专利名称：通过检测细胞和合胞体的荧光来鉴别干细胞的方法
通过检测细胞和合胞体的荧光来鉴别干细胞的方法相关申请案本申请案主张2008年9月M日申请的美国临时申请案第61/194，076号的权益。 上述申请案的完整教示都按引用并入本文中。
背景技术：
引起动物胚胎、胎儿、新生儿和幼体生长和分化的过程与引起肿瘤前和产生肿瘤的细胞类型的生长和分化的过程共有某些特征。识别肿瘤和胎儿中抗原分子的方法显示， 在胎儿和肿瘤中能够观察到的许多分子在成体器官中都观察不到。十九世纪，曾就肿瘤可能是由成体中的残留胚胎或胎儿细胞引起而展开过辩论。当前的观点则指向从胚胎到成体干细胞在直系谱系中发生遗传改变的自我更新干细胞的存在，这些遗传改变产生肿瘤干细胞，从而引起肿瘤。争论的焦点概括起来是，单一正常的胎儿幼体组织干细胞可以成为肿瘤前期干细胞的祖先，而其中一个肿瘤前期干细胞又产生肿瘤的基础干细胞，肿瘤又产生克隆转移和肿瘤移植的基础干细胞。基于肿瘤前期病变、肿瘤和转移中明显存在组织学可分化的细胞类型，以及通过模拟胚胎的生长和发育，可以推断出，组织、肿瘤前期病变、肿瘤和转移的原始干细胞必定能够分化和自我更新生长。如果肿瘤生长的干细胞理论是正确的， 那么就迫切需要对肿瘤干细胞进行鉴别、分选、分类和处理。然而，此项技术中尚未描述过此类细胞的鉴别或分离方法。

发明内容
本发明是基于哺乳动物(包括人类)、细胞培养物和组织样品(包括肿瘤前期病变或肿瘤样品)中器官特异性和/或肿瘤干细胞和其它干细胞形式的鉴别方法和分类方法。 本发明涉及通过确定或检测干细胞或者含有一个或一个以上干细胞核的合胞体的荧光的存在或不存在，或者测定或测量所述荧光的强度，来鉴别干细胞和含有干细胞核的合胞体的方法。更具体点说，荧光是存在于干细胞的球形细胞器(balloon-like organelle)中。 这些球形细胞器在本文中也称为细胞质结构或细胞质组合物。本文中使用的细胞质结构或细胞质组合物包括细胞质的细胞溶质部分、细胞膜、细胞器和其组合。在包含至少一个干细胞核(通常包含两个或两个以上干细胞核)的所关注的合胞体中，合胞体包含荧光细胞质 (或细胞溶质)，其包围或吞没所关注的合胞体细胞质中的一个或一个以上干细胞核(例如，在合胞体的核间空隙中)。如本文中进一步描述，“干细胞核”特指“钟形核”。含有钟形核的干细胞在本文中也称为偏核细胞(metakaryote)。本文中使用的荧光干细胞或合胞体是在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下发荧光的干细胞或合胞体。用于鉴别偏核干细胞和或合胞体的荧光是由与外源非荧光性化学物质反应而产生的，所述外源非荧光性化学物质由与干细胞和/或合胞体中存在的物质反应而产生荧光产物。更具体点说，所述非荧光性化学物质包含希夫碱(Schiff' s base) 0在干细胞的细胞质中存在强烈的荧光。而在钟形偏核干细胞核中明显无荧光。在一个实施例中，使用诸如酸-醇混合物等适合的试剂固定干细胞或合胞体，随后用可与干细胞或合胞体的组分反应的非荧光性试剂处理，产生荧光产物，之后检测荧光干细胞或合胞体。适用于固定干细胞的酸-醇混合物包括乙酸-乙醇；卡诺依氏固定液 (Carnoy' s fixative) ；3 1的甲醇-冰乙酸；6 3 1的乙醇-氯仿-乙酸；3 1的乙醇-乙酸等。适合的非荧光性试剂包括希夫碱试剂、富尔根试剂(Feulgen reagent)、品红等。本文中使用的非荧光性试剂自身不会发出荧光(自身会发出荧光的试剂的实例包括异硫氰酸荧光素(FITC)、绿色荧光蛋白、德克萨斯红等)。在另一实施例中，先用非荧光性试剂(例如希夫碱试剂、富尔根试剂、品红等)染色，随后检测荧光干细胞或合胞体。因此，一种本发明方法是基于通过检测或显影干细胞或者包含一个或一个以上干细胞核的合胞体中发荧光的球形细胞器(细胞质结构或细胞质组合物，但非核质)来鉴别所关注的偏核干细胞或所关注的多核合胞体，其中所述所关注的合胞体包含一个或一个以上干细胞核(例如，所关注的合胞体常常包含两个或两个以上干细胞核)，其中所述干细胞核以钟形核为特征。应注意，尽管杯状细胞也具有在固定和用适合的希夫碱试剂(诸如品红)染色后可发荧光的扩大的球形细胞质，但本文中所述的偏核干细胞与杯状细胞截然不同。组织学和医学文献中描述的杯状细胞在与产生杯状细胞的细胞质中可见的大量粘蛋白相关的许多组织中都能见到，包括肺和结肠。与单一偏核干细胞中的一样，杯状细胞的核也偏向于位于其球形细胞质的一端。然而，在偏核干细胞中，独特的钟形核与部分被钟口吞没的球形细胞质在物理上紧密邻近。相比之下，杯状细胞的核为扁球形或卵圆形，并且通常如酒杯或 “高脚杯”中一般经由狭窄的颈或柄与细胞质分开。重点要强调的是一个关键差异杯状细胞不具有钟形核，并且与具有钟形核的偏核干细胞属于不同的细胞类型。在一个实施例中，本文中所述的在不存在外来或外源添加的荧光染料或试剂的情况下发荧光的偏核干细胞是器官特异性干细胞，并且见于许多(但非全部)处于发育阶段的人胎儿器官，包括消化、呼吸、神经和肌肉骨骼系统的器官；癌症干细胞、胎儿-幼体干细胞或成体干细胞。具体点说，在发育中的人血管系统静脉和动脉中具有钟形核的偏核干细胞在细胞质内未发现含有本文中所述的在不存在外来或外源添加的荧光染料或试剂情况下发荧光的物质。因此，在一个实施例中，本文中所述的在不存在外来或外源添加的荧光染料或试剂的情况下发荧光的偏核干细胞不是血管干细胞。如上文所述，所关注的干细胞和合胞体在样品中未添加外来荧光物质/染料的情况下发荧光，由此可以显影所关注的干细胞和合胞体。因此，对于干细胞/合胞体在无外来荧光物质/染料情况下发荧光的独特特征的发现会极大地便利诸如肿瘤组织活检样品等组织样品中干细胞/合胞体的鉴别。这些样品可借助于手动、自动或半自动荧光扫描技术快速扫描，从而达到外科病理学和外科肿瘤学诊断的目的。如美国专利第7，427，502号“基于核形态类型鉴别干细胞的方法(Methods for Identifying Stem Cells Based on Nuclear Morphotypes) ”(其教示按全文引用的方式并入本文中)中所述，细胞培养物、组织、肿瘤前期病变或肿瘤样品中所有细胞间多细胞聚集体和多核合胞体中的核形态类型、核分裂模式和特定形态类型的核的涉及都指示干细胞。 可以仅根据特定核形态类型来鉴别器官特异性或肿瘤干细胞。在胎儿组织、肿瘤前期病变 (结肠腺瘤)和瘤形成病变或肿瘤(结肠腺癌、胰腺癌)中，观察到多种清楚且可再生的非球形核形式(核形态类型)，但在诸如结肠隐窝或肝实质等正常成体组织中不存在。美国专利第7，427，502号中揭示的这些形态类型包括先前在人体组织的组织学或病理学年报中未报导的尺寸和形状的核。一种值得注意的核形态类型呈具有开“口”的杯或钟形式，称为 “钟形”。在对称核分裂(类似于分离两个堆叠的纸杯)中观察到这些钟形的核。这些“杯与杯(cup-from-cup)，，分裂值得注意之处还在于，这些分裂是无丝分裂， 例如，不像有丝分裂中一般涉及所有的人染色体的凝集和分离。在杯与杯分裂产生两个明显相同的钟形核的情况下，其为对称核分裂。据观察，这些钟形核也经历无丝分裂的不对称核分裂，其中钟形核似乎产生其它核形态类型之一的封闭核(enclosed nuclear) 0原始钟形核和属于不同形态类型的核的所述产生是不对称核分裂的首次直观显示。本文揭示在涉及钟形核的不对称无丝分裂细胞分裂中不同于钟形核的异形核形态类型的出现，以清楚确定具有不同于具有钟形核的细胞表型的异形核形态类型的细胞。不对称核分裂被广泛视为正常发育过程中干细胞必需具备的特征。对于胎儿组织、肿瘤前期和瘤形成所共有的核形态类型的发现与一个假说有关，即，肿瘤是胎儿表型，尤其形成具有诱导分化的细胞表型的克隆群的干细胞的再表达。如今，如本文中所述，除核形态类型外，还发现了干细胞独有的另一特征。干细胞和含有干细胞核的合胞体在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下的荧光提供了一种快速鉴别和计数细胞和组织样品中的干细胞/合胞体的方式。在本发明一个实施例中，在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下荧光干细胞/合胞体的检测将根据样品的组织来源，指示正常、肿瘤前期、瘤形成或转移组织。在另一实施例中，在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下荧光干细胞/合胞体的存在指示肿瘤前期或瘤形成。在特定实施例中，适用于本文中所述的方法的组织/肿瘤样品是通过手术切除获得。通常，在利用非荧光试剂，诸如本文中所述的含希夫碱的富尔根染色剂作进一步处理之前，以物理方式，或者例如用包含甲醇和乙酸的固定剂卡诺依氏固定液以化学方式固定样品。固定应在手术固定后30分钟内进行，在此时间后会观察到细胞的钟形核降解。 通常，通过组织浸软和扩散来部分解离组织/肿瘤样品的细胞。在本发明的特定实施例中， 使用荧光显微镜检术来检测干细胞/合胞体。(缩写符号“干细胞/合胞体”在本文中不仅用于描述干细胞，而且还描述包含干细胞核的合胞体，尤其是含有钟形核的细胞和合胞体。)在另一实施例中，本发明针对一种表征组织样品的发育或病理阶段的方法，其包含在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下，检测荧光干细胞/合胞体。在一个实施例中，发育阶段选自由以下者所组成的群组胚胎、胎儿、新生儿、幼年和成年发育阶段。此外，检测荧光干细胞/合胞体可以鉴别出指示特定发育或病理阶段，诸如肿瘤前期或瘤形成的大分子标记物。所述标记物可以是抗原、细胞表面标记物、核酸、蛋白质、磷酸化蛋白质、葡糖胺聚糖或代谢物。在另一实施例中，可以发现与钟形核缔合的发荧光的球状结构是蛋白质合成和或转译后加工的位点，例如细胞质结构。本发明的其它实施例包括鉴别抑制干细胞增殖的药剂的方法。所述方法的步骤包括用候选药剂处理包含干细胞或含干细胞核的合胞体的培养组织或细胞样品；测定在培养的肿瘤或细胞样品中在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下荧光干细胞，或在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下含干细胞核的荧光合胞体的存在和/或强度或数量；和将用候选药剂处理的培养物中细胞或合胞体荧光的存在和/或强度与未经候选药剂处理的培养物中荧光干细胞或含干细胞核的合胞体的存在和/或强度或数量相比较，其中荧光干细胞或含干细胞核的合胞体的数量或强度减小，或其增加停止(例如，其中细胞数量不降低，也不增加，也就是说，其保持基本上稳定的数量)指示这种药剂可有效杀死或抑制干细胞增殖。另一实施例包括鉴别抗肿瘤发生剂的方法，其包含用候选药剂处理培养的肿瘤组织或细胞样品；测定培养的肿瘤或细胞样品中在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下荧光干细胞，或在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下含干细胞核的荧光合胞体的存在和/或强度或数量；以及将用候选抗肿瘤发生剂处理的培养物中的细胞或合胞体荧光的存在和/或强度与未经候选抗肿瘤发生剂处理的培养物中细胞或合胞体荧光的存在和/或强度相比较，其中荧光干细胞或含干细胞核的合胞体的数量或强度减小将指示抗肿瘤发生剂有效。