专利名称：用于受体激动剂激活的功能性分析的制作方法
背景技术：
本发明涉及一种新的用于激动剂-激活的受体的高通量功能性分析。
本发明的新分析可用于筛选对神经受体激活相关的失调的治疗有效的化合物，所述受体包括α2A、H1、5HT1A、5HT2A、D2和D3受体。调节这些受体功能的分子为多种精神疾病的潜在治疗药物。尽管配体结合分析已经用于这些分子的发现，测定受体配体的功能性分析通常能够提供更多的信息。用于这些受体激活的高通量功能性分析法的开发目前仍存在问题。
本发明的分析方法使用升高的温度以及Fluorometric Imaging PlateReader(FLIPR384)用于测量这些受体的激动剂激活。例如，本发明涉及一种用于D3多巴胺受体，一种G蛋白-偶联受体(GPCR)的改良的分析方法，其激活G-蛋白的G/Go亚型，并优选地在边缘区例如隔膜区和扁桃体结构处表达，并被认为对认知、动机形成和情绪的调节很重要。与其他受体一样可通过本发明的方法进行分析的D3受体，显示出偶联数个信号通路包括环AMP的产生、有丝分裂发生以及c-fos表达。对这些信号的分析已经用来判断这些受体配体的作用；但是，这些分析的通量方面依然受到限制。利用混杂和嵌合的G蛋白以及Fluorometric Imaging Plate Reader Systems(FLIPR)可以开发出一种单一功能性分析平台，可用来测量受体的激活。因此本发明提供了一种新型的通用的适用于受体的功能性分析，所述受体包括D3受体，利用稳定表达特定受体以及混杂G蛋白的细胞系，例如HEK293-Gα15细胞系以FLIPR384测量体系以判断所述配体的功能性。与在先的FLIPR方法不同的是，本发明提供的分析方法基于温度-依赖性激动剂-诱导的受体激活，并提供了比现有分析方法显著提高的信号。
发明概述因此，本发明提供了一种分析方法，用于测定G-蛋白连接受体例如神经受体的激动剂化合物的激活，所述的方法使用Fluorometric Imaging PlateReader，该方法包括
(a)得到一种具有至少一种合适的筛选因子的细胞系，所述筛选因子选自药物抗性标记物，选自HEK293-Gα15，所述的细胞系稳定表达选自Gα15的混杂G蛋白，并在将编码选择的G-连接受体的cDNA转染到所述的细胞系中后，在所述的细胞系中共表达所述的G-蛋白连接的受体；(b)将共表达的细胞在合适的培养基中生长；(c)将所述的细胞铺板约1天；(d)使铺板的细胞荷载适合所述目的量的荧光染料；(e)将荷载染料的细胞在从约室温到约37℃的温度范围培养约1小时；(f)用合适的缓冲液洗板以除去过量的染料并用近似体积的新鲜缓冲液替换去除的缓冲液体积；(g)在约30℃～约37℃培养；(h)在从约30℃～约37℃的恒定温度条件加入激动剂；并且(i)在从约30℃～约37℃的恒定温度条件在Fluorometric Imaging PlateReader中测定荧光发射，从而判断激动剂化合物对所选受体的激活水平。
在本发明的一个实施方案中，G-蛋白连接受体为多巴胺或组胺受体。在另一个实施方案中，G-蛋白连接受体选自D2、D3、α1A、α2A、M1、H1、5HT1A以及5HT2A受体。在另一个特别的实施方案中，所述的G-蛋白连接受体为多巴胺D3受体。
在另一个本发明的实施方案中，选自药物抗性标记物的筛选因子为嘌呤霉素(puromycin)-抗性标记物。在另一个本发明的实施方案中，选自药物的抗性标记物的筛选因子为杀稻瘟素(blastocidin)-抗性标记物。
用于实现本发明的方法的优选荧光染料为Fluo-3TM或Fluo-4TM。优选地，铺板的细胞密度为约12,000～约30,000细胞/平方厘米。
在另一个本发明的实施方案中，培养步骤(g)进行约15分钟～约60分钟。优选地，所述的培养步骤(g)进行约30分钟。
附图简述

图1显示了温度对多巴胺D3受体的激动剂-依赖性激活的影响。
图2显示了GR218231，一种D3-特异拮抗剂在37℃和25℃(插图)对多巴胺-依赖性细胞内钙释放的拮抗作用。用FLIPR监测多巴胺-诱导的从细胞内储存的Ca2+释放。
图3显示[5S]-GTPγS结合分析测量的D3受体-介导的G蛋白激活的激动剂的刺激作用。该实验在25℃、30℃以及37℃下进行，如标明所示。显示了在各温度下的受体密度(Bmax)。
