)、用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量；a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水 (6-10 46 44-48，V/V)为流动相，柱温20-30°C，激发波长270士2nm，发射波长 440士2nm ；b.溶液配制对照品溶液的制备精密称取取玉米赤霉烯酮标准品适量，加流动相或乙腈制成每ml 含 20-60 μ g/mL 溶液；吐温-PBS缓冲溶液的配制称取8. Og氯化钠、1. 2g磷酸氢二钠、0. 2g磷酸二氢钾、 0. 2g氯化钾溶于水中，用浓盐酸调节pH至7. 0，加入Iml吐温_20，用水定容。c.样品溶液的制备样品提取精密称取药材粉末20-30g(精确至0. Ig)，置于250mL具塞锥形瓶中，加 80-120mL甲醇-水(体积比为80 20)混合溶剂，用高速均质器提取:3min，普通滤纸过滤， 取滤液IOml加40ml吐温-PBS缓冲溶液，震摇，静置2_;3min后用玻璃微纤维滤纸过滤，滤液备用。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液10-20μ L，注入液相色谱仪，测定。(2)、用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量、光谱图确证阳性结果；a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水 (6-10 46 44-48, V/V/V)为流动相，柱温 20_30°C，检测波长236nm，272nm，316nm ；b.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液40-100 μ L，注入液相色谱仪，测定。(3)、采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。a.液相条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1 %醋酸铵水 (70-80 20-30，V/V)为流动相；柱温 20-30 °C ；b.质谱条件用大气压化学电离方式电离；选择正离子监测模式；干燥气流速 6. 00士2L/min，干燥气温度330_340°C，碎裂电压140-160V，全扫描模式扫描。c.测定法分别精密吸取对照品和上述阳性样品溶液5-10μL，注入高效液相色谱-质谱联用系统，测定。
4.根据权利要求3的中药中玉米赤霉烯酮毒素的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)、用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量；a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水(8 46 46，V/V/ V)为流动相，柱温25°C，激发波长270nm，发射波长440nm ；b.溶液配制对照品溶液的制备精密称取取玉米赤霉烯酮标准品适量，加乙腈制成每ml含40 μ g/ mL溶液；吐温-PBS缓冲溶液的配制称取8. Og氯化钠、1. 2g磷酸氢二钠、0. 2g磷酸二氢钾、 0. 2g氯化钾溶于900ml水中，用浓盐酸调节pH至7. 0，加入Iml吐温-20，用水定容至 1000ml。c.样品溶液的制备样品提取精密称取药材粉末25.0(精确至0. lg)，置于250mL具塞锥形瓶中，加IOOmL 甲醇-水(体积比为80 20)混合溶剂，用高速均质器提取;3min，普通滤纸过滤，取滤液 IOml加40ml吐温-PBS缓冲溶液，震摇，静置^iiin后用玻璃微纤维滤纸过滤，滤液备用。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液20μ L，注入液相色谱仪，测定。(2)、用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量、光谱图确证阳性结果；a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水(8 46 46，V/V/ V)为流动相，柱温25°C，检测波长236nm ；b.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液50μ L，注入液相色谱仪，测定。 (3)、采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。a.液相条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%醋酸铵水(75 25，V/ V)为流动相；柱温25 0C ；b.质谱条件用大气压化学电离方式电离；选择正离子监测模式；干燥气流速6.OOL/ min，干燥气温度340°C，碎裂电压150V，全扫描模式扫描，扫描范围200_400m/Z。c.测定法分别精密吸取对照品和上述阳性样品溶液10μ L，注入高效液相色谱-质谱联用系统，测定。
5.根据权利要求2-4任一所述的一种检测不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的方法， 其特征在于样品制备过程中a.提取溶剂采用甲醇水混合溶液；b.提取方式为高速勻质提取；c.稀释溶液采用吐温-PBS缓冲溶液。
6.根据权利要求5所述的一种检测不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特征在于样品制备过程a.提取溶剂采用甲醇水(80 20，V/V)混合溶液；b.提取方式为高速勻质提取:3min；c.稀释溶液采用pH7.0的吐温-PBS缓冲溶液。
7.根据权利要求2-4任一所述的一种检测不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的方法， 其特征在于a.液相色谱法中采用甲醇-乙腈-水作为流动相；b.高效液相色谱-质谱联用法中采用甲醇-0.醋酸铵水作为流动相；c.高效液相色谱-质谱联用法中采用大气压化学电离方式电离，采用正离子监测模式，全扫描方式。
8.根据根据权利要求7所述的一种检测不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特征在于a.液相色谱法中采用甲醇-乙腈-水(8 46 46, V/V/V)作为流动相；b.高效液相色谱-质谱联用法中采用甲醇-0.1%醋酸铵水(75 25，V/V)作为流动相；c.高效液相色谱-质谱联用法中采用大气压化学电离方式电离，采用正离子监测模式，全扫描方式。
全文摘要
一种检测不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的方法，包括中药样品的提取，纯化及检测，所述的样品采用甲醇-水(80∶20，V/V)高速匀质提取，pH7.0吐温-PBS缓冲溶液稀释，玻璃纤维膜过滤，免疫亲和柱净化。所述测定方法包括高效液相色谱-荧光检测法，高效液相色谱-二极管阵列检测法测定，光谱及高效液相色谱-质谱联用法确证。液相色谱条件为流动相比例甲醇∶乙腈∶水(8∶46∶46，V/V/V)，荧光检测器波长激发波长270nm，发射波长440nm；二极管整列检测器波长236nm。液质条件甲醇-0.1％醋酸铵水(75∶25，V/V)为流动相，大气压化学电离正离子模式，干燥气流速6.00L/min，干燥气温度340℃，碎裂电压150V，全扫描模式扫描，扫描范围200-400m/z。本发明具有准确，精密，可靠等特点。
文档编号G01N30/02GK102297903SQ20101020919
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月25日 优先权日2010年6月25日
发明者张晓飞, 杨美华 申请人:中国医学科学院药用植物研究所