本发明另一实施例包括鉴别抑制干细胞增殖的药剂的方法，其包含用候选药剂处理测试哺乳动物；测定从哺乳动物获得的样品中所含在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下荧光干细胞，或在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下含干细胞核的荧光合胞体的存在和/或强度或数量；以及将从候选药剂处理过的哺乳动物获得的细胞或合胞体荧光的存在和/或强度或数量与从未用候选药剂处理的哺乳动物获得的细胞或合胞体荧光的存在和/或强度相比较，其中发荧光的干细胞或含干细胞核的合胞体的数量或强度没能增加将指示这种药剂可有效抑制干细胞增殖。还涵盖鉴别抗肿瘤发生剂的方法，其包含用候选药剂处理具有肿瘤的哺乳动物； 测定从哺乳动物获得的肿瘤样品中所含在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下荧光干细胞，或在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下含干细胞核的荧光合胞体的存在和/或强度；以及将从用候选抗肿瘤发生剂处理的哺乳动物获得的细胞或合胞体荧光的存在和/或强度或数量与从具有肿瘤但未经候选抗肿瘤发生剂处理的哺乳动物获得的细胞或合胞体荧光的存在和/或强度相比较，其中荧光干细胞或含干细胞核的合胞体的数量或强度减小将指示抗肿瘤发生剂有效。根据这些先前未识别的细胞在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下的荧光、核形态类型、核分裂模式和/或多核结构中的涉及，将正常和肿瘤组织中这些细胞特异性鉴别为干细胞的本文中所述方法的价值很明显。所述方法使得可能特异性识别干细胞以及其它胎儿和肿瘤特异性核形态类型，允许对其进行分离和研究，并提供其在多项测试中的应用以便发现众多似乎合理的癌症预防或治疗方案中哪些是有效的。本文中所述的方法也提供发现用于人体组织和器官的再生和移植疗法(例如组织修复疗法)中的特定干细胞的方式。


本专利或申请案件中至少一个附图是以彩色绘制。在提出申请并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开案的复本。图1显示人胚胎肠组织、正常结肠粘膜、腺瘤和腺癌的分裂间期和早前期(earlypr0phaSe，E.P.)细胞中所观察到的核形态类型。*在成体结肠上皮隐窝中很少观察到钟形核。比例条,5 μ m。图2A-2C显示胚胎肠组织的显微图像。图2A显示在低放大倍数(140X)下观察的 5到7周的胎儿肠组织，其中显示了染色的核(左侧图像)以及不同肠组织切片的相差/荧光图像(右侧图像)。明显非球形的核以线性次序布置(由虚线指示)，其在相差图像中表示为“管状”结构。这些管状结构看起来遍及利用各管间散布的其它细胞组而观察的肠组织切片。图2B显示重叠的相同肠组织切片(右图)的相差图像(左图)和染色的核的图像 (中图)，其显示核的明显线性定向实际上受管状结构或合胞体束缚，所述管状结构或合胞体自身的直径为约50微米。将核放大O80X)(中图)显示，这些非球形的核看起来呈杯或钟的形式。图2C显示呈线性阵列的核的放大图像(1400X)。这些排成阵列的核呈现明显中空的可再生钟形形状。据观察，所有的胚胎管中都保留这些钟的“头到脚(head-to-toe)，， 定向，但管向后和向前弯曲延伸，以致平行的管可呈现局部反平行的钟形核定向。比例条， 在低放大倍数下100 μ m，而在高放大倍数下5 μ m。图3A-3F显示具有钟形核的胚胎肠组织的无丝分裂。图3A 对称无丝分裂一个钟形的核明显从一个钟形的核显露出来。观察到多种钟形的形态类型，但其无丝分裂显示出难分辨的钟形形态特征，诸如，这三个实例中所示的钟口宽度/长度比率；图3B 不对称无丝分裂实心核形式明显从钟形核内显露出来。在所示4个图像中，可以看出在钟的深处形成球形的凝集核，并且在完全分离之前，明显显露出通过核质连接到钟；图3C 从钟形核的口出来球形的未凝集核；图3D:从钟显露出蛋形(“卵形”)核；图3E:从钟显露出豆形 (“肾形”)核；图3F 从钟显露出雪茄形核。比例条，5μπι。图4A-4C显示正常的成体结肠隐窝。图4Α显示具有约2000个球形和卵圆形核且在隐窝底部偶尔(< 1/100)含有可识别的钟形核(左下角的箭头所示)的隐窝(右角放大的核图像)。图4Β显示隐窝基底部，其具有基底部特有的其它核形态类型中的另一钟形核。图4C显示充分扩散隐窝中壁和内腔表面的分裂间期和有丝分裂核的各种形态类型。放大的图像显示(i)分裂间期的球形和卵圆形核；(ii， )早前期的球形和卵形核；和(iv) 后期末期(anatelophase)的核。比例条，在低放大倍数图像中100 μ m，而在高放大倍数图像中5 μ m。图5A-5E显示放大的腺瘤图像。图5A显示腺瘤的大分支隐窝特征。隐窝基底部和内腔开口以类似于正常结肠切片的方式规则布置。图5B显示在整个腺瘤样品中都观察到的不规则的类隐窝结构(crypt like structure) 0在这些大(> 4000个细胞)的不规则隐窝的基底部通常存在2个，但有时1个、4个或甚至8个钟形核(见插图)。图5C显示含有一个钟形核的类似核形态类型细胞群集。这些简单群集含有总计16、32、64和1 个细胞。左图富尔根吉姆萨染色(Feulgen Giemsa stain)。右图相差荧光图像。图5D说明腺瘤中存在钟形核的不同情形(i)具有31个卵圆形核和1个钟形核的群集；(ii)呈“肩并肩(shoulder-to-shoulder)”布置的多个钟形核；(iii)在较大的“圆”中以“肩并肩”模式(箭头)布置的钟形核；(iii)约250个核的不规则混合物，其中数个代表新生隐窝基底部的钟形核被发现分散在整个腺瘤中。图5E显示明显含有细胞克隆斑块的不规则类隐窝结构，这些细胞具有5种不同的核形态类型，其中在基底部具有1个钟形核(箭头)。比例条，在低放大倍数图像中100 μ m,而在高放大倍数图像中5 μ m。
图6A-6C显示放大的腺癌图像。图6A显示极大的类隐窝结构(> 8000个细胞)， 其中各分支中常见断点。这些结构的基底部与正常结肠隐窝的基底部难以区分，但在腺瘤中存在两个(通常)钟形核。在腺癌中未观察到腺瘤中保留的基底部到内腔定向的类隐窝结构，在腺癌中，隐窝的定向似乎是随机的。箭头指示常见于肿瘤表面附近的约250个细胞的较小的类隐窝结构。图6B显示在整个肿瘤内部发现的肩并肩的钟形核群组。图6C显示内部肿瘤块，以及局部以肩并肩和头到脚配置定向的钟形核的多个实例。对于类隐窝结构，头到脚定向只见于肿瘤内部，肩并肩定向见于肿瘤内部和肿瘤表面附近。在肿瘤内部， 钟形核占所有核的约0.2%。比例条，在低放大倍数图像中100 μ m，而在高放大倍数图像中 5 μ m0图7A-7E是描述腺癌中无丝分裂的放大图像。图7A显示在不规则隐窝中的对称无丝分裂，其产生具有不同形态类型的两个钟形核。左侧图像中的箭头指示新产生的核的钟的底部。图7B显示不对称无丝分裂，其产生球形核。图7C显示不对称无丝分裂，其产生卵形核。图7D显示对称无丝分裂，其形成“雪茄”形的核；图7E显示不对称无丝分裂，其产生“香肠”形核，其中在钟形核凸缘处奇特的深色染色元件(上部箭头)不同于看似是凝集染色体者。比例条，5 μ m。图8 (a)-(1)显示经富尔根DNA染色的人结肠上皮细胞的核a、b 肠组织的钟形核；c 结肠腺瘤的钟形核；d 肠组织中钟形核的对称核分裂；e 不对称核分裂；f 结肠腺癌中的不对称核分裂(从钟形核显露出来凝集的球形核)；g:在正常外观的隐窝底部的钟形核(箭头)；和h 腺瘤整个“初期”隐窝的钟形核；i 肠组织中核形态类型的多样性。细胞扩散中以箭头指示的雪茄形核是从腺瘤(k)和结肠腺癌(1)获得。“j”中显示球形核，其为成体正常结肠隐窝特有的。比例条尺寸为5 μ m。图9(a)_(b)显示关键图像的概述，(a)在人胎儿肠组织、正常结肠粘膜、腺瘤和腺癌的分裂间期和早前期(E. P.)细胞中所观察到的核形态类型的实例。(在成体结肠中很少观察到H-钟形核)，(b)胎儿肠组织的钟形核的高分辨率图像(1400X)。凝集的DNA看起来产生保持到中空的钟结构中的开口的环。比例条，5 μ m。图10(a)_(b)显示5到7周的胚胎肠组织的切片(a)相差图像(左图)以及染色的核图像(中图)和合并的图像(右图)，显示了在约50微米直径的管状合胞体内核的线性阵列；(b)核的高分辨率图像显示出中空钟形结构。据观察，所有的胚胎管中都保留这些钟的头到脚定向，但管向后和向前弯曲延伸，以致平行的管可呈现局部反平行的钟形核定向。比例条，在低放大倍数下50 μ m,而在高放大倍数下5 μ m。图11 (a)-(d)显示胎儿肠组织中钟形核的核分裂。a、b 对称核分裂从类似形状的钟形核显露出来钟形核；c、d 不对称核分裂从钟形核显露出来球形核和雪茄形核。比例条，5 μ m。图12(a)_(c)显示正常成体结肠隐窝(a)具有约2000个扁球形、球形或扁圆形核的隐窝，其中在隐窝的底部偶尔(< 1/100)含有可识别的钟形核(箭头)；(b)显示另一钟形核的隐窝基底部；(C)在充分扩散隐窝中壁和内腔表面的分裂间期和有丝分裂核的形态类型。放大的图像显示[i]分裂间期的球形和卵形核；[ii、iii]早前期的球形和卵形核；和[iv]后期末期的核。比例条，在低放大倍数图像中100 μ m，而在高放大倍数图像中 5 μ m0
图13 (a)-(e)显示腺瘤，(a)腺瘤的特征性大分支隐窝；(b)见于整个腺瘤中的不规则类隐窝结构。在这些大(> 4000个细胞)的不规则类隐窝结构的基底部通常存在2 个，但有时1个、4个或甚至8个钟形核(插图)；(c)具有含1个钟形核的类似核形态类型的细胞群集。这些群集形式确切地含有总计16、32、64和1 个细胞。左图富尔根吉姆萨染色。右图，相差荧光图像。(d)腺瘤中出现钟形核的情形(i)具有31个卵圆形核和1 个钟形核的群集；(ii)呈肩并肩布置的多个钟形核；(iii)以并排模式布置的钟形核(箭头)；(iii)约250个核的不规则混合物，其中数个钟形核代表新生的隐窝基底部。(e)明显含有细胞克隆斑块的不规则类隐窝结构，这些细胞具有5种不同的核形态类型，其中一个钟形核[箭头]在基底部。比例条，100 μ m( “a、b”中)和5μπι( “e”中)。图14(a)_(e)显示腺癌，(a)极大的类隐窝结构(> 8000个细胞)，其中各分支中常见断点。箭头指示主要见于肿瘤表面附近的具有约250个细胞的类隐窝结构的实例。 (b)具有多个钟形核(在所有核形态类型中占2X10—3)的内部肿瘤块。(c)在(b)中以头到脚定向的钟形核，合胞体和非合胞体并排配置。(d)腺癌中的对称核分裂。(e)腺癌中钟的不对称核分裂，产生雪茄形核。在结肠到肝的转移中曾观察到类似结构。比例条，5μπι。图15(a)_(d)显示以下人体组织中揭示的钟形核(富尔根DNA染色呈紫色)的形态类型相似性(a)胚胎肠组织；(b)结肠腺癌；(c)结肠肿瘤的肝转移；(d)胰腺肿瘤。在来自胰腺肿瘤的所有钟形核中都观察到在“d”中钟的下半部分中所见的凝集染色质条纹， 但在结肠肿瘤中完全观察不到。标尺，5 μ m。图16显示利用本文中揭示的组织学程序(富尔根染色)容易检测到的钟形核，而利用显微切片机产生5微米切片的标准组织学程序(苏木精和伊红染色(H&E))很难检测到(迄今为止只有一例)。相同肿瘤，在切除的30分钟内固定左图钟形核产生在含有多个不对称分裂细胞(箭头状物)的胰腺肿瘤边缘以集落形式存在的雪茄形核(左侧100X 放大的图像)。中图迄今为止发现的在标准组织切片的载片上可见到并置的钟形和卵形核的唯一实例，其表明当前的不对称核分裂。看起来，钟形核的染色质链仍使其连接至卵形核(箭头)。右图显示这一解释说明的原始图形的草图。图17(a)_(b)说明应用荧光素原位杂交(FISH)研究肿瘤中非分裂和分裂的钟形核的“所关注的目标”:(a)染色质，染色较深，因为核中每平方微米DNA的浓度较高，使得产生作为钟形形态类型的一部分的独特结构，类似于布置成两个平行的圆的前期染色体。放在图(上部)中的这些圆说明，预计在结肠肿瘤中钟形核的这一特定位点可能发现特定染色体；(b)如在整个钟形核的不对称分裂中发生虚拟变换(此处，钟形核变为卵形核)时染色质分布和特定染色体位置的变化。图18(a)_(d)显示TK 6人体细胞球形核中染色体11荧光原位杂交的结果。(a) 前期染色体扩散时的两对染色体，(b)球形核二脒基苯基吲哚(DAPI)核染色，(c)与FITC 荧光探针杂交的相同染色体对，(d)合并的DAPI与FITC分裂间期染色体染色图像。图I9显示利用激光压力弹射系统(laser pressure catapulting system)( “激光压力显微解剖(laser pressure microdissection)”)收集的钟形核作为“目标”。左上图位于耦合至显微镜的脉冲紫外线(UV)A激光前面的带有细胞扩散的载玻片。左下图 经由显微镜可以看到单一核，如视野中具有钟形核的结肠肿瘤组织的细胞扩散所示；右图 在未染色的载玻片中具有可识别的钟形态类型的相同核。
