专利名称：发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法
发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法技术领域-本发明涉及一种发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法。
背景技术：
紫杉醇类化合物是从红豆杉科红豆杉属植物中分离得到的二瞎类化合物的 总称，其中尤为引人注目的是紫杉醇，其他二萜类化合物一般也具有紫杉醇母 核结构，有些是紫杉醇生物合成的前体物，并且可以人工合成为具有药用价值 的新化合物，紫杉醇能够与细胞微管蛋白结合，阻止微管解聚，有效地控制癌 细胞的快速分裂和增殖，作为一种作用机制独特的抗癌新药，自问世以来一直 受到人们的重视，但由于紫杉醇在天然红豆杉中的含量很低，加上红豆杉资源 有限，因此限制了紫杉醇的进一步开发应用，为了解决这个问题，近些年来科 学家们在寻找及扩大紫杉醇药源途径上进行了大量的工作，其中包括化学合成、 生物技术及利用共生菌发酵生产等，由于微生物发酵法生产紫杉醇具有十分巨 大的经济效益和广阔的开发空间，所以是一种十分有前途的紫杉醇生产方式， 而对微生物发酵法生产紫杉醇研究过程中即涉及紫杉醇类化合物的测定，需要 使用高效液相仪等昂贵设备，使菌种鉴定和含量测定方法复杂，成本较高。

发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单的发酵液中紫杉醇类化合物含量测定方法。、上述的目的通过以下的技术方案实现一种发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法，将发酵产物用乙酸乙 酯萃取，减压蒸干得固形物，用20%甲醇水溶液溶解，经201X4树脂吸附后，用80%甲醇水溶液洗脱；将洗脱液减压蒸干用定量甲醇溶解得供试品溶液；按 照薄层色谱法，定量吸取供试品溶液和紫杉醇对照品，点样于硅胶H薄层板上 进行层析，以氯仿甲醇体积比6: l为展开剂，至薄层板上端l厘米处，取出晾干，用1%香草醛浓硫酸溶液将紫杉醇对照品显色，供试品展层部位盖上，刮取与对照品Rf值相同,位上下0.5厘米处的硅胶，用定量甲醇洗脱，在240mn处
测定其紫外吸光值，由紫杉醇浓度与240nm得到的吸光值之间作得的标准曲线 査出供试样品浓度，根据稀释倍数记算出原发酵液中紫杉醇类化合物的含量。上述的发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法，所述的树脂为201 X4树脂。上述的发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法，所述的薄层色谱方 法展开剂为氯仿与甲醇体积比6: l的氯仿甲醇溶液。上述的发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法，所述的紫外线吸收 波长为240nm。这个技术方案有以下有益效果-1. 本发明方法，涉及的分析试材廉价易得、成本较低，是一种简便、耗时较 少的发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法。2. 本发明方法与髙效液相法相比较成本较低，高效液相法需要至少十几万以 上的设备，保养复杂，操作人员要求素质教高，人员培养时间较长，培养成本 较高，而本发明方法采用薄层法与紫外分光光度法相结合，仅需要万元左右设 备，操作人员能够很容易地掌握操作方法，操作人员要求素质不高，培养成本 较低。3. 本发明方法在每次操作过程中，应用薄层法与紫外分光光度法相结合的方 法测定含量后，样品可以回收不会损失样品，这对于提取复杂而价格贵于黄金 的紫杉醇类药物来讲意义重大，高效液相法操作一年后，为了保证好的柱效和 分析结果，需要更换价格昂贵的髙效液相柱，而薄层法与紫外分光光度法相结 合的方法不需要这样的更换费用。4. 本发明方法，薄层法与紫外分光光度法相结合的测定方法普通实验室即可 满足测定条件，随时随地可以检测，容易普及。本发明的
具体实施例方式
实施例1:发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法，发酵液过滤，菌丝体研磨 破壁称重，以lg菌丝体加5ml乙酸乙酯(V/W)比例进行萃取，澄清滤液用同 等液体体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，50'C减压蒸干得固形 物，用2亳升甲醇洗涤减压干燥的固体，O"C密封保存或测定。取适量硅胶G用 水调匀，涂布于20cm长的玻璃板上晾干，105T:活化30分钟后备用。按照薄层 色谱法，定量吸取20微升供试品溶液和5微升紫杉醇对照品，点样于硅胶H薄 层板上进行层析，以氯仿甲醇体积比6: l为展开剂，至薄层板上端l厘米处， 取出晾干，用1。/。香草醛浓硫酸溶液将紫杉醇对照品显色，而供试品展层部位盖 上，防止被显色剂破坏，刮取与对照品Rf值相同部位上下O.S厘米处的硅胶， 用2毫升甲醇洗脱，过滤得上清液，在240nm处测定其紫外吸光值，根据紫杉 醇浓度与240nm得到的吸光值之间作得的标准曲线查出供试样品浓度，根据稀 释倍数记算出原发酵液中紫杉醇类化合物的浓度。 实施例2:实施例1所述的发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法，所述的树 脂为201X4树脂。 实施例3:实施例1或2所述的发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法，所述 的薄层色谱方法展开剂为氯仿与甲醇体积比6: 1的氯仿甲醇溶液。 实施例4:实施例1所述的发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法，所述的紫 外线吸收波长为240nm。
权利要求
1.一种发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法，其特征是将发酵产物用乙酸乙酯萃取，减压蒸干得固形物，用20％甲醇水溶液溶解，经201×4树脂吸附后，用80％甲醇水溶液洗脱；将洗脱液减压蒸干用定量甲醇溶解得供试品溶液；按照薄层色谱法，定量吸取供试品溶液和紫杉醇对照品，点样于硅胶H薄层板上进行层析，以氯仿甲醇体积比6∶1为展开剂，至薄层板上端1厘米处，取出晾干，用1％香草醛浓硫酸溶液将紫杉醇对照品显色，供试品展层部位盖上，刮取与对照品Rf值相同部位上下0.5厘米处的硅胶，用定量甲醇洗脱，在240nm处测定其紫外吸光值，由紫杉醇浓度与240nm得到的吸光值之间作得的标准曲线查出供试样品浓度，根据稀释倍数记算出原发酵液中紫杉醇类化合物的含量。
2. 根据权利要求1所述的发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法，其 特征是所述的树脂为201X4树脂。
3. 根据权利要求1或2所述的发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方 法，其特征是所述的薄层色谱方法展开剂为氯仿与甲醇体积比6: l的氯仿甲醇溶液。
4. 根据权利要求1所述的发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法，其 特征是所述的紫外线吸收波长为240nm。
全文摘要
发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法。现有技术中对微生物发酵法生产紫杉醇研究过程中即涉及紫杉醇类化合物的测定，需要使用高效液相仪等昂贵设备，使菌种鉴定和含量测定方法复杂，成本较高，因此需要一种发酵液中紫杉醇类化合物含量的简易测定方法，将发酵产物用乙酸乙酯萃取，减压蒸干得固形物，利用树脂吸附去杂质、薄层层析结合紫外分光光度法，由紫杉醇浓度与240nm得到的吸光值之间作得的标准曲线查出供试样品浓度，根据稀释倍数记算出原发酵液中紫杉醇类化合物的含量。本发明方法适用于发酵液中 紫杉醇类化合物含量的测定。
文档编号G01N1/28GK101113976SQ200610010330
公开日2008年1月30日 申请日期2006年7月27日 优先权日2006年7月27日
发明者涛 金 申请人:黑龙江大学