图4显示了温度对组胺H1、5HT1A、5HT2A、多巴胺D2、α-肾上腺素能1A、α-肾上腺素能2A以及毒蕈碱M1受体的激动剂-依赖的激活的影响，如用FLIPR测定。显示了37℃和25℃的测定结果。
发明详述正如附图中所显示，本发明提供了一种分析方法，其使用稳定表达所述受体和混杂G蛋白G＜15的细胞系或者替代性地，使用存在细胞中的G蛋白亚基。利用Fluorometric Imaging Plate Reader监测激动剂-诱导的细胞内Ca2+释放。与在先基于FLIPR分析方法在25℃进行分析不同的是，通过在升高的温度优选地在37℃进行分析，激动剂-诱导的反应的强度显著地提高。尽管FLIPR分析测定的激动剂激活的EC50高于其他功能性受体分析的EC50值，表征拮抗剂的抑制作用的功能性Ki类似。在[35S]GTP|S结合分析中，其为另一种功能性分析，受体的激动剂-诱导的激活作用在升高的温度的时候也提高。升高的温度不影响本发明方法使用的受体的Bmax，也不影响受体-表达细胞中由离子载运体以及内源性嘌呤能受体诱导的细胞内Ca2+释放。
可以激活特定受体的药理有用化合物可通过利用本发明的分析方法而发现。在用本分析方法筛选的化合物的药理作用为，例如，人体中的焦虑症状、抑郁以及其他精神病症的改善，这些药理作用可通过这些化合物激活多巴胺受体的能力识别出来。
本发明参照下列实施例进行说明，但不限于这些实施例。
实施例利用FLIPR384进行的HEK细胞D3方案细胞系的描述稳定表达Gα15的HEK293-Gα15.D3细胞系，其通过将D3 cDNA转染到表达G-α的HEK293细胞系中而得到。D3受体的表达在筛选因子如嘌呤霉素和杀稻瘟素的存在下得到保持。该细胞系对典型的组织培养瓶附着较差。为了得到强的附着表型，将细胞在Matrigel(Becton Dickinson，用无血清的DMEM按1∶200稀释)-包被的培养瓶中生长。
将细胞按照如下的步骤进行荷载(a)将20,000细胞以50μl/孔在384孔板中进行铺板，或在96孔板中以每孔60,000细胞进行铺板，多孔板包被聚D赖氨酸。将板返回到37℃培养箱中。
(b)16-24小时后去除生长培养基，然后用无血清培养基在钙敏荧光染料，fluo-4(4pM)以及活性转运抑制剂丙磺舒(2.5mM)存在下替换生长培养基。
(c)将板在37℃培养1小时。
(d)吸出培养基并用缓冲液洗板(3次，用包含2.5mM的丙磺舒的HEPES-缓冲盐)以去除过量的染料。
(e)将板在37℃培养15-45分钟。
(f)将要用药物荷载的板在37℃培养箱中预热15分钟。
(g)在FLIPR中进行分析并连续90秒钟监测荧光水平。
在基线记录20秒后，同时向所有的96或384孔中加入激动剂/拮抗剂(15ul体积)。拮抗剂预处理15分钟。
方法FLIPR分析将稳定表达D3受体的HEK293-Gα15细胞系用来发展基于Ca2+的分析，利用基于FLIPR的方法。在分析前，将细胞在96或384孔聚-D赖氨酸-包被的FLIPR板中铺板16-24小时。将细胞在细胞染料-培养基溶液(培养基-11ml，染料-4μM Fluo-4AM，Pluronic acid 22μl，丙磺舒-110μl的260mM溶液)在37℃荷载1小时。将板在Skatron EmblaTM板清洗机中用分析缓冲液(NaCl-0.145M，葡萄糖-0.01M，KCl-0.005M，MgSO4-0.001M，HEPES-0.01M和CaCl2-0.002M)洗涤，并分别在开始实验前在25℃和37℃稳定30分钟。在加入激动剂前15分钟加入拮抗剂。分别用488nm和520nm的激发和发射波长测定荧光强度。数据记录为四次重复的平均值±S.D.。
GTPγS结合分析将表达人D3受体的CHO细胞在T175培养瓶中用包含DMEM和10％胎牛血清的培养基培养。利用20mM Hepes/10mM EDTA并用221/2号针头进行破坏使细胞与培养瓶分离。在40,000×g离心后，将膜重新悬浮在20mMHepes/0.1mM EDTA中并再离心。将膜再悬浮于分析缓冲液(20mMHepes，100mM NaCl，10mM MgCl2)并在冰上与1μM GDP培养10分钟。将受试化合物按照下述方案进行分析将膜和受试化合物在25℃、30℃和37℃预孵育20分钟，然后在冰上孵育15分钟。在一些孔中加入10μM GTPγS以确定非特异性结合。为了启动反应，加入[35S]-GTPγS，终浓度为0.1nM。将分析板在25℃、30℃和37℃孵育30分钟。然后向分析孔中加入小麦-胚芽凝集素(WGA)SPA珠(1mg/孔)，并将分析板在平台摇床上室温振荡30分钟。然后将板在桌面离心机中离心5分钟并在Wallac Microbeta计数器中测量。数据记录为四次重复实验结果的平均值±S.D.。