图20显示，在人胎儿上皮细胞中，每一个钟形核都与不含DNA的发明亮荧光的球状细胞质结构相缔合。图中显示了 12周的人胎儿结肠组织。合胞体在胎儿约12周时消失 (器官形成结束)。钟形核分布于整个生长的组织中。图21显示，胎儿上皮组织随后与仅借助荧光易于识别的这些细胞形式组织在一起。在本实例和其它实例中应用乙酸乙醇固定液和富尔根试剂。显示的人胎儿小肠绒毛 (9周)展现如本文中所述的富尔根(绿色)荧光。图22显示人14到16周的胎儿丢弃物的小肠绒毛中钟形核和荧光“球”的分布。 这些与钟形核物理缔合的发出明亮荧光的球结构在整个人胎儿上皮细胞以及所有检查的组织来源的腺癌中都能发现(参看实例5)。图23显示从怀孕9周的人胎儿脑得到的发明亮荧光的合胞体的图像，所述合胞体各含有钟形核。应注意，合胞体是布置成多个合胞体的聚集体，并且多个聚集体非随机地分布于脑中，如在来源于内胚层、中胚层或外胚层的其它发育组织中一样。在这些制剂中未添加荧光材料，只在手术取出后利用乙酸乙醇简单地固定，随后用富尔根试剂处理。图24A(左上图)显示胎小鼠肠的明视野(非荧光)的图像，其显示个别钟形核， 其中富尔根染色剂使DNA呈紫色，并将钟形结构鉴别为核。图中上图)显示与图24A(左上图)相同的视野，但现显示亮荧光吞没各钟形核。在这些制剂中未添加荧光材料，只在手术取出后利用乙酸乙醇简单地固定，随后用富尔根试剂处理。图MC(右上图)显示与图24A/24B(左上图、中上图)相同的视野，但现显示重叠图像，展现钟形核被包入合胞体中。在这些制剂中未添加荧光材料，只在手术取出后利用乙酸乙醇简单地固定，随后用富尔根试剂处理。图左下图)显示胎小鼠脑中钟形核的相差图像，其通过无丝分裂的不对称核分裂产生球形核。图ME(中下图)显示来源于胎小鼠肌肉的培养的细胞株中钟形核的图像，其通过无丝分裂的不对称核分裂产生球形核。当利用带有透射光的标准显微镜检术(即，不使用荧光显微镜检术)观察时，富尔根染色剂使DNA呈紫色，并且将钟形结构鉴别为核。图MF(右下图)显示发育的胎小鼠器官中荧光合胞体的聚集体，其中钟形核由富尔根试剂染色成紫色。图25A(左上图)显示在人12周胎儿的小肠中形成合胞体聚集体的发明亮荧光的合胞体，其各含有多个钟形核。在这些制剂中未添加荧光材料，只在手术取出后利用乙酸 乙醇简单地固定，随后用富尔根试剂处理。图25B (右上图)显示在低放大倍数下可见的人14周胎儿的小肠中发明亮荧光的球状结构。在这些制剂中未添加荧光材料，只在手术取出后利用乙酸乙醇简单地固定，随后用富尔根试剂处理。个别荧光结构图像的强度和清晰度足以允许自动扫描组织和肿瘤制剂中干细胞的存在并加以计数。图^A(左图)显示明视野(非荧光)的较高放大倍数的图像，其显示了经历对称核分裂的多核合胞体内胎儿组织的个别钟形核，其中富尔根染色剂使DNA呈紫色，并且将钟形结构鉴别为核。图^B (右图)显示与图^A(左图)相同的视野，但现显示亮荧光材料吞没各钟形核。应注意与肌动蛋白肌球蛋白的肌节布置分开适当距离的合胞体壁的条纹，其将合胞体壁鉴别为包含肌肉收缩要素(contractile element)。合胞体荧光图像的强度和清晰度足以进行自动载玻片扫描来检测所述合胞体。在这些制剂中未添加荧光材料，只在手术取出后利用乙酸乙醇简单地固定，随后用富尔根试剂处理。图27A(左图)显示的高分辨率图像展现在14周人胎儿的发育的小肠中与钟形核紧密缔合的球状结构的强荧光(绿色)。图27B (右图)显示的高分辨率图像展现在14周人胎儿的发育的小肠中与经历无丝分裂的不对称核分裂的钟形核紧密缔合的球状结构的强荧光(绿色)。应注意，得到的 “子弹形”核在此阶段被密封于荧光球状结构中。图观是如本文中所述体外培养并且也如本文中所述经过固定并用富尔根染色剂染色的HD9人结肠腺癌细胞系的照片。显示了在标准透射光显微镜检术下观察到的培养的HD9细胞的显微图像以及使用荧光显微镜检术观察到的相同细胞视野。在总计约1到 10X10-4个HD9细胞中发现具有钟形核的细胞的荧光球状结构。图四和图30是如本文中所述培养和染色的HD9的高分辨率照片。左侧的照片显示利用标准透射显微镜检术观察的细胞，并且说明核染色呈紫色(注意钟形核)。右侧的照片是使用荧光显微镜检术观察的相同细胞。可以看出，发出强荧光(绿色)的球状结构与偏核HD9细胞紧密缔合，但与钟形核分开。
具体实施例方式本发明涉及一项超出预期的发现，S卩，通过用诸如常用富尔根试剂中存在的希夫碱品红等试剂处理，将使固定的手术试样和细胞培养物中的偏核干细胞和含不同钟形干细胞核的合胞体发出强烈荧光。由于所述荧光是在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下产生，使得在检测手术样品中肿瘤干细胞时，其不会碰到如在自动扫描中的背景荧光一般的问题。这些干细胞和合胞体存在于整个胎儿肠组织(5到7周)、结肠腺瘤和腺癌中， 而在正常(非瘤形成性)成体结肠上皮隐窝中很少发现。在胎儿组织中观察到这些“异形的核形态类型”(例如，与成体器官中正常的扁球形或卵圆形细胞核不同的核形态类型)，但这在成体组织中不太常见。一种值得关注的核形态类型是形状类似中空的钟的核(高度约 10到15微米，钟口直径为约7到12微米)。这些钟形结构在无丝分裂过程中发生对称分裂，类似于分离两个纸杯。值得注意的是，如本文中所述，当用富尔根试剂中发现的非荧光希夫碱品红(在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下)处理用乙酸乙醇固定的试样时，与球状细胞质结构物理缔合的钟形核呈现强烈的荧光。此外，含有干细胞核(例如钟形核)的合胞体在相同的固定和富尔根试剂处理过程后，也发出荧光。已发现，在用卤素灯提供的光激发后，这些球状细胞质结构和合胞体发出荧光。荧光性是某些原子和分子的特性，其吸收特定波长的光，随后发射较长波长的光。球状细胞质结构和包含钟形核的合胞体发荧光(在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下)的观察结果，允许快速鉴别出具有钟形核的细胞。因此，这些干细胞/合胞体的荧光特性允许在可用于表征组织样品(例如瘤形成、肿瘤前期样品)或组织样品的发育阶段(例如胎儿)的方法中对其进行检测。如本文中所述，荧光干细胞或合胞体是在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下发荧光的干细胞或合胞体。可以只在固定(例如，使用卡诺依氏固定液；3 1的甲醇-冰乙酸；6 3 1的乙醇-氯仿-乙酸；3 1的乙醇-乙酸等)后，通过某种程度的自发荧光来检测含有干细胞的荧光合胞体。荧光干细胞和合胞体可以在固定(例如，使用卡诺依氏固定液；3 1的甲醇-冰乙酸；6 3 1的乙醇-氯仿-乙酸；3 1的乙醇-乙酸等)和进一步用非荧光试剂(例如，希夫碱试剂、富尔根染色剂、品红等)染色后， 通过强烈荧光来检测。因此，在一个实施例中，当用卡诺依氏试剂固定时，怀孕约4周到13 周的人体器官和人体肿瘤中含有钟形核的管状合胞体在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下呈现出适度的荧光。在另一实施例中，用卡诺依氏试剂固定并进一步用富尔根试剂染色的怀孕约4周到13周的人体器官和人体肿瘤中含有钟形核的管状合胞体产生的具有钟形核的管状合胞体呈现出强烈荧光。在另一实施例中，钟形核所连接到的较大球状细胞质实体在简单的卡诺依固定后不发荧光，而球状细胞质在与富尔根染色剂反应后会发出惊人的荧光。在从第15周开始发育的人体器官中已经观察到这些发出强烈荧光的球状细胞质，并且在第12周到第14周中包含几乎所有具有钟形核的实体。对于人肿瘤前期病变(诸如结肠息肉)和多钟人体肿瘤，也能观察到此情形。在钟形核指示特定发育阶段(例如胎儿组织)的情况下，例如，通过检测在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下的荧光性，鉴别与钟形核缔合的球状结构和/或合胞体，也可指示特定发育阶段。另外，对于根据解剖位置和质量(mass)而疑似有肿瘤发生可能性的病变的活组织检查，检测与钟形核缔合的球状结构/合胞体将指示瘤形成或肿瘤前期。此外，据观察，在相同胎儿器官、肿瘤前期或瘤形成病变中，具有钟形核的细胞不对称分裂产生数种其它形式的核形态类型，故这些细胞是多能的。由于多能性是干细胞的特有特征，故检测与钟形核缔合的球状结构允许快速筛选细胞以供鉴别和分离干细胞。此项技术中已知用于检测和分离具有此类球状结构的细胞的方法，例如根据具有这些球状结构的细胞的荧光进行分选和分离的方法。以此方式从非瘤形成组织中分离的细胞在例如再生组织疗法和创伤愈合中具有巨大的潜力。除上述钟形核外，观察到在不对称无丝分裂中，还从钟形核显露出来至少7种其它核形式。随后，在胚胎、腺瘤和腺癌中，含有这些衍生核形式的细胞发生有丝分裂，由此分裂形成具有相同核形态类型的克隆群。因此，具有钟形核的细胞负责胚胎肠组织、腺瘤和腺癌中的净生长和分化，并满足胎儿器官形成和癌形成中对于生殖性的(generative)多潜能干细胞的需求。胎儿/幼体组织样品中理论上净干细胞生长和分化所需的细胞(展现对称和不对称无丝分裂)中钟形核与成体组织中相比的特定差异，使得显微组织学/病理学领域技术人员能够根据核形态将细胞归类为干细胞或非干细胞。胚胎学与肿瘤学中共有的观念是，在器官和源于特定器官的肿瘤中观察到的多种细胞类型是由前体“干”细胞而引起，后者能够通过对称细胞分裂(其中细胞分裂产生两个相同的前体“干”细胞)进行净生长，并通过不对称细胞分裂(产生一个前体“干细胞”和一个分化的细胞)进行分化。随后，这一分化的细胞可再分裂多次，产生大量分化的细胞， 最终达到非分裂终期，接着进入程序性细胞死亡。当一个细胞分化成两个分化程度更高的细胞时，发生“衰减(extinction)”分裂。术语“干细胞”在科技文献中具有许多不同层面的定义。一般说来，这一术语是指包含保持未分化或部分分化的表型，但在某些情况下可产生具有不同表型的细胞的细胞集合。