专利名称：一种乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法，属于化学成分检测的技术领域。
背景技术：
酵母葡聚糖是以酿酒酵母为原料，经提取、酸碱处理、喷雾干燥等步骤生产而成的新资源食品，分子量2万-400万道尔顿；分子式为(C6H12O6)n, η为125-25000 ;结构式见图I。 目前，国内尚未有酵母β-葡聚糖在乳制品中定量检测方法的国家标准和行业标准。乳制品中的糖主要为乳糖，结构式见图2。充分水解产物为葡萄糖和半乳糖。酵母葡聚糖是具有β_1，3及/β_1，6结构的葡萄糖聚合物，充分水解产物为葡萄糖。酵母β_葡聚糖不能与乳制品中胶体形成非常稳固的胶体体系，在离心过程中会沉降下来，而乳制品中乳糖、脂类不会沉降，从而使其与乳制品分离；分离后得到的酵母β -葡聚糖经过酸水解形成葡萄糖溶液；使用HPLC测定其中葡萄糖和半乳糖的含量，进而通过葡萄糖比半乳糖多出的部分计算出酵母β-葡聚糖的含量。

发明内容
本发明的目的是开发一种酵母β -葡聚糖在乳制品中定量检测的方法，其检测灵敏度高，检测准确度高，重复性好。本发明的技术方案如下I.样品前处理I. I 称样在50mL高速离心管中称取待测液体样品25. OOOOx N g，其中固体样品5. OOOOx Ng加超纯水至25. OOOOx N g，充分溶解；其中液体样品指我公司或市场上的可以流动的乳制品，如调制乳、酸牛奶、乳饮料等；固体样品指奶粉、奶酪、冰淇淋等产品。I. 2 沉淀加入5x N mL 20%乙酸锌溶液和5x N mL 10%亚铁氰化钾溶液，充分振荡混合后于5500g离心IOmin,去掉上清液。I. 3 水洗沉淀物加15x N mL超纯水，玻璃棒搅匀，用IOx Nml超纯水冲洗玻璃棒，振荡混合均勻后，于5500g离心IOmin,去掉上清液。I. 4 醇洗沉淀物加15x N mL 75%乙醇，玻璃棒搅匀，用IOx N mL 75%乙醇冲洗玻璃棒，震荡混合均匀后，于5500g离心lOmin，去掉上清液。
I. 5 二次水洗沉淀物再加15x N mL超纯水，玻璃棒搅匀，用IOx NmL超纯水冲洗玻璃棒，震荡混合均勻后，于5500g离心IOmin,去掉上清液。2.标准品前处理2. I 称样在250mL SCHOTT 瓶中称入 0. 0105g (称准至 0. 0002g) Sigma G5011 标准品。2. 2标准品预溶加入50mL超纯水预溶。3.葡萄糖标准曲线制备
吸取葡萄糖标液l、3、5mL到IOmL容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到葡萄糖为20、60、100mg/L的混合标样。在色谱条件下准确进样20uL，绘制色谱峰面积和标准物质量浓度之间的标准曲线，得出回归方程。4.半乳糖标准曲线制备吸取半乳糖标液l、3、5mL到IOmL容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到半乳糖为20、60、100mg/L的混合标样。在色谱条件下准确进样20uL，绘制色谱峰面积和标准物质量浓度之间的标准曲线，得出回归方程。5.样品及标准品水解5. I样品加酸将I. 5得到的沉淀物转入250mL SCHOTT瓶中，加入12x N mL盐酸(37%)，加超纯水至150mL,振荡混勻。5. 2标准品加酸在2. 2得到的标准品溶液中，加入12mL盐酸(37%)，加超纯水至150mL，振荡混匀。5. 3 水解将SCHOTT瓶放入高压灭菌锅121°C处理60min。水解完成后马上冷却。用40%氢氧化钠，将溶液调PH到6-7，然后定容至250mL。6.色谱检测葡萄糖、半乳糖含量可以采用但不仅限于以下色谱柱及检测器对葡萄糖、半乳糖含量进行分析。I)糖柱色谱柱糖柱(WatersSugar-pak I 6. 5 x 300mm)流速0.5ml/min温度80°C流动相超纯水检测器蒸发光散射检测器或者示差折光检测器2)氨基色谱柱色谱柱氨基柱(WatersSpherisorb Amino (NH2) Cartridge, 5 u m, 3mm X 250mm)流速1.Oml/min温度40°C流动相乙腈/超纯水(80/20 )检测器蒸发光散射检测器
3)离子色谱色谱柱DI0NEXCarboPac PA20Analytical Column (3x150mm)流速0.35ml/min温度30°C流动相18mMNaOH检测器电化学检测器7.结果计算结果计算采用式1-3。
权利要求