用于D3 FLIPR分析的分析缓冲液Hepes盐缓冲液 用于配制化合物稀释液以及洗板液，并包含″Buffr，M″NaCl 0.145葡萄糖0.01KCl 0.005MgSO40.001HEPES 0.01Ca(anhyd) 0.002丙磺舒溶液(260mM)丙磺舒0.74g5N NaOH 1mlHepes盐缓冲液 9ml″Fluo-3或Fluo-4，AM Dye″通过将50μg小瓶的样品溶解在22μl DMSO中而进行配制。
Cell培养基溶液细胞与该溶液一起培养以荷载染料无血清DMEM 11ml染料溶液 0.022ml20％Pluronic acid 0.022ml丙磺舒溶液 0.110ml
放射配体结合分析将表达D3受体的CHO细胞进行匀浆，使用Poltron在20ml的分析缓冲液(50mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl，2mM CaCl2，5Mm MgCl2pH7.4)中进行。将匀浆液在20,000RPM 4℃离心10分钟，两次。将沉淀再悬浮于分析缓冲液中，浓度为5.0mg/ml。用多种浓度的[3H]7-OH-DPAT、终体积为250μl建立Scatchard分析。将板在25℃孵育60分钟、在30℃孵育30分钟以及37℃孵育15分钟。将反应通过快速过滤而终止，通过GF/B滤器(预先在0.5％PEI浸没2小时并干燥)，在Skatron捕集器中使用冰冷的pH7.4的50mM Tris缓冲液。将滤器在Beta计数器中使用Betaplate Scint进行测量。
结果D3激动剂-刺激的细胞内Ca2+反应是温度-敏感的FLIPR分析图1显示了从稳定表达D3受体的HEK293-Gα15细胞系的激动剂-刺激的细胞内Ca2+释放。该分析在标明浓度的多巴胺和7-OH-DPAT存在下进行，并且激动剂诱导的Ca2+释放用FLIPR进行测定。
与25℃相比，在37℃荧光信号存在显著的温度-依赖性增加。由于7-OH-DPAT是选择性的D3激动剂，因此激动剂-介导的反应是D3受体-特异性的。该分析快速、可重复并且灵敏，因此可用于检测D3激动剂的高通量筛选。
图2显示了一种D3特异性拮抗剂GR218231对多巴胺-诱导的Ca2+释放的影响，利用FLIPR监测。稳定表达D3受体的HEK293-Gα15细胞系与标明浓度的GR218231预先孵育15分钟，然后在37℃和25℃(插图)加入100nM多巴胺。多巴胺-诱导的FLIPR反应是D3-介导的。在两个温度下都观测到类似的功能性IC50值，暗示升高的温度不影响拮抗剂结合。GR218231的功能性Ki值与发表的数值类似，暗示该分析可用来测定D3拮抗剂的功能性Ki。
D3受体激动剂的G-蛋白激活[35S]-GTPγS结合分析图3显示了D3受体激动剂-介导的激活的温度-依赖性效果，也在[35S]-GTPγS分析中观测到，后者为另一种D3功能性分析。结合到G-蛋白的[35S]-GTPγS量为激动剂激活的量度。在插入表部分，将各温度的D3结合位点的Bmax制成了表格。与FLIPR中观察到的结果类似，在升高的温度的时候，观察到的激动剂-诱导的信号较高，尽管效果不太显著。升高的温度看起来不影响膜制剂中D3的Bmax。
激动剂EC50和拮抗剂功能性Ki的总结表1显示了在多个温度下用FLIPR和[35S]-GTPγS分析测定的激动剂和拮抗剂数值的比较。与GTP|S分析相比，在FLIPR分析中的多巴胺的EC50有10倍的增加，其可能是所用的两种不同细胞系的缘故。用于GTP|S分析的CHO-D3细胞系利用了内源性G蛋白，而用于FLIPR分析的HEK293细胞系利用Gα15。用两种分析方法测定的拮抗剂的功能性Ki数值类似，暗示FLIPR分析可用来测定D3拮抗剂的功能性Ki。
表1在FLIPR和GTPγS分析中的激动剂和拮抗剂药理活性
在许多GPCR中观察到温度-依赖性细胞内钙释放。