基于科学的观察，包含本文中揭示的教示，本文中使用的通用术语和更特定的术语可区分各种类型的干细胞。本文中使用的术语“胚胎干细胞”包含在早期哺乳动物胚胎中的细胞集合，其通过正常的有丝分裂过程分裂，并且在移植到子宫环境中后，可以产生完整的胎盘和胎儿。因此，其特征为“全能”。这类细胞可离体培养，通过有丝分裂过程分裂，形成极大量的胚胎干细胞，这些胚胎干细胞各自能够产生胎盘和胎儿。人们尚不了解是否任何胚胎干细胞都在生长的哺乳动物胎儿、新生儿、幼年或成年动物中持久如此。在成年哺乳动物的整个组织中发现的某些未分化的细胞群集可能代表着全能胚胎干细胞集落。对于核形态类型，这一干细胞形式含有球形或接近球形的核，而不是钟形。本文中使用的术语“胎儿幼体干细胞”包含在怀孕5周的人类胎儿中和含有钟形核的人肿瘤前期、瘤形成和转移病变中观察到的细胞和多核合胞体集合。本文中使用的“合胞体”是缺乏细胞隔膜的多核结构。合胞体内存在多个核，但这些核没有经由膜隔离成独立的区室。胎儿幼体干细胞经历对称核分裂，产生两个相同的钟形核，也经历不对称核分裂， 产生一个钟形核和一个呈组织和肿瘤样品中所观察的数种异形核形态类型之一的核，所述数种异形核形态类型诸如为肾形、雪茄形、香肠形、卵形或球形核，其数量随后会经有丝分裂而增加。在钟形核中的基因组未一般性凝集为染色体的情况下，钟形核的对称和不对称核分裂都是无丝分裂。人们经过上百年的观察且先前曾相信，在前期、中期、后期和末期中形成有丝分裂纺锤体，并经历染色体浓缩或分离，是除卵子发生和精子发生的减数分裂外， 哺乳动物细胞(包括哺乳动物肿瘤)中唯一相关的核分裂形式，但钟形核并非如此。对称分裂允许胎儿幼体干细胞净生长，并且可能会引起整个胎儿、新生儿和幼年生命阶段中组织和器官生长。胎儿幼体干细胞的不对称分裂允许产生具有变换的表型的细胞，并且可能会产生包含发育和生长的器官的实质的分化细胞类型。在核形态类型是细胞和/或核的一个可识别的特征的情况下，核形态类型不同的细胞可以细胞或核表型不同为特征，无需提到除核形态类型外的特征。本文中使用的术语“再生干细胞”包含在胎儿、幼体和成体组织中处于休眠状态直到需要再生一部分受损伤或疾病破坏的组织或器官的理论细胞形式。人们还不了解，必然会预期为对称和不对称分裂的再生干细胞分裂的性质是属于有丝分裂还是无丝分裂。本文中使用的术语“维持干细胞”包含通过规则的不对称细胞分裂产生第一个过渡型细胞(transitional cell)，随后经历有丝分裂，并最终进入程序性细胞死亡的理论细胞形式，其定义了分化细胞组织的分化的转换单元(turnover unit)，诸如结肠隐窝。转换发生于胎儿和幼体组织中，但预期每一转换单元的维持干细胞都是钟形的，并且对称分裂产生新的胎儿幼体维持干细胞，以代替程序性细胞死亡过程中损失的幼体细胞。成体维持干细胞的不对称分裂也会产生分化的过渡型细胞(非干细胞)和新的成体维持干细胞。因为所观察的结肠隐窝中很少具有在隐窝基底部观察的胎儿幼体干细胞特有的钟形核，所以可以合理地得出结论，胎儿幼体干细胞核经历形态变化(metamorphosis)，标志着幼体器官净生长的停止和成体生命阶段的开始。还不了解成体维持干细胞的不对称分裂的性质是属于有丝分裂还是无丝分裂。本文中使用的术语“肿瘤前期干细胞”描述了包含在带腺瘤的结肠隐窝基底部中所观察到的钟形核的单核细胞。观察到的这些细胞呈具有相同核形态类型的细胞的小聚集体、这些聚集体的大群集(其中产生群集的每一聚集体含有相同形态类型的核，且不同聚集体含有不同形态类型的核)以及结肠肿瘤前期病变的亚区的形式。这些细胞的核可呈 “肩并肩”关系布置。在人结肠肿瘤前期病变中未观察到含有钟形核的合胞体，而且在对称核分裂过程中也没有观察到个别钟形核，可认为这一情形与肿瘤前期病变近似地以发生病变的幼体组织的生长速率缓慢生长(即，约6年到9年的倍增时间)一致。本文中使用的术语“瘤形成干细胞”或“肿瘤干细胞”包含在例如人结肠腺癌、结肠肿瘤转移以及人胰腺、肺、乳房和卵巢肿瘤等癌性肿瘤中所发现的钟形核。这些瘤形成干细胞是由所有观察的肿瘤前期多细胞聚集体中存在的肿瘤前期干细胞分化产生，除此之外，在多核管状合胞体中也可发现。据观察，瘤形成干细胞发生无丝分裂核分裂，经历对称的“杯与杯”过程以及不对称分裂过程，在不对称分裂过程中，从钟形核在合胞体内和合胞体外显露出来异形核。肿瘤中所发现的合胞体的量低于在早期胎儿肠组织中所观察的合胞体量，但经历对称核分裂的合胞体和钟形结构看似是肿瘤前期组织与瘤形成组织之间明显有区别的特征。在来源于例如培养中生长的组织样品或细胞的细胞和合胞体中，也可以发现异形核形态类型。本文中所述的方法可用于任何组织样品，以鉴别含有异形核形态类型的细胞或合胞体。具体点说，可以使用肿瘤组织样品来鉴别和计数异形核形态类型。本文中使用的“肿瘤”是指由不具有生理功能但有益于载体的细胞渐进性倍增所引起的组织异常生长(也称为“瘤形成”)。“良性”肿瘤是局限于初始部位，不会侵袭周围组织的肿瘤。恶性肿瘤是通过侵袭周围组织可以或实行扩散并且转移的肿瘤，而良性肿瘤不具侵袭性，也不会转移。本文中使用的“瘤形成性”是指快速净细胞生长产生致死性肿瘤 (良性或恶性)的细胞状况。瘤形成细胞会导致肿瘤，但未必是侵袭性或转移性肿瘤。“癌症”是指一个或一个以上快速生长的细胞集落通过干扰身体功能而引起死亡的疾病。癌细胞可脱离原发性肿瘤，透入淋巴管和血管中，经由血流循环，并且在身体其它地方的正常组织中新的部位生长(转移)。本文中使用的“癌前病状”是以缓慢生长的集落为特征，如果这一集落不加抑制， 就可能引起癌症(例如，瘤形成性肿瘤)。这一病状的特征在于，例如一个或一个以上异常显微解剖结构的存在，诸如结肠中的息肉，或成体组织样品内的钟形核。“净干细胞生长速率”是引起组织、器官或生物体净生长的对称胎儿幼体干细胞分裂的速率(每单位时间的分裂次数)。一般说来，随着整个胎儿、新生儿和幼体生命发育的增加，成体中干细胞的净生长速率会降低到零。肿瘤会展现产生肿瘤的成体器官/系统的许多特征，包括形成复杂的多细胞结构，诸如结肠腺癌中的结肠隐窝。在肿瘤是来源于能够净生长和分化的单一前体细胞的情况下，可以推断出，“肿瘤干细胞”必定存在和共有器官特异性干细胞(能够产生特定器官细胞和组织的部分未分化细胞)的许多特征。举例来说，在引起白血病的骨髓细胞的情况下， 已经识别出能够鉴别某些骨髓细胞亚群的某些抗原，这些骨髓细胞亚群含有一个或少量能够在移植后产生完整血细胞系统的细胞。类似地，可以借助由一些肿瘤细胞所表达的特异性抗原来识别肿瘤细胞的亚组分(subfraction)。根据这一逻辑，在实验性移植肿瘤细胞混合物后，由此识别的亚群中的一个细胞就将产生新的分化肿瘤。继续这一推论，“器官特异性干细胞”和“肿瘤干细胞”存在于表达所述抗原的亚群中。这些抗原可用于鉴别和分离含有至少一个多能干细胞的细胞群，同时也可鉴别大多数不能充当干细胞的细胞。所分离的这些细胞群中的细胞均未发现经历不对称细胞分裂，而不对称细胞分裂被视为真实干细胞或器官和肿瘤的“口令(shibboleth)”。此处提供鉴别事实上是“器官特异性干细胞”或“肿瘤干细胞”的细胞的方法，这些细胞与富集所述细胞的器官或肿瘤的亚组分相对。所述鉴别是基于本文中所述的荧光和异形核形态类型以及核分裂和/或布置。利用这些方法，将有可能分离出这些干细胞并发现其特定生物化学和分子生物学，以在尝试疗法后，达到分离允许器官再生的细胞、干扰癌前病变的生长和/或杀死对肿瘤生长和复发特别有责任的细胞的目的。荧光球状结构与钟形核缔合可例如允许在不存在外源荧光团的情况下鉴别和分离干细胞，因为这些结构本身在用适宜波长的光激发后将发出荧光。由于所述器官特异性细胞和肿瘤干细胞是作为一种类别参与两种先前未报导的显微镜可见的特定核分裂形式，使得进一步鉴别出胎儿器官、肿瘤和肿瘤转移中的这些细胞。在这两种核分裂形式的第一种中，不会发生一般性染色体浓缩和有丝分裂器形成；而是一个钟形核似乎以类似于分离两个纸杯的方式，产生相同的钟形核。这一对称的无丝分裂式分裂将使胎儿和肿瘤样品中的干细胞净生长。在第二种干细胞特异性核分裂形式中，也不会发生一般性染色体浓缩和有丝分裂器形成；而是一个钟形核似乎产生一个钟形核，和一个呈现在胎儿组织和肿瘤样品中所观察的数种核形态类型中的一种的核(图幻。然而， 可以观察到，通过不对称核分裂显露出来的异形核如在有丝分裂前期中一般存在凝集的染色体组分。这一不对称的无丝分裂式分裂将利用胎儿组织和肿瘤中的干细胞产生分化的细胞。在胎儿组织和肿瘤样品中可观察到有丝分裂式核(不包括钟形核)分裂，产生这些样品中总细胞的大多数细胞。因此，鉴别干细胞的方法允许直接观察经历对称和不对称核分裂的具有钟形核的细胞，而这两种核分裂形式是分类为器官特异性和肿瘤特异性干细胞必需的。由于所述器官特异性和肿瘤干细胞作为一种类别参与先前未报导的类似于长管的特定多核结构，使得进一步鉴别出胎儿器官、肿瘤和肿瘤转移中的这些细胞，在所述特定多核结构中，钟形核呈规则排列，其排列方式类似于一系列分开的纸杯如堆叠的杯组一般保持头到脚关系。这些干细胞特异性核形态类型(钟形)、特定核分裂形式(对称和不对称无丝分裂式核分裂)和参与多核结构的特定形式(长的多核管)在成体器官中基本上见不到。然而，在肿瘤前期病变细胞中可观察到干细胞特异性核形态类型，并且很少见到其作为单一核广泛分散于成体器官中(例如，成体结肠隐窝的两百万个核中有时不到一个被发现是钟形核)。有关这些异形核形态类型以及其在干细胞、正常成体组织和肿瘤组织中存在的差异的超出预期的发现，使得所属领域技术人员能够根据其荧光或核形态对细胞分类。此外， 还可以根据荧光或核形态分离干细胞；可以根据肿瘤特异性形态类型的出现或消失来筛选或鉴别抗肿瘤发生剂；并且可以通过测定组织细胞中存在的荧光或形态类型来对组织样品分类(例如，正常或异常；瘤形成性或非瘤形成性)。利用这一细胞分类方法，可以诊断个别的潜在肿瘤前期或瘤形成病变是否是癌病变或肿瘤前期病变。尽管特定方法能够观察这些干细胞，但允许鉴别和评价荧光或核形态类型的任何方法都适用于细胞、组织和样品的分类，和后续疾病诊断，以及提供用于鉴别抗肿瘤发生剂(例如，有效抑制或降低肿瘤发生细胞生长的药剂)的分析的基础。所述方法包括(但不限于)相差显微镜检术、共聚焦显微镜检术、双电子或双波长显微镜检术、与钟形核关联的荧光结构/合胞体的直接检测和小角度散射流式细胞术(small angle scatter flow cytometry)。为本发明的目的，如下文实例中所述，制备厚约0. 5mm的正常成人结肠上皮细胞、 结肠腺瘤、结肠腺癌和胎儿肠组织切片进行显微镜观察。组织片层的厚度应至少是完整细胞(而不只是细胞切片或薄片)的厚度。图1中概括了所有样品中出现的大扁球形和非扁球形核形式的阵列。所有样品都含有在成体结肠隐窝的组织学切片常常观察到的扁球形和卵圆形核，而且还含有先前未报导的奇特的核形态类型。胚胎组织含有钟形、锥形雪茄形、 菜豆形、香肠形和小球形核。正常的成体结肠隐窝偶尔在隐窝基底部含有钟形核，但绝大多数核都是大球形和卵圆形结构。在一些观点中，似乎在隐窝基底部附近的细胞核可能是“扁圆形(discoid)”的。在腺瘤和腺癌中，除了呈扁球形和卵圆形的核外，核形状还包括锥形雪茄形和看起来像咬掉了两端的另一形式“子弹形”。利用制备程序保留隐窝结构，并且在正常结肠、腺瘤和腺癌中可明显观察到。所用约0. 5mm的样品切片比所观察的最大核形式香肠形厚得多，香肠形的长度为约40微米。除 4微米的“凝集球形核”外，所有核结构都具有至少一个比病理学评价中常用的5微米切片长的内轴。此外，还存在适度的核形态变异，其可归类为“钟形”或“雪茄形”等，表明不相关的谱系和生理功能。