1.一种乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法，包括下列步骤 a)样品前处理 i)称样 在50mL高速离心管中称取待测液体样品25. OOOOx N g，其中固体样品5. OOOOx Ng加超纯水至25. OOOOx N g，充分溶解； ii)沉淀 加入5x N mL 20%乙酸锌溶液和5x N mL 10%亚铁氰化钾溶液，充分振荡混合后于5500g离心IOmin,去掉上清液； iii)水洗 沉淀物加15x N mL超纯水，玻璃棒搅匀，用IOx N ml超纯水冲洗玻璃棒，振荡混合均勻后，于5500g离心IOmin,去掉上清液； iv)醇洗 沉淀物加15x N mL 75%乙醇，玻璃棒搅匀，用IOx N mL 75%乙醇冲洗玻璃棒，震荡混合均勻后，于5500g离心IOmin,去掉上清液； V) 二次水洗 沉淀物再加15mL X N超纯水，玻璃棒搅匀，用IOmL x N超纯水冲洗玻璃棒，震荡混合均勻后，于5500g离心IOmin,去掉上清液； b)标准品前处理 i)称样 在 250mL SCHOTT 瓶中称入 O. 0105g (称准至 O. 0002g) Sigma G5011 标准品； )标准品预溶 加入50mL超纯水预溶； c)葡萄糖标准曲线制备 吸取葡萄糖标液l、3、5mL到IOmL容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到葡萄糖为20、·60、100mg/L的混合标样。在色谱条件下准确进样20uL，绘制色谱峰面积和标准物质量浓度之间的标准曲线，得出回归方程； d)半乳糖标准曲线制备 吸取半乳糖标液l、3、5mL到IOmL容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到半乳糖为20、·60、100mg/L的混合标样。在色谱条件下准确进样20uL，绘制色谱峰面积和标准物质量浓度之间的标准曲线，得出回归方程； e)样品及标准品水解 i)样品加酸 将a)中的步骤V)得到的沉淀物转入250mL SCHOTT瓶中，加入12x N mL盐酸(37%)，加超纯水至150mL，振荡混匀； ii)标准品加酸 在b)中的步骤ii)得到的标准品溶液中，加入12mL盐酸(37%)，加超纯水至150mL，振荡混勻； iii)水解 将SCHOTT瓶放入高压灭菌锅121°C处理60min。水解完成后马上冷却，用40%氢氧化钠，将溶液调PH到6-7，然后定容至250mL ； f)在色谱条件下检测葡萄糖、半乳糖含量； g)结果计算 结果计算采用下式^ 人门 (C,,c.,.^, )xvx0.9xF乳品 ^ 11 IitJ 聚糖含-Μ:_Lii-Xi 00% W 葡聚糖标HI品水解率= _論·'X 100% W1^ X 4小/ft IItif1Ii Jll 其中 W :称量的牛奶样品，g ； V :样品水解后定各体积，mL ； :样品水解定容后由HPLC测定得到的葡萄糖含量，g/mL ； c￥ L :样品水解定容后由HPLC测定得到的半乳糖含量，g/mL ； O.9 :葡萄糖换算为葡聚糖的换算因子； F :葡聚糖水解校正因子； :标准品水解定容后由HPLC测定得到的葡萄糖含量，g/mL ； V^ :标准品水解后定容体积，mL ； W标标准品称样质量，g ； 其中，所述N大于O。
2.权利要求I的方法，其中N的范围为O.01-5。
3.权利要求I的方法，其中N的范围为O.1-2。
4.权利要求I的方法，其中N的范围为O.5-1. 2。
5.权利要求I的方法，其中N=I。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述色谱条件为 色谱柱糖柱 流速0. 5ml/min 温度80°C 流动相超纯水 检测器蒸发光散射检测器或者示差折光检测器。
7.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述色谱条件为 色谱柱氨基柱 流速1. Oml/min 温度40°C 流动相乙腈/超纯水，80/20 检测器蒸发光散射检测器。
8.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述色谱条件为色谱柱DIONEX CarboPac PA20Analytical Column, 3x150mm流速0. 35ml/min温度30 dC 流动相18mM NaOH检测器电化学检测器。
全文摘要
本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法，属于化学成分检测的技术领域。本方法按照如下步骤进行检测样品前处理；标准品前处理；葡萄糖标准曲线制备；半乳糖标准曲线制备；样品及标准品水解；色谱检测葡萄糖、半乳糖含量；以葡萄糖、半乳糖标准曲线对水解产品进行定性，以酵母β-葡聚糖标准品水解产物进行定量，即可定量得知被检测的乳制品样品中酵母β-葡聚糖含量。
文档编号G01N30/02GK102809620SQ20121030989
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者陈伟, 杨月珍, 李志伟, 钱文涛, 季国志, 李洪亮, 于景华, 高连胜 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司