表2显示了细胞内Ca2+释放，用FLIPR分析方法在D3-Gα15细胞中测量得到。使用了为或高于EC90的浓度多巴胺(100nM)、ATP(12.5mM)、离子霉素(10mM)。显示了在37℃分别预孵育5分钟和15分钟的FLIPR信号的上升值(以百分比的形式)。
表2温度对其他激动剂诱导的Ca2+反应的影响
尽管在升高的温度下，存在D3激动剂导致的激动剂反应的升高，ATP(通过内源性嘌呤能受体)以及离子霉素(离子载体)诱导的反应不受延长的37℃预孵育影响。上述结果显示G蛋白-偶联受体(GPCRs)的温度-依赖性激活只在D3观察到，对嘌呤能受体而言没有观察到，并且Ca2+的细胞内释放不受升高的温度所影响。不受理论的局限，提高的激动剂反应可能与D3受体偶联到G蛋白有关，并延伸为许多GPCRs激活的一般性机制。
图4显示了在FLIPR中多种GPCRs的激动剂-依赖性激活α-肾上腺素能1A、α-肾上腺素能2A、组胺H1、5HT1A、5HT2A、多巴胺D2和毒蕈碱M1。在GPCRs的该亚集中，这些GPCRs大多数(＞70％)的激动剂-依赖性反应的强度在升高的温度时候会增加。所有这些受体通过存在细胞(Gq或Gi)中的G蛋白亚基激活细胞内Ca2+的释放。这些数据提供了证据，表明对许多GPCRs可以观察到上述现象，在升高的温度的分析性能将能更好地检测激动剂-依赖性反应。
因此本发明提供了一种基于FLIPR、新型、快速并且可重复的多种受体功能性分析。证实测定细胞内钙释放(FLIPR)和GPCR激活((GTP|S结合)的功能性分析，与25℃相比，在37℃有增加的信号。用两种功能性分析得到的拮抗剂的功能性Ki数值不受升高的温度的影响。
权利要求
1.一种测定G-蛋白连接受体激动剂激活的分析方法，所述的方法使用Fluorometric Imaging Plate Reader，所述方法包括(a)得到一种具有至少一种合适的筛选因子的细胞系，所述筛选因子选自药物抗性标记物，选自HEK293-Gα15，所述的细胞系稳定表达选自Gα15的混杂G蛋白，并在将编码选择的G-连接受体的cDNA转染到所述的细胞系中后，在所述的细胞系中共表达所述的G-连接的受体；(b)将共表达的细胞在合适的培养基中生长；(c)将所述的细胞铺板约1天；(d)使铺板的细胞荷载适合所述目的量的荧光染料；(e)将荷载染料的细胞在从约室温到约37℃的温度范围培养合适的一段时间；(f)用合适的缓冲液洗板以除去过量的染料并用近似体积的新鲜缓冲液替换去除的缓冲液体积；(g)在约30℃～约37℃培养；(h)在从约30℃～约37℃的恒定温度条件加入激动剂；并且(i)在从约30℃～约37℃的恒定温度条件在Fluorometric Imaging PlateReader中测定荧光发射，从而判断激动剂化合物对所选受体的激活水平。
2.权利要求1的方法，其中所述的G-蛋白连接受体为多巴胺或组胺受体。
3.权利要求1的方法，其中所述的G-蛋白连接受体选自D2、D3、α1A、α2A、M1、H1、5HT1A和5HT2A受体。
4.权利要求1的方法，其中所述的G-蛋白连接受体为多巴胺D3受体。
5.权利要求1的方法，其中所述的选自药物抗性标记物的筛选因子为嘌呤霉素-抗性标记物。
6.权利要求1的方法，其中所述的选自药物抗性标记物的筛选因子为杀稻瘟素-抗性标记物。
7.权利要求1的方法，其中所述的荧光染料为Fluo-3TM或Fluo-4TM。
8.权利要求1的方法，其中铺板细胞的密度为约12,000～约30,000细胞/平方厘米。
9.权利要求1的方法，其中所述的培养步骤(e)进行约1小时。
10.权利要求1的方法，其中所述的培养步骤(g)进行约15分钟～约60分钟。
11.权利要求1的方法，其中所述的培养步骤(g)进行约30分钟。
全文摘要
本发明提供一种新的用于激动剂激活受体的高通量功能分析，所述受体包括α1A、α2A、H1、5HT1A、5HT2A、D2和D3受体。本发明的分析方法使用提高的温度以及稳定表达所述受体和混杂G蛋白G1S的细胞系，其中用Fluorometric Imaging Plate Reader(FLIPR)监测激动剂－诱导的细胞内Ca
文档编号G01N33/68GK1774630SQ02826850
公开日2006年5月17日 申请日期2002年10月30日 优先权日2001年11月9日
发明者王国风, 阿尔卡·V·施里克汉德 申请人:辉瑞产品公司