本文中描述的钟形核现象、其对称和不对称无丝分裂形式，或成体、肿瘤前期、瘤形成性和胚胎组织中核形态类型的集合先前都未曾报导过。胚胎和腺癌中排成线性阵列的钟形核的管状外罩(encasement)也明显是一个新颖的观察结果。先前未曾观察到这些结构的原因在于，标准组织学实践与本文中使用和论述的组织学之间存在差异。明显存在两个程序上的差异。第一，固定的所有组织都是在手术取出的较短时间内(例如30分钟内) 切片和固定的。30分钟后开始制备，可能显示核形式的降解，尽管小心进行组织制备可以防止降解。第二，医学病理学中实用的薄切片程序与本文中揭示的厚切片固定方案之间存在差异，后者保留而前者明显破坏了保持这些核形状的结构/条件。无丝分裂作为一种现象，曾在多种原生动物和原始后生动物(primitive metazoan)中有所报导(奥瑞拉(Orias，Ε. )，1991，原生动物学杂志(J. ftOtozool.)， 38 :217-221 ；普雷科特(Prescott, D.)，1994，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 92 136-140) 0然而，在原生动物发生的无丝分裂式核分裂是形成核裂缝， 并夹断成两个独立的大致相同的核的情况下，这些无丝分裂方式不像此处所报道的那样(富士 (Fuj iu, K.)和沼田(Numata，0.)，2000，细胞运动和细胞骨架(Cell Motil. Cytoskeleton),46 :17-27)。然而，在许多不同的肿瘤中曾报导过类似于在原生动物中所见的诸如此类的无丝分裂式分裂(奥山(Okuyama，S. ) 1991，东北实验医学杂志(Tohoku J. Exp. Med.)，164 :247-249 ；奥山(Okuyama, S.)，1992，东北实验医学杂志，168 :445-448 ； 艾拉斯(Elias，H.)和冯(Fong，B.)，1978，人体病理学(Hum. Pathol. ),9 :679-684 ；艾拉斯 (Elias, H.)和海德(Hyde, D)，1982，人体病理学，3 :635-639)。早前期有丝分裂细胞核中染色体的布置保持分裂间期核的形状的观察结果，也值得关注。看起来，不同的染色体形成高度结构化的嵌合体(mosaic)，这可能是确定细胞表型的重要结果。分裂间期核中染色体的空间布置与细胞生理学之间的关系是现行的研究领域 (米斯特里(Misteli，T.)，2001，科学(Science)，四1 :843-847 ；托马斯(Thomas，C.)等人， 2001，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. ki. USA)，99 :1972-1977 ；帕拉达(Parada， L.)等人，2004，实验细胞研究(Exp. Cell Res.)，296 :64-70)。根据下文引用的观察结果，具有钟形核的细胞是多能细胞，其代表发育和生长的肿瘤和肿瘤前期病变(诸如结直肠肿瘤、腺瘤和腺癌)的生殖细胞。因此，荧光性和钟形核形态类型是多能干细胞的指示，并且可用作成体组织样品中肿瘤前期和瘤形成性组织的诊断标准。此外，钟形核的组织(例如组织成管状结构或蜘蛛网状结构)可进一步指示肿瘤 (例如瘤形成或转移性肿瘤)发展的进程。通过钟形核在不对称无丝分裂式分裂中显露出来的多种形式的核的图像，可证实钟形核的多能性。在观察到从钟形核显露出来蛋形、香肠形、肾形、子弹形和雪茄形核，并且没有观察到其它核形式的情况下，所述核形式代表着保留或持续存在这些核形式的组织所必需的功能集。如所观察的钟形核发生的形态变异所示，确实可存在具有钟形核的多种细胞形式。具有钟形核的细胞的数量和对称无丝分裂的频率与此假说的生殖要素一致。在胎儿中观察到大量此类细胞，在无瘤形成的正常成体结肠中很少见到，而在数立方毫米的腺瘤中少量(例如约1，000个)存在，并且在数立方厘米的腺癌中大量(例如，小于约 1，000，000个)存在。预计其在胎儿和腺癌中的分裂速率为每年约20-30次分裂，与预计的结肠腺癌的净生长速率一致(赫瑞罗基曼兹(Herrero Jimenez, P.)等人，1998，突变研究(Mutat. Res. ),400 :553-578)。这些细胞在腺瘤中发生对称无丝分裂的分数小于 1/1000，并且截至目前都未曾见到。这一否定的观察结果本身十分重要。通过计算，已经估计出人结肠肿瘤前期病变中生殖细胞或“有促进风险的细胞”的细胞分裂频率为每6到 9年约1次(赫瑞罗基曼兹(Herrero Jimenez, P.)等人，2000，突变研究(Mutat. Res.)， 447 :73-116 ；古斯特瓦(Gost jeva，Ε. V.)和希尔里(W. G. Thilly)，2005，干细胞评述(Stem Cell Reviews) 2 :243-252)。假定可在3小时时间内识别无丝分裂，那么预期其频率低于 6/100, 000。因此，腺瘤的极低对称无丝分裂速率与有关结肠肿瘤前期生殖细胞的预期一致。在幼体生长结束时，有可能逐步停止产生具有钟形核的细胞。在幼年时期早期，成视网膜细胞逐步产生视网膜细胞，并消除了成视网膜细胞瘤基因杂合子引起成视网膜细胞瘤的风险(坎德森(Knudson，A.)，1971，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)， 68 :820-823)。由诸如APC等基因突变引起的结肠肿瘤“起始”可防止这一逐步停止的过程。 如果情况如此，就应在新生儿和幼体的结肠隐窝基底部中发现钟形核。由胚胎和癌性组织中钟形核的出现，可以推知胚胎形成与癌形成之间的关系。长达一个多世纪以来，癌症研究人员曾认为肿瘤反映了胚胎的特征。艾伦普希亚 (Erenpresia, J.)和海尔姆托德(Helmtrud，I.) (1999，衰老与发育机制(Mech. Aging and Develop. ),108 :227-238)引用的柯恩海姆(J. Cohnheim) (1875，维尔荷氏文献(Virchows Arch.) ,65 64 ； 1877-1880, Vorelesungen uber allgemeine Pathologie. Ein Handbuch fur Artzte und Studierende. Berlin, Hirchswald 1 2 691S)第一次假设肿瘤是由不当地持续存在于成体组织中的胚胎或胎儿细胞引起。肿瘤中癌胚抗原的表达和多种基因产物 mRNA和蛋白质在肿瘤中的出现(也见于胚胎和/或胎儿中)明显加强了这一假说，即，肿瘤发生涉及具有胚胎和或胎儿品质的细胞的出现。应注意，许多作者都将术语胚胎与胎儿互换使用，包括19世纪德国病理学家的模糊翻译。(本文中将胚胎/胎儿的分界描绘为由有丝分裂的胚胎干细胞到具有钟形核的无丝分裂胎儿干细胞的过渡)腺癌和胎儿结肠中形态细胞类型在形式、无丝分裂和有丝分裂行为上基本上相同的发现需要将“癌胚”假说更特定地重申为“癌胎(carcino-fetal) ”假说，其明确仔细地仿效了柯恩海姆，并使用了指示肿瘤干细胞存在的近期争论和实验论证(帕德尔(Pardal)等人，2003，自然研究(Nature Rev. ),3 :895-902)。融合了人体癌症研究和过去130年的观点的这些新观察结果提出了一个有关最晚发作(成年)的结肠腺瘤和腺癌起源和特征的简单假说在幼体期期间或幼体期结束时逐渐停止产生具有钟形核的细胞之前，这一细胞形式中就发生了引发肿瘤的突变，例如APC 基因失活。这些引发的带有钟形核的细胞将简单地继续分裂，并以与其在幼体中分裂相同的速率产生新的结肠隐窝(赫瑞罗基曼兹(Herrero Jimenez, P.)等人，1998，突变研究 (Mutat. Res. ),400 :553-578 ；赫瑞罗基曼兹 P.等人，2000，突变研究，447 :73-116)。由此产生的局部集聚产生“息肉”。在生长的腺瘤内，具有钟形核的单一细胞通过一个或一个以上其它遗传变化(包括基因印迹的变化)主动地，或通过生物化学变化被动地，回复到早前的胎儿状态，并且如在胎儿中一样，产生与胎儿组织几乎难以区分的迅速生长的细胞阵列。 如果不加处理，其持续生长会导致结肠阻塞和/或转移，乃至死亡。从最普遍的意义上看，这些观察结果指向癌形成的高度有序性，其中在腺瘤和腺癌中都明显观察到非混沌的行为，对于腺瘤，其保留缓慢但恒定的幼体生长速率，而对于腺癌，其再产生在胎儿器官形成期间所观察到的细胞类型和生长速率的有序集合。在现有生物形式是选自无数简并可能性(“尝试所有组合”)的情况下，人体癌形成可能很罕见，但无法简单地停止幼体生长，以及随后很少回复到有序的胎儿细胞状态，可能是不足为奇的。这些观察结果表明，具有钟形核的细胞将成为更特定且因此更有效的肿瘤预防和治疗形式的目标。如果可能将肿瘤前期集落的净生长速率降低50%，最晚发作的癌症类型在人100年的寿命中不会出现(赫瑞罗基曼兹(Herrero Jimenez, P.)等人，1998，突变研究(Mutat. Res. ),400 :553-578 ；赫瑞罗基曼兹 P.等人，2000，突变研究，447 :73-116)。 有理由相信，具有异形核形态类型(诸如钟形核)的细胞是结肠腺瘤和腺癌中的肿瘤干细胞，由此可能靶向在净生长的对称分裂或不对称分裂的DNA合成和分离中赋予其特定特征的机制，其提供发生有丝分裂式分裂的细胞和提供大量肿瘤块。这些细胞类型或形成管状的钟形核可能依据不同的生物化学规律操作，而且如果了解了这些规律，也可能将其用于肿瘤预防和/或疗法中(例如参看奥托沃尔伯格(Otto Warburg)的发现，其发现了胚胎/ 胎儿、成体器官和癌症组织在线粒体生物化学方面的明显差异(沃尔伯格(Warburg，0.), 1956，科学(Science), 123 :309-314 ；沃尔伯格(Warburg, 0.)等人，1960，自然研究杂志 B 辑(Z. Naturforsch B.)，15B :378-379))。参考有关无脊椎动物的基础教程发现，大香肠形核存在于有纤毛的原生动物中， 诸如缘毛目(pertirich)的钟虫(Vorticella)和异毛目(heterotrich)“喇叭虫(Stentor) 具有类似于珠串的明显较大的核类型……”(布奇鲍姆(BuchsbaunuR.)等人，1971，无脊椎动物(Animals Without Backbones)，第 3 版，芝加哥大学出版社(University of Chicago Press)，伊利诺伊州芝加哥(Chicago，IL))。在预好氧环境(pre_oxic environment)中存活的细胞似乎在发育的器官、腺瘤和腺瘤中预期在新血管形成前氧含量较低的局部环境中生长的情况下，核形态变化的这些独特性甚至可能在进化期中与这些细胞的生物化学关联。沃尔伯格的发现指出，在胎儿和肿瘤中，氨基酸提供用于产生ATP的氧还原等效物，这表明选择的表型将氧处理为限制性养分。因此，异形核形态类型(例如钟形核)似乎是联合了进化生物学、器官形成和肿瘤发生的三重生理学关系。现必须向减数分裂和有丝分裂的遗传周期中添加受精后时期有丝分裂式分裂与产生动物大部分细胞质量的有丝分裂式分裂之间的直系谱系的对称和不对称无丝分裂阶段。本发明特别针对根据荧光、核形态、在对称和不对称无丝分裂中的牵连和在多核聚集体中的关联来对细胞类型分类的方法。举例来说，可以根据在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下荧光球状细胞质结构或包含异形核形态类型(例如钟形核、雪茄形核和子弹形核)的合胞体的存在或不存在，来对从哺乳动物获得的组织样品分类。如图1中所示，异形核形态类型存在于不同发育阶段，以及肿瘤发展的不同阶段。举例来说，在胎儿样品中可发现钟形核，但在成体样品中很少见到，而在腺瘤和腺癌样品中很盛行。这就支持了以下观念可以使用异形核形态类型来鉴别胎儿幼体干细胞以及成体组织中的瘤形成性干细胞。这些结果证实了先前无文献记录的胎儿干细胞与癌症干细胞之间的联系。因此， 胎儿中指示胎儿幼体干细胞的异形核形态类型也指示成体组织中的癌症干细胞。此外，图2A-2C显示，异形核形态类型排列成管状结构。由于这些管状结构存在于胎儿样品中，并且含有异形核形态类型(例如钟形核、雪茄形核和子弹形核)，使得管状结构本身可用作胎儿幼体干细胞或成体组织中的瘤形成性(例如肿瘤或癌症)干细胞的指
7J\ ο另外，如图5A-5E中所示，异形核形态类型在合胞体中排成阵列将指示腺瘤与腺癌之间的差异。因此，组织样品的多核结构中核形态类型的布置方式可用于区分不同疾病阶段的瘤形成性样品。由于在其它成体组织和肿瘤样品(例如肝)中已经观察到异形核形态类型，使得所属领域技术人员能够根据任一种成体组织中异形核形态类型的存在来识别肿瘤前期或瘤形成性病变。本发明也针对根据药剂在减少偏核干细胞的数量或减缓其数量增加方面的作用， 来鉴别可抑制干细胞/合胞体增殖的药剂和抗肿瘤发生剂的方法，所述药剂作用的鉴别是通过这些干细胞/合胞体在固定和用适合的非荧光试剂(诸如富尔根试剂中发现的品红) 处理后发出强烈荧光、荧光的出现或消失(即，在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下)实现。这一偏核干细胞鉴别模式可在任何手术样品或细胞培养物中，通过同时鉴别与肿瘤前期或瘤形成性组织特别关联的异形核形态类型(例如，钟形核、雪茄形核和子弹形核)而独立验证。一旦在成体组织中鉴别到干细胞(例如肿瘤干细胞)，也可使用抑制或减缓干细胞生长/增殖的药剂来防止肿瘤形成的发生。例如可以在体内于特定动物模型 (例如哺乳动物模型，例如啮齿动物，诸如小鼠或大鼠)中筛选候选药剂。候选抗肿瘤发生剂的筛选可以例如在临床研究中进行，以发现与构成肿瘤中超过99%的细胞的非干细胞群相对，试验方案是否实际上破坏了肿瘤干细胞组分。利用本文中所述的方法，可以使用来自人体肿瘤的移植物或在实验动物中重新产生的肿瘤，在实验动物中筛选出候选抗肿瘤剂或肿瘤预防剂。因此，杀死、减缓或干扰细胞培养物中具有钟形核的细胞的对称或不对称分裂的药剂都将被视为适于患者肿瘤预防或治疗的候选药剂。另外，也可体外或离体(例如，在核形态类型得到保持的培养样品中)筛选候选药剂。此项技术中已知长期保存原代培养物中的组织的方法。可以利用异形核形态类型得到保留的培养样品来鉴别抗肿瘤发生剂。因此，如果用候选抗肿瘤发生剂处理这一培养样品， 并且使异形核形态类型的盛行情况降低，那么将预期这种候选抗肿瘤发生剂可用于体内治疗患者的肿瘤。本发明将参照以下非限制性实施例进行进一步描述。实施例1 实验程序细胞和组织的来源在马萨诸塞综合医院(Massachusetts General Hospital)病理科和癌症研究 MGH中心获得作为手术废弃物的所有成体组织和肿瘤试样。将每一组织切片立即放到新鲜的冰冷固定液中，并运送到美国麻省理工学院(MIT)细胞遗传学实验室，以作进一步分析。 使用无名的废弃切片得到了 MGH和MIT伦理委员会(Institutional Review Boards)的批准。供分析的胎儿肠组织切片不是针对此项研究而得到的，而是从切尔诺贝利科学考察 (Chernobyl Scientific Expedition)的档案载玻片集合中取出，这些载玻片负有发现在 1985年乌克兰(Ukraine)的切尔诺贝利核反应堆熔毁后发育胎儿和儿童受到遗传辐射损伤的迹象的任务。分析在术后丢弃的与癌症无关的两个正常成体结肠(来自两名患者的两个FAPC结肠的5份约2到IOmm直径的息肉、4个结肠肿瘤、1个胰腺肿瘤和数个独立的肝结直肠转移)。组织切除、固定、扩散和DNA染代本程序使用厚度为约0. 5mm的固定且染色的组织切片，其中以化学方式破坏细胞粘附，达到允许组织在显微镜载玻片上有序扩散的程度。这项技术使细胞保持其核的结构完整性。尽管在组织扩散期间必定会存在某种极微小的变形，但仍能够观察到诸如染色的核等小形态结构和诸如结肠息肉等较大结构。在切除术后不久(例如，切除术后不到1小时，更优选切除术后约30分钟或不到 30分钟)提供结肠手术废弃物的情况下，核形态类型特别明显。切开后，立即将剥离的结肠粘膜片(约Icm2)或Imm厚的腺瘤、腺癌和/或转移切片放入新鲜制备的4°C卡诺依氏固定液(3 1的甲醇冰乙酸)。固定液的体积是组织样品体积的至少三倍。每45分钟更换新鲜固定液3次，持续总计3小时的固定时间。随后，利用4°C的70%甲醇更换卡诺依氏固定液，并且可在约-20°C储存达一年。从整个固定组织样品中切下约Imm2的薄片(长度X宽度，不同于切片厚度)，以便进行扩散和DNA染色。在蒸馏水中冲洗每一薄片，并放到60°C的2mL IN HCl中，精确保持8分钟，以便部分水解大分子并使DNA脱嘌呤。通过在冷蒸馏水中迅速冲洗来终止水解。 将冲洗过的样品浸入45%乙酸(室温)中，保持15到30分钟。这最后一个步骤在植物细胞遗传学(botanical cytogenetics)中称为“组织浸软”，其允许随后的组织细胞扩散，以及在轻微压力下于显微镜载玻片上观察植物组织切片(古斯特夫(Gostev，Α.)和埃斯科(Asker，S.)，1978，遗传(Hereditas), 101 :98-104 ；古斯特瓦(Gost jeva，E.)，1998，遗传学 (Genetika), 32 :17-21)。这一“浸软”的固定组织样品被立即用于在显微镜载玻片上扩散。 将每一约Imm2的浸软的切片平分，形成两个约0. 5 X Imm的固定且浸软的组织薄片。将每一薄片转移到置于洁净显微镜载玻片上的约5μ L乙酸中，并用22X22mm的盖玻片覆盖。固定盖玻片边缘，对组织样品施加轻微压力，使其位于载玻片的中间。在扩散步骤中，折叠5层滤纸，并放到盖玻片上，需特别小心以防移动盖玻片。沿滤纸的一个方向平稳地移动镊子柄，利用轻微而均勻的压力覆盖盖玻片。“轻微”是指压力明显低于“压碎”染色体所用的压力。使用20X相差物镜检查每一个别样品的扩散质量 (quality)。良好结肠组织扩散的指标是在整个组织扩散的边缘上没有损坏的核，同时隐窝被压制成基本上单一层，并保留隐窝的形态完整性。将每一充分扩散的样品载玻片立即放到干冰表面上。在2分钟内，当扩散的组织样品完全冷冻时，将刀片插到盖玻片一个边缘下，小心地将其抬起。在无尘环境中使载玻片干燥不少于1小时。在室温下进行染色程序。将载玻片放入科普林缸(Coplin jar)中，并装入希夫试剂(Art. 9033，默克公司(Merck))，以对核中部分脱嘌呤的DNA染色。将载玻片浸入染色溶液中，保持1小时，在相同科普林缸中用2XSSC(柠檬酸三钠8. 8g/L，氯化钠17. 5g/L) 冲洗2次，一次持续30秒，一次迅速进行。随后用蒸馏水冲洗载玻片。此阶段的载玻片适于借助定量图像分析观察核中DNA的分布，包括测量核或凝集的染色体中富尔根DNA的量 (哈德(Hardie, D.)等人，2002，组织化学与细胞化学杂志(J. Histochem. Cytochem. )，50 735-749)。为了获得分裂间期核的优良分辨率和成像，可以用吉姆萨试剂对载玻片进一步染色。在用2XSSC冲洗后，立即将载玻片放到吉姆萨溶液(吉姆萨，Art. 9204，默克公司)中，保持5分钟，随后首先在索伦森缓冲液(SSrenssen buffer) ( 二水合磷酸氢二钠 11.87g/L，磷酸二氢钾9.07g/L)中迅速冲洗，随后用蒸馏水冲洗。如同振荡温度计一般，将载玻片上的水滴抖落，以避免侵蚀染色剂。将载玻片放到无尘环境中，在室温下干燥1小时。随后放入装有二甲苯的科普林缸中，保持至少3小时，以去除脂肪。用DePex封片剂将盖玻片与载玻片封在一起，干燥3小时，此时，可用于进行高分辨率扫描。显微镜和图像处理系统使用3. O 版的 KS 400 图像分析系统(KS 400Image Analysis System )(德国蔡司公司(kiss，Germany))来观察和记录图像以便将来对核尺寸和DNA含量进行定量分析。这一系统由电控光学显微镜Axioscope 、彩色CXD摄影机Axi0CamTM(德国蔡司公司) 连接到个人计算机组成。当只使用富尔根染色剂时，使用可见光和560nm(绿色)滤光器， 在1. 4/100放大倍率的复消色差显微镜物镜下，从显微镜传输图像。当使用富尔根-吉姆萨染色时，不使用滤光器。在每次扫描过程之前，调整帧接收器和最佳曝光。以像素尺寸 0. 0223X0. 0223 μ m记录核图像。保存诸如放大倍率、分辨率和曝光等扫描参数以便能重现同一载玻片的扫描。实施例2:检测钟形核胎儿后肠本文中所述的观察结果是来自两个独立的胎儿肠组织切片，如图1、2A_2C和 3A-3F中所示。得到三个观察结果。第一，如图1中所概述，存在7个不同核形态类型的阵列。第二，如图2A-2C中所示，组织成长(约20到50微米直径)管的钟形核呈有序的线性头到脚布置。第三，如图3A-3F中所示，存在涉及钟形核的奇特的对称和不对称无丝分裂形式。相同后肠切片的相差图像(左图，图2B)和染色的核图像(中间图，图2B)当重叠 (右图，图2C)时显示，线性定向的核被包含在先前未报导的管状结构中，这一管状结构自身的直径为约20到50微米。核放大280X (中间图，图2B)显示，这些非球形的核看起来呈杯或钟的形式。呈线性阵列的核的较高分辨率图像(1400X)显示，其呈可重现的明显中空的钟形。所观察的所有胚胎管中都保留这些钟的头到脚定向，但管向后和向前弯曲延伸， 以致平行的管可呈现局部反平行的钟形核定向。据观察，钟形核只在管状结构内经历对称或不对称无丝分裂。钟形核的对称无丝分裂类似于简单地分离两个堆叠的纸杯。在最高分辨率下，处于分裂过程的这些钟的上缘似乎具有一对凝集或部分凝集的染色单体(参看图1，箭头)，其包围了钟的外轮缘的约 3/4，如图3A和;3B中所示。如图3A所示，在各种管内发现了多种不同的钟形，并且这些形态变异在对称无丝分裂中都如实地再现出来。这一先前未发现的钟形核的无丝分裂式核分裂形式当然是出人意料的。但胎儿切片更出乎人意料。在整个肠组织切片中，发现管状结构内的钟形核明显“生出”核。已发现， 胎儿切片中发现和图1中所示的每一形式核形状的实例都是从钟形核显露出来的。这些奇特的无丝分裂式不对称核分裂形式显示于图3C中。对于除钟形外的核形态类型，都似乎经历有丝分裂，形成相同核形态类型的局部集落。这些有丝分裂式分裂始终在含有钟形核的长管外发生。奇怪的是，前期中保留特定的核形态类型，并且甚至通过后期末期的晚期染色体缔合而再生，如图1中所示。ιΗ常结肠上皮细胞约0.5mm切片、组织浸软(参看下文)和小心扩散结合DNA特异性染色以产生特别清晰的核图像的组合允许识别三维特征。隐窝中所有或几乎所有的核都能从隐窝基底部到内腔表面观察到。许多隐窝破裂或扩散的方式使得能分辨个别核形状。具有卵圆形或扁球形核的细胞在隐窝中从基底部正上方到上皮延伸到内腔中排成一行。然而，在隐窝基底部本身的大致前25个细胞中，可以“扁圆形”(约2到3微米厚，且直径为约10微米)为特征的核形态类型占优势。在细胞充分分开的不到1 %的隐窝基底部中，从扁圆形核中可分辨出钟形核。在成体肝制剂中已经观察到类似的低频率钟形核。在无任何瘤形成或肿瘤前期指征的成体结肠中，通过逐细胞扫描约800个充分扩散的隐窝，没有观察到其它核形态变异体。MM.腺瘤含有许多隐窝，与正常结肠隐窝难以区别，各隐窝具有约2000个细胞。如图 5A中所示，这些隐窝常呈分支形式。如在正常结肠隐窝中一样，相同的扁球形和卵圆形核存在于隐窝壁中，但在隐窝基底部常常展现一个或两个钟形核。据观察，不规则的隐窝状结构含有多达8000个细胞，其比较容易通过组织浸软而扩散(图5B)。此外，许多不同的细胞和群组散布于隐窝和隐窝状结构间(图5C)。一些结构似乎朝向全尺寸正常隐窝生长，其含有约250、约500或约1000个细胞(所用扩散技术一般允许精确计算具有数百个细胞的结构中的细胞数量)。据观察，许多细胞群呈“环”形，其各精确地具有8、16、32、64和1 个细胞(图5D)。较高放大倍率检查揭示，尽管隐窝状结构壁的大多数细胞都具有如正常成体结肠隐窝中一般的球形或卵形核，但在隐窝壁分支处似乎存在具有卵形、雪茄形或子弹形核的细胞集落。已经在胎儿肠组织中观察到具有卵形和雪茄形核的集落，但“子弹形”核形态类型只在腺瘤和腺癌中观察到(图5E)。“子弹形”核形态类型似乎也是从钟形核通过不对称无丝分裂而产生，其中首先显露出来不规则端(“咬掉的”一端)。除了观察到由具有子弹形核的细胞构成的小集落，且这些集落含有经历常规有丝分裂的细胞以外，还有一个值得关注的事实，即，从早前期到后期末期都保留不寻常的核形态类型。尽管钟形核在正常成体结肠中很少见，但其明显在腺瘤中起到重要作用。它们似乎存在于多种腺瘤环境中。如图5D中所示，一些钟形核被发现在隐窝状结构间的空隙中形成1个到10个或10个以上的“钟”。其它钟形核被发现在多细胞环结构中形成单一“钟”， 其中在具有2n-l个呈球形或其它形态的细胞的环中总是观察到一个钟形核，如图5C和5D 中所示。在扩散条件下如正常结肠隐窝一般粘着的较小或全尺寸结构中，钟形核似乎在隐窝状结构基底杯内形成单一钟，更通常形成一对钟，或者偶尔形成4或8个钟。在更大的不规则隐窝状结构中，钟形核自动整合成异常结构的壁，与具有其它核形态类型的细胞混合。 看起来就如同这些较大的不规则隐窝状结构是各自具有自身的核形态类型的多种不同类别群集的嵌合体。腺瘤的钟形核与其它核形态类型以及胚胎中的钟形核还存在另一明显差异尽管已经在个别腺瘤中观察到刚好超过一千个钟形核，但在胎儿切片中所发现的对称无丝分裂形式中未观察到任何腺瘤中的单一钟形核。还可注意到，在扫描的腺瘤中，未观察到处于可描述为固缩(pyknotic)的状态的钟形核。当扫描整个切片时，常常在有丝分裂或固缩中发现大致相等频率(约1到5/1000个核总量)的所有其它形态形式的核。小分段的有丝分裂和固缩计数变化极大。本文中使用的“固缩”是指核破裂且染色质凝集成不规则的凝块的情形，其指示死亡的细胞。MM尽管腺癌具有较大的质量且许多个别切片在轻柔压力作用下抵制扩散，但具有 16、32、64和1 个细胞的环中存在的隐窝、较大不规则隐窝状结构和中间隐窝的混合物与小得多的腺瘤中的情况基本上相同。隐窝状结构壁中的分支与具有相同核形态的细胞集落缔合，保持凝集的前期染色体的三维分布。所发现的钟形核仍以单态、成对或较大数量存在于隐窝基底杯中，并且嵌入较大的异常隐窝状结构壁中的复杂轮生体中。图6A-6C显示腺癌中特有的一系列所述钟形核。腺癌中核形态类型集似乎与在腺瘤中所见的集合相同。具体点说，常常观察到在胎儿切片或成体结肠中不能观察到的“子弹形”核形态类型。腺瘤与腺癌之间的一个可辨别的差异在于，隐窝状结构在基底部到内腔方向上任意定向，相对于肿瘤表面明显随机定向。在肿瘤内部也不常发现隐窝和不规则的隐窝状结构，其可以折衷而非混沌的局部组织的较小结构集合良好表征。这些散布的具有不同核形式的细胞集落可能代表一个共生群落。腺癌与腺瘤不同的一个重要特征是，频繁出现明显组织的数百个钟形核的群组， 其中有许多常常(约)涉及对称无丝分裂。在低放大倍数下，这些群组出现在隐窝状结构间的空隙中，并且看起来像蜘蛛网或叶脉基干。在较大放大倍率下，发现较薄的“叶脉”
25是部分有序的具有钟形核的细胞链，其具有一个奇特的特征，即，其“口 ”在相同方向上，与轴呈90°定向肩并肩定向(图6C)。此外，扫描多个腺癌切片，揭露出在胎儿肠组织中观察到的呈“头到脚”定向的钟形核，但在腺瘤中则不然。这些排成线性阵列的核也被包围在胎儿中所见的管状结构(合胞体)中。偶尔观察到可能为钟形核的固缩图，但频率比钟形核发生对称无丝分裂的频率低得多。其它观察结果肝中结直肠肿瘤转移重新产生与腺癌几乎难以区分的核形态类型、隐窝和隐窝状结构模式。与在成体结肠隐窝中所观察到的一样，扫描成人肝切片偶尔观察到钟形核。与在成人中一样，扫描成年小鼠结肠类似地揭示，在隐窝基底部存在具有钟形核的细胞。在有关具有钟形核的培养细胞的生长和研究的可能很重要的观察中，已经在小鼠细胞培养物中发现低频率，约1/10，000个细胞，其中已经关于对称和对称细胞分裂动力学推断和研究了类干细胞行为(谢尔力(Sherley，J·)等人，1995，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci USA)，92 :136-140 ；默克(Merok, J.)等人，2002，癌症研究(Cancer Res.) ,62 :6791-6795)。实施例3 器官形成和癌形成借助开口的钟形核形态类型明确鉴别出胎儿结肠的胚后组织干细胞(Post embryonic organizing stem cell)。这些罕见的核经历对称和不对称核分裂，同时不发生一般性染色体浓缩。核分裂驱动胎儿、新生儿和幼体生命净生长和分化，接着最终形态变化成为成体维持干细胞。这些钟形核形态类型很少见于成体结肠隐窝基底部中，但明显再现于肿瘤前期和瘤形成中，并且似乎会驱动结肠腺瘤、腺癌和转移的净生长和分化。这些观察结果结合由历史年龄特异性结直肠患癌率(historical age specific colorectal cancer rate)、当今年龄特异性结肠腺瘤发病率和人体组织遗传变化的直接测量结果分析得到的推论，提出了一个有关结肠以及可能其它部位中晚期发作癌形成的缺省假说在幼体干细胞中肿瘤起始所需的肿瘤突变的比率明显高于成体维持干细胞，因为其罕见的DNA生物化学和隔离模式。较高的成体突变率会限制肿瘤起始事件，直到幼年时代。起始的幼体干细胞持续产生最终在结肠中观察到的成息肉的局部幼体组织斑块，并且这些细胞保持“突变基因”表型输入幼体细胞。在肿瘤前期集落缓慢但不可阻挡的生长期间，其它肿瘤突变和/或局部生物化学状态将其中一个肿瘤前期“幼体”干细胞转变成胎儿干细胞表型，其迅速产生致死性肿瘤块。器官形成发育生物学家一般持有一个观点，S卩，器官形成是由能够在对称分裂中自行繁殖而进行净生长的干细胞线性级联实现，这些干细胞负责发生不对称分裂而分化，从而产生干细胞和变换的核形式。当尝试区分从能够在移植后产生活胚胎的胚囊早期胚胎干细胞， 以及诸如从动物骨髓分离的能够再造造血系统和可能的其它器官的干细胞等干细胞得到的细胞各种形式和可能性的特性和功能时，会产生混乱。成体干细胞或维持干细胞是安置成负责许多可转换成器官(诸如结肠)的组织元件的再造。成体可以想象成由能够根据需要再造组织和器官的干细胞组成的小仓库。还可以想象不同形式的成体维持干细胞通过间歇性的不对称分裂，产生最初的过渡型细胞，其在随后的二元分裂中变为二级过渡型细胞， 直到成为分化的终末细胞，由此确定克隆转换单元。本文中揭示含有易于鉴别的核形式的结构，这些核形式似乎会经历对称和不对称核分裂。这些形式可以通过其钟形核形态类型加以鉴别，所述钟形核形态类型在5到7周的胎儿肠组织所有核中占约30%，但仅见于略低于的成体结肠隐窝的基底部顶点。癌形成有些技术人员持有一个观点，即癌形成是由能够经对称分裂而自行繁殖进行净生长的干细胞线性级联实现，这些干细胞负责经不对称分裂而分化，产生在腺癌中很明显的非均质性。普遍认为，癌形成的概念是由诸如早期胚胎形成中表达的基因等基因表面上随机表达所引起的“细胞控制丧失”。然而，类似于证实白细胞形成中实际存在复原器官的干细胞的实验的稀释和移植实验已经确定，有极少数的肿瘤细胞能够产生含有多种细胞类型的生长的肿瘤。有关肿瘤干细胞存在的这些实践论证需要考虑癌症是一种高度退化的状态的观点，并且探查一个可能性，即，其与器官形成类似，是确定正常干细胞变为肿瘤干细胞的路径的特定变化的表述。与这一思路相关的是，在结肠息肉(腺瘤、肿瘤前期病变)和肿瘤(腺癌、瘤形成)以及后续转移中发现与结肠胚胎形成中所发现相同的钟形核。这些核形式的初步计数以及其发生对称核分裂的频率允许与预期的低肿瘤前期分裂速率和快速的瘤形成分裂速率相比较。雜辦湖牛患赫白綠胃可以合理地推导出一个假说，S卩，起始干细胞以接近幼体的速率生长，形成肿瘤前期集落(腺瘤、息肉)，从这一集落不可阻挡地显露出瘤形成干细胞，其以接近胎儿的速率生长，形成致死性肿瘤。有关瘤形成是胎儿表型的再表达的假说不是本文独创的，而是来源于19世纪中期的病理学家，诸如柯恩海姆(Cohnheim)。这一假说提出，人结肠中的肿瘤前期、腺瘤或息肉是幼体结肠表型的简单继续。有关肿瘤前期生长速率的数据和由此得到的推论，通过有关儿童体重增长速率随年龄变化的偶然发现得到扩充小男孩和小女孩的平均质量在约6年的倍增时间(对于女性，约1. 5岁到14. 5岁；对于男性，从1. 5岁到16. 5岁)里呈指数增加。在这些年龄段期间， 生长速率为男性0. 158，女性0. 167。结肠生长速率与体重增长速率的关系需要建立在生长的球体内部的圆柱形表面积的模型，其将增加为体重的2/3，或在此情况下，约0. 162/3到 0.11，这一值等于所估计的结肠肿瘤前期生长速率。由于估计的结肠肿瘤前期病变的生长速率大致等于估计的幼体结肠的生长速率， 故产生一个假说肿瘤前期以某种方式重新建立幼体生长的条件。又由于幼体干细胞的净生长可能是幼体组织生长所必需的，由此产生一个观点含有组织的结肠的许多组织学特征的腺瘤事实上可能相当于在非生长型成体隐窝背景中扩增的幼体组织斑块。已经利用限制起始年龄到最大体重的年龄的计算测试了这一假说，并且发现，如果起始过程局限于幼年阶段，那么事实上有可能推导出遵照年龄特异性结直肠患癌率的参数。事实上，如果起始局限于5岁或5岁以下，那么导出的参数可拟合患癌率数据。这些计算证实，起始限制于幼年阶段内的假说与年龄特异性患癌率数据一致，但不能证实这一假说的有效性。年龄特异性腺瘤检测如果重要的临床观察结果集看起来与肿瘤起始是以幼体期为界的假说直接相关， 那么这些理论构筑体将保留在未得到测试的假说阶段。在所设计的确定通过直肠镜检查来检测和去除可能瘤形成性结肠腺瘤的最佳年龄和数量的研究中，发现通过可屈性乙状结肠镜检术(flexible sigmoidoscopy)检测具有腺瘤的人的分数可以在约60岁达到稳定最大
27值。当分析直肠病学家所得到的具有始终很高的腺瘤检测记录的观察结果时，约15%男性和约10%女性平均具有略大于1个腺瘤。从这些临床数据，可以合理地推知第一，缓慢生长的肿瘤前期腺瘤的起源必定远小于60岁(如果生长速率为0. 11，那么从1岁起始的组织干细胞在63岁时只增加到27 = 1 个肿瘤前期干细胞。所述腺瘤中总细胞的数量将远大于约总计一百万个细胞)；第二，具有息肉的男性的分数约15%与预计的男性有患结肠癌终身风险的最小分数(1890年代的追踪调查)18-20%之间的相似性表明，在60岁患腺瘤的个体与有终身风险的个体可能是相同的(如果通过进一步的分析确定这一推论，那么主要归于两个原因(a)排除了在结肠中的肿瘤前期病变最终转化成瘤形成病变中继承或遗传风险因子的任何作用；和(b)排除了结直肠癌死亡率与结直肠癌风险因子的竞争形式的任何重要作用)；第三，具有息肉的人中出现平均超过1个息肉意味着，男性群体由约20%的发生肿瘤起始和肿瘤前期生长的亚群体，以及约80%的不发生肿瘤起始和/或肿瘤前期生长的单独的不同亚群组成；第四，在男性和女性的肿瘤前期生长速率计算得到相同结果的情况下，超过60岁具有息肉的人的男性/女性比率以及息肉的平均数量/具有息肉的个体的性别差异提出一个假说患癌率的性别差异可完全归于经由易发生起始点幼年期或幼年前期产生的起始点结肠干细胞的数量(举例来说，如果男性与女性的肿瘤突变率相同，那么预期在幼年期产生的肿瘤前期集落的比率将简单地为女性在约14. 5岁且男性在约16. 5 岁经历成熟的干细胞年龄的比率)。组织病理学在整个二十世纪，已经将分子、生物化学和组织病理学分析方法应用于并行但独立的肿瘤和胚胎研究中。得到的丰富而广泛的数据显示，与人生长和发育相关的许多正常个体发生特征再出现的年龄比癌症异常病理生长晚得多。二十一世纪之初，科学家们提出一个假说胚胎与肿瘤之间的相似性(都以单克隆起源、都明显出现细胞群体的不均一性) 可以由一点解释，即，诸如干细胞等非常特殊的细胞可产生整个胚胎、胚胎以及大肿瘤的器官和组织。这些科学家尚未如本文中一般将胚胎与胎儿干细胞相区别。表1显示了在早期人发育过程中的干细胞分级。在怀孕4周(胚泡和原肠胚形成阶段)与5到12周(器官形成阶段)之间，存在一个干细胞级联，其对应于早期胎儿发育的每一特定阶段。表1.经由个体发生和经由“阻止”和“逆转”干细胞突变发生而变为癌症干细胞而产生的干细胞分级。表1:个体发生
权利要求
1.一种鉴别所关注的具有钟形核的偏核干细胞或鉴别所关注的多核合胞体的方法，其中所述所关注的合胞体包含一个或一个以上呈钟形的偏核干细胞核，所述方法包含固定细胞样品和利用非荧光希夫碱试剂在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下处理所述样品，以及显影偏核干细胞的荧光球状细胞质结构或所述合胞体内包围一个或一个以上干细胞核的细胞质的荧光，由此鉴别所述所关注的偏核干细胞，或鉴别所关注的多核合胞体， 其中所述所关注的合胞体包含一个或一个以上钟形干细胞核。
2.根据权利要求1所述的方法，其中固定所述样品包含用卡诺依氏固定液处理所述细胞样品，和使其与含有所述希夫碱品红的富尔根试剂反应。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞或合胞体是从细胞培养物、肿瘤前期病变、肿瘤样品或组织样品获得，或包含在细胞培养物、肿瘤前期病变、肿瘤样品或组织样品中。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述偏核干细胞或多核合胞体是从所述组织样品、肿瘤前期病变或肿瘤样品分离的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述偏核干细胞或多核合胞体包含一个或一个以上无丝分裂的不对称核分裂复合物。
6.一种所关注的偏核干细胞或合胞体，其是借助根据权利要求1所述的方法鉴别的。
7.—种诊断疑似处于肿瘤前期或患有瘤形成的成年哺乳动物的肿瘤前期或瘤形成的方法，所述方法包含固定来自所述哺乳动物的细胞样品和利用非荧光希夫碱试剂在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下处理所述样品，以及检测偏核干细胞的荧光球状细胞质结构或合胞体内包围一个或一个以上干细胞核的细胞质的荧光，其中所述干细胞核是钟形的，由此在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下，检测到一个或一个以上具有钟形核的荧光偏核干细胞，或检测到一个或一个以上包含一个或一个以上呈钟形的干细胞核的荧光合胞体，指示所述成年哺乳动物内的肿瘤前期或瘤形成。
8.根据权利要求7所述的方法，其中固定所述样品包含用卡诺依氏固定液处理所述细胞样品，和使其与富尔根染色剂反应。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述偏核干细胞或多核合胞体包含一个或一个以上无丝分裂的不对称核分裂复合物。
10.一种鉴别对偏核干细胞或包含一个或一个以上干细胞核的合胞体有特异性的分子标记物的方法，其中所述干细胞核为钟形，所述方法包含将偏核干细胞的分子标记物或包含一个或一个以上干细胞核的合胞体的分子标记物与非偏核细胞的分子标记物相比较。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述分子标记物是抗原、细胞表面标记物、核酸、蛋白质、磷酸化蛋白质、葡糖胺聚糖或代谢物。
12.—种诊断成年哺乳动物中的肿瘤前期或瘤形成的方法，其包含检测一个或一个以上根据权利要求10所述鉴别的分子标记物，其中成体组织中所述一个或一个以上分子标记物的鉴别是所述成年哺乳动物肿瘤前期或瘤形成的指示。
13.一种鉴别抑制偏核干细胞增殖的药剂的方法，其包含a)用候选药剂体外处理组织或细胞样品，其中所述组织或细胞样品包含偏核干细胞， 或包含一个或一个以上干细胞核的合胞体，其中所述干细胞核为钟形；b)固定所述经处理的组织或细胞样品，并用非荧光希夫碱试剂，在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下处理所述样品；c)检测偏核干细胞的荧光球状细胞质结构或者合胞体内包围一个或一个以上干细胞核的细胞质的荧光的存在、强度或数量；以及d)将用所述候选药剂处理的所述样品中偏核干细胞的荧光球状细胞质结构或者所述合胞体内包围一个或一个以上干细胞核的细胞质的荧光的存在、强度或数量与对照物相比较；其中荧光干细胞或含一个或一个以上干细胞核的合胞体的数量或强度减小或不增加， 指示所述药剂抑制偏核干细胞增殖。
14.根据权利要求13所述的方法，其中固定所述经处理的组织或细胞样品包含用卡诺依氏固定液处理所述细胞样品，和使其与富尔根染色剂反应。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述对照物是用安慰剂处理的体外组织或细胞样品，其中所述组织或细胞样品包含偏核干细胞或包含一个或一个以上干细胞核的合胞体，其中所述干细胞核为钟形。
16.一种鉴别抗肿瘤发生剂的方法，其包含a)用候选药剂体外处理肿瘤组织或肿瘤细胞样品；b)固定所述经处理的肿瘤组织或肿瘤细胞样品，并用非荧光希夫碱试剂，在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下处理所述样品；c)检测偏核干细胞的荧光球状细胞质结构或者包含一个或一个以上干细胞核的合胞体内包围一个或一个以上干细胞核的细胞质的荧光的存在、强度或数量；以及d)将用所述候选药剂处理的样品中偏核干细胞的荧光球状细胞质结构或者所述合胞体内包围一个或一个以上干细胞核的细胞质的荧光的存在、强度或数量与对照物相比较；其中荧光干细胞或包含一个或一个以上干细胞核的合胞体的数量或强度减小或不增加，指示所述药剂是抗肿瘤发生剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中固定所述经处理的肿瘤组织或肿瘤细胞样品包含用卡诺依氏固定液处理所述肿瘤细胞样品，和使其与富尔根染色剂反应。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述对照物是用安慰剂处理的体外肿瘤组织或肿瘤细胞样品。
19.一种鉴别抑制干细胞增殖的药剂的方法，其包含a)用候选药剂处理测试哺乳动物；b)固定来自所述测试哺乳动物的细胞或组织样品，并用非荧光希夫碱试剂，在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下处理所述样品；c)检测偏核干细胞的荧光球状细胞质结构或者合胞体内包围一个或一个以上干细胞核的细胞质的荧光的存在、强度或数量，其中所述干细胞核为钟形；以及d)将来自用所述候选药剂处理的所述测试哺乳动物的所述细胞或组织样品中偏核干细胞的荧光球状细胞质结构或者所述合胞体内包围一个或一个以上干细胞核的细胞质的荧光的存在、强度或数量与对照物相比较；其中荧光干细胞或含一个或一个以上干细胞核的合胞体的数量或强度减小或不增加， 指示所述药剂抑制偏核干细胞增殖。
20.根据权利要求19所述的方法，其中固定所述经处理的肿瘤组织或肿瘤细胞样品包含用卡诺依氏固定液处理所述肿瘤细胞样品，和使其与富尔根染色剂反应。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述对照物是在用所述测药剂处理之前从所述测试哺乳动物得到的细胞或组织样品，或者所述对照物是来自用安慰剂处理的测试哺乳动物的细胞或组织样品。
22.—种鉴别抗肿瘤发生剂的方法，其包含a)用候选药剂处理具有肿瘤的哺乳动物；b)固定来自所述哺乳动物的肿瘤细胞或肿瘤组织样品，并用非荧光希夫碱试剂，在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下处理所述样品；c)检测偏核干细胞的荧光球状细胞质结构或者合胞体内包围一个或一个以上干细胞核的细胞质的荧光的存在、强度或数量，其中所述干细胞核为钟形；以及d)将来自用所述候选药剂处理的所述哺乳动物的所述肿瘤细胞或肿瘤组织样品中偏核干细胞的荧光球状细胞质结构或者所述合胞体内包围一个或一个以上干细胞核的细胞质的荧光的存在、强度或数量与对照物相比较；其中荧光干细胞或包含一个或一个以上干细胞核的合胞体的数量或强度减小或不增加，指示所述药剂是抗肿瘤发生剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中固定所述经处理的肿瘤组织或肿瘤细胞样品包含用卡诺依氏固定液处理所述肿瘤细胞样品，和使其与富尔根染色剂反应。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述对照物是在用所述候选药剂处理之前从所述哺乳动物得到的肿瘤细胞或肿瘤组织样品，或者所述对照物是来自用安慰剂处理的哺乳动物的细胞或组织样品。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述所关注的偏核干细胞或所关注的合胞体进一步包含一个或一个以上无丝分裂的不对称核分裂复合物。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述偏核干细胞选自由以下者所组成的群组器官特异性干细胞、癌症干细胞、胎儿-幼体干细胞和成体干细胞。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述所关注的偏核干细胞或所关注的合胞体进一步包含一个或一个以上无丝分裂的对称核分裂复合物。
28.一种所关注的偏核干细胞或合胞体，其是借助根据权利要求25所述的方法鉴别的。
全文摘要
本发明揭示表征组织样品的发育或病理阶段以及鉴别多能偏核干细胞的方法，其包含在不存在外来或外源添加的荧光染料的情况下，检测用非荧光性希夫碱试剂处理的固定样品中细胞和合胞体的荧光。
文档编号G01N33/50GK102216777SQ200980146118
公开日2011年10月12日 申请日期2009年9月21日 优先权日2008年9月24日
发明者威廉·G.·希利, 艾连纳·V.·寇斯特杰华 申请人:麻